Ảnh hưởng của axit butyric đến khả năng chuyển hóa glycerol của bùn hoạt tính
Để nghiên cứu ảnh hưởng của axit butyric đến khả năng chuyển hóa glycerol của bùn hoạt tính, hai môi trường lên men yếm khí được tiến hành song song với cùng các điều kiện ở 37°C, nồng độ glycerol thô đƣợc tăng lên từ 5 - 25g/L. Thời gian lên men cho từng mẻ khoảng từ 7- 10 ngày, trong đó một môi trường có bổ sung axit butyric và một môi trường không có axit butyric.
Kết quả cho thấy ở các canh trường lên men có và không có axit butyric, ở các nồng độ glycerol thô tăng từ 5g/l đến 25 g/l, phổ sản phẩm là nhƣ nhau về thành phần, bao gồm: ethanol, buthanol, 1,3 PDO, butyric, acetic và isobutyric, trong đó 1,3 PDO là sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men và thu đƣợc lớn nhất ở là khoảng 0,44g/g glycerol tiêu thụ, trong một số mẻ lên men thì 1,3-propanediol là sản phẩm duy nhất còn lại ở cuối giai đoạn lên men (hình III.1).
Ở nồng độ 5g/l glycerol thô thì ở cả hai môi trường có và không có axit butyric thì chỉ thu đƣợc ethanol (0,07± 0,01 g/g glycerol tiêu thụ) ở cuối quá trình lên men mà không sản xuất butanol. (Hình III.1a)
Mặc dù một lƣợng nhỏ butanol đƣợc sản xuất trong quá trình lên men và tăng lên cùng với sự tăng nồng độ của glycerol thô từ 10g/l đến 25 g/l nhƣng có thể nhận thấy sự khác biệt lượng butanol sinh ra trong hai điều kiện môi trường có và không có axit butyric. Ví dụ như ở nồng độ 10g/l glycerol thô, trong môi trường có và không bổ sung axit butyric, sản lượng tối đa butanol thu được tương ứng là 0,06 g/g và 0,01 g/g, 1,3 PDO tương ứng thu được là 0,4 g/g và 0,41 g/g (Hình III.1b). Trong khi đó ở nồng độ 25g/l glycerol thô, sản lƣợng tối đa butanol thu đƣợc trong môi trường có và không bổ sung axit butyric tăng lên, tương ứng là 0,15 g/g và 0,03 g/g, sản lƣợng 1,3 PDO gần nhƣ không thay đổi, dao động ở 0,4 g/g ở cả hai canh
trường (Hình III.1e). Ở canh trường không bổ sung axit butyric, glycerol thô 5-25 g/l chuyển đổi thành axit butyric sinh ra ở cuối giai đoạn lên men là khoảng 0,2 g/g glycerol , cùng với một lƣợng nhỏ axit acetic, kho ảng 0,1 g/g glycerol và iso-butyric là 0,07 g/g glycerol. Ở canh trường được bổ sung axit butyric thì lượng axit acetic và iso- butyric thu được thấp hơn, tương ứng là 0,07 g/g và 0,05 g/g glycerol
a.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
g/g glycerol
Ethanol Butanol 1,3 PDO Acetate Iso- butyrate
n-butyrate
5 g/l
môi trường có axit butyric môi trường không có axit butyric
b.
c
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
g/g glycerol
Ethanol 1,3
PDO Iso- butyric
15 g/l
môi t rường có axit butyric môi t rường không có axit butyric
7
d.
e.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
g/g glycerol
Ethanol Butanol 1,3 PDO Acetic Iso- butyric
n- butyric
25 g/l
môi trường có axit butyric môi trường không có axit butyric
Hình III.1. Sản phẩm lên men thu nhận khi chuyển hóa 5-25g/l glycerol thô chuyển hóa nhờ hệ bùn (g/g).
Từ kết quả thu được, có thể nhận thấy sự ảnh hưởng của việc bổ sung axit butyric ban đầu vào môi trường lên men không rõ lên 1,3 PDO nhưng có ý nghĩa đến sự tạo thành butanol trong quá trình lên men gián đoạn của bùn hoạt tính.
