2.4.1 Cơ sở lý thuyết
Lý thuyết quá trình lên men đã được nhiều nhà sinh học nghiên cứu từ rất lâu.
Năm 1769, Lavoisier phân tích sản phẩm lên men rượu và nhận thấy khi lên men, đường không chỉ tạo thành ethanol và CO2 mà còn tạo ra acid acetic.
Năm 1810, Gay-Lussac nhận thấy rằng cứ 45 phần khối lượng đường sẽ chuyển thành 23 phần ethanol và 22 phần khí carbonic. Trên cơ sở đó ông đưa ra phương trình tổng quát như sau:
C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Q
Năm 1857, Louis Pasteur tiếp tục nghiên cứu và thu nhận kết quả sau: cứ 100 phần đường saccharose khi lên men sẽ tạo ra 51.1 phần ethanol, 48.4 phần CO2, 32.0 phần glycerin, 0.7 phần acid succinic và hai phần các sản phẩm khác. Từ đó suy ra cứ 45 phần khối lượng glucose khi lên men sẽ tạo ra 21.8 phần ethanol chứ không phải 23 phần như Gay-Lussac đã tính. Tuy nhiên phương trình lên men do Gay-Lussac đưa ra vẫn đúng và dùng làm cơ sở lý thuyết để tính hiệu suất thu hồi rượu theo lý thuyết.
Gay-Lussac còn kết luận sự lên men là quá trình sinh học có liên hệ mật thiết đến sự hoạt động của tế bào nấm men.
Vào khoảng 1871-1872 Manaxemi đem nghiền tế bào nấm men với cát thạch anh rồi mới cho vào lên men dịch đường thì hiện tượng lên men vẫn xảy ra.Năm 1879, Buchuer tiến hành nghiền nát tế bào nấm men rồi chiết lấy dịch trong không chứa xác nấm men rồi cho vào dịch đường thì thấy dịch chiết vẫn có khả năng lên men. Từ đó người ta gọi các chất trong dịch tế bào nấm men là zymase. Đây chính là hợp chất của nhiều enzyme cùng tham gia chuyển hóa đường thành ethanol và khí carbonic.
Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử. Quá trình oxy hóa này lại xảy ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme, cho nên người ta gọi quá trình lên men là quá trình oxy hóa sinh học.
Sự tạo thành rượu từ glucose phải trải qua nhiều giai đoạn, sơ đồ hình thành rượu từ glucose được biễu diễn ở hình bên dưới:
Hình 2.8: Quá trình đường phân (Nguồn: www.scientificpsychic.com)
2.4.2 Tổng quan về vi khuẩn Zymomonas Mobilis 2.4.2.1 Một số nguồn phân lập Z. mobilis
Bảng 2.4: Một số nguồn phân lập vi khuẩn Zymomonas Mobilis
Nguồn phân lập Môi trường Điều kiện, kết quả Người thực hiện Hèm bia Thạch gelatin Xuất hiện khuẩn lạc sauu
11 ngày ở 220C
Barer và Hillic năm 1912 Bia tiệt trùng Thạch Agar ( 2%
glucose)
Yếm khí Shimwell 1937
Dịch nước táo Môi trường lỏng (1% chất chiết men, 0,001%
actidione
Yếm khí, pH= 4,5 ở 250C Millis, 1951 -1956
Rượu vang cọ Zairese
3 canh trường chứa dịch chiết nấm men khác nhau
Khuẩn lạc sau 4 – 5 ngày ở 300C có dạng hình hạt đậu, đường kính từ 1 – 4mm, màu xanh sậm
Swings và Deley 1974
(Nguồn: http://doan.edu.vn/do-an/de-tai-len-men-ethanol-voi-vi-khuan-zymomonas- mobilis-25524)
2.4.2.2 Đặc điểm nhận dạng
• Là một loại vi khuẩn gram õm, cú roi dài từ 1 – 1,4àm
• Không hình thành bào tử
• Một số loài có từ 1 – 4 tiêm mao.
• Không phát triển trên môi trường thạch hoặc nước thịt dinh dưỡng.
• Là loài vi khuẩn vi hiếu khí ( kỵ khí không bắt buộc).
• Có thể lên men đường glucose và fructose.
• Tạo ra số mol ethanol và CO2 bằng nhau.
• Chứa khoảng 47,5 – 49,5 guanine và cytosine. (G + C) 2.4.2.3 Danh pháp
• Giống: Zymomonas
• Loài: Zymomonas mobilis
• Loài phụ: Zymomonas mobilis subsp, mobilis
• Loài phụ: Zymomonas mobilis subsp, pomaceae 2.4.2.4 Thành phần tế bào
Bảng 1Bảng 2Bảng 2.5: Thành phần của tế bào vi khuẩn Zymomonas Mobilis Thành phần Hàm lượng ( theo khối lượng chất khô)
Protein: Pha ổn định 54%
AND 17 – 22%
ARN 2,7%
Cacbohydrat 4 – 5%
Lưu huỳnh 0,5%
NH3 0,1 – 0,5 àmol/mg
Acid amin 0,02 – 0,2 àmol/mg
ATP: Pha logarit 1 - 5àmol/mg
ATP :Trong điều kiện thiếu thức ăn – 0,1 àg/mg
( Nguồn: http://doan.edu.vn/do-an/de-tai-len-men-ethanol-voi-vi-khuan-zymomonas- mobilis-25524)
2.4.2.5 Điều kiện sinh trưởng
• pH=3,5 – 7,5
• Nhiệt độ: 25 – 300C
• Nồng độ ethanol là 5,5%
• Nồng độ glucose là 20%
• Nồng độ NaCL 1%
• Rất nhạy cma3 với thuốc nhuộm ( Brilliant areen…)
2.4.2.6 Cơ chế chuyển hóa đường thành ethanol bởi Zymomonas mobilis.
Cơ chế lên men chính của vi khuẩn Zymomonas từ nguồn cơ chất glucose và fructose là con đường Entner – Doudoroff.
Hình 2.9: Con đường Entner – Doudoroff
(http://doan.edu.vn/do-an/de-tai-len-men-ethanol-voi-vi-khuan-zymomonas-mobilis) Do đó cân bằng chung của con đường KDPG là:
Hình 2.10: Cân bằng chung của con đường KDPG
( Nguồn: http://doan.edu.vn/do-an/de-tai-len-men-ethanol-voi-vi-khuan-zymomonas- mobilis-25524)
Các enzyme của con đường Entner – Doudoroff có thể kháng cự tốt hơn với ethanol nên Z. mobilis có thể nhanh chóng hấp thu glucose và sản xuất ethanol nhiều hơn 15% w/v.
Màng tế bào của Z. mobilis có chứa nhiều loại acid béo giúp nó chịu được nồng độ ethanol cao.
2.4.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
• Nồng độ đường ban đầu
Hệu suất lên men cực đại ứng với 15% (w/v) nồng độ đường ban đầu.
Gia tăng nồng độ đường ban đầu từ 15 – 20% sẽ lam 2giam3 hiệu suất lên men.
Với 25% (w/v) tất cả các chủng đều giảm khả năng hấp thụ cơ chất và lên men ethanol.
• Cơ chất
Bảng 3Bảng 4Bảng 2.6: Glucose và fructose
Thông số Glucose Fructose
Tốc độ hấp thụ đường riêng cực đại ( g đường/g tế bào.giờ)
8,5 2,1
Tốc độ sản xuất ethanol riêng cực đại ( g ethanol/g tế bào.giờ
4,1 1,0
Hiệu suất sinh trưởng trung bình ( g sinh khối tế bào/g đường)
0,055 0.034
Giá trị hiệu suất ATP ( g sinh khối tế bào/mol ATP)
9,9 5,1
(http://doan.edu.vn/do-an/de-tai-len-men-ethanol-voi-vi-khuan-zymomonas-mobilis- 25524)
• pH ban đầu
Hiệu suất lên men đạt cực đại tại pH=7 và thấp nhất ở pH=4, chứng tỏ nếu gia tăng pH ban đầu thì sự hấp thu cơ chất và hiệu suất lên men cũng tăng. Do đó pH tối ưu cho sự lên men là ethanol với Z.mobilis được chọn là 7.
• Nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là 300C.
Khi nhiệt độ của môi trường lên men tăng từ 30 – 360C ( nồng độ glucose không đổi trong hỗn hợp nhập liệu) thì nồng độ sinh khối giảm và tốc độ hấp thu glucose tăng dần.
Khi tăng nhiệt độ khoảng 2 – 30C, hiệu suất chuyển hóa glucose tăng từ 82% đến 90%.
Tuy nhiên, nhiệt độ cao quá mức sẽ có nhiều glucose taht61 thaot1 trong canh trường, hiệu suất chuyển hóa giảm còn 65%.
• Nồng độ ethanol ban đầu
Nếu có ethanol ban đầu trong môi trường dinh dưỡng thì sẽ làm giảm sản xuất sinh khối, hấp thu cơ chất, sản xuất ethanol ethanol, hiệu suất và hệ số chuyển hóa đường.
Cụ thể: Với môi trường là sucrose có 2,5% ethanol ban đầu thì hiệu suất
eyhanol giảm 48,8%, hiệu suất sinh khối giảm 25%, va 2tong63 lượng đường hấp thụ giảm 28,3%.
Với môi trường là glucose có 3% ethanol ban đầu thì hấp thu đường giảm 60 – 65% ( Moreau và cộng sự, 1997).
Ở nồng độ ethanol rất cao (20%, wt/vol), sự lên men bị kiềm hãm hoàn toàn.
Thêm ethanol vào quá trình lên men sẽ ức chế khả năng lên men của tế bào Z.mobilis.
2.4.2.8 Một số ưu điểm của Z. mobilis là:
• Là một chủng vi sinh vật có khả năng lên men tự nhiên
• Tạo ra ít sinh khối tế bào
• Không cần cung cấp oxy
• Có thể kháng cự với các chất kiềm hãm có trong sản phẩm thủy phân
• Lên men ở pH thấp.
• Có thể sinh trưởng ở nồng độ glucose cao.
• Tạo ra sản lượng ethanol cao từ glucose ( 95 – 98% hoặc 0,49 – 5,00 g/g)
• Khả năng chịu được nồng dộ ethanol (13% ethanol từ 30% glucose).
• Hiệu suất sna3 xuất riêng cao (2-6 g rhanol/ g chất khô.giờ)
• Tốc độ hấp thụ đường glucose cao ( có thể lên đến 10g glucose g/g chất khô.giờ)
2.4.2.9 Nhược điểm
Giới hạn cơ chất hẹp, không có khả năng chuyển hóa các polysaccharide phức tạp như: cellulose, hemicelluloses và tinh bột thành ethanol).
Tạo ra một số sản phẩm phụ như: sorbitol, acetoin, glycerol và acid acetic hình thành một loại polymer levan ngoại bào.