Dựa vào các kết quả quan sát được, môi trường lên men cho các thí nghiệm tiếp theo đều đƣợc bổ sung 4g/l axit butyric.
Ảnh hưởng của nồng độ glycerol đến khả năng chuyển hóa glycerol của bùn hoạt tính
Ảnh hưởng của nồng độ glycerol tới khả năng chuyển hóa chúng bởi hệ bùn được kiểm tra khi cho nồng độ glycerol thô trong dịch lên men (môi trường đưa ra mục II.1) thay đổi trong khoảng 5-25g/l.
Kết quả thu đƣợc chỉ ra rằng glycerol thô có thể đƣợc chuyển đổi hoàn toàn bằng hỗn hợp các vi khuẩn có trong bùn lên đến nồng độ 25g/l với thời gian kho ảng 6 ngày.
0 5 10 15 20 25
0 50 100 150 200 250
Thời gian (h)
Nồng độ glycerol thô (g/l)
Hình III.2. Thời gian c ần thiết chuyển hóa 25 g/l glycerol thô bằng hệ bùn hoạt tính
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
g/g glycerol thô
5 g/l 10 g/l 15g/l 20g/l 25g/l
Ethanol Butanol 1,3 PDO
Hình III.3. P hổ sản phẩm chuyển hóa glycerol trong đi ều kiện lên men gián đoạn với nồng độ glycerol 5- 25g/l
Từ các kết quả thu được có thể nhận thấy một sự ảnh hưởng nhỏ của nồng độ glycerol với lƣợng sản phẩm sinh ra: Khi nồng độ glycerol tăng lên thì lƣợng ethanol giảm dần, ngƣợc lại, hàm lƣợng buthanol tăng dần với chiều tăng của glycerol. Trong khi đó, khi tăng nồng độ glycerol từ 5-15 g/l, 1,3 DPO đ ạt cực đại (10 g/l), với nồng độ glycerol cao hơn 15 g/l, hàm lƣợng 1,3 DPO gi ảm nhẹ. Có lẽ sự tăng glycerol không tạo sự ức chế tới bùn mà có thể ảnh hưởng tới sự chuyển hóa tương hỗ giữa các sản phẩm lên men.
Các báo cáo về sự phát triển và hình thành các sản phẩm bởi một số loài Clostridia sử dụng glycerol thô nhƣ nguồn cơ chất, cho thấy phổ sản phẩm của chúng rất khác nhau: C. butyricum chỉ sản xuất propanediol, acetic, butyric mà không sản xuất dung môi (Petidemange và các cộng sự, 1995). Một số các báo cáo chỉ ra không có sự ức chế phát triển của C. butyricum khi nồng độ glycerol thô và tinh sạch lên đến 20g/l. Nồng độ glycerol thô lớn hơn 20g/l sẽ gây ra sự ức chế phát triển, điều này đƣợc giải thích có thể do sự ức chế sự phát triển vi khuẩn bởi các thành phần nhiễm tạp trong glycerol thô (Gonzalez- Pajuelo và các cộng sự, 2004).
Trong nghiên cứu của Dabrock và các cộng sự (1992) C.pasteurianum có thể chuyển hóa hoàn toàn 28g/l glycerol trong lên men gián đoạn. Khi sử dụng nồng độ glycerol cao hơn, một lượng đáng kể glycerol vẫn còn lại trong môi trường lên men, Biel (2001) chỉ ra rằng C. pasteurianum không thể chuyển hóa hoàn toàn glycerol ở nồng độ 50g/l.
III.2. Khảo sát các điều kiện chuyển hóa glycerol nhờ canh trường hỗn hợp bùn hoạt tính và C.pasteurianum ATCC 6013 trong lên men gián đoạn.
Để kiểm tra khả năng chuyển hóa glycerol của các hệ bùn hoạt tính và C.pasteurianum ATCC 6013, 3 canh trường được tiến hành nuôi song song, canh trường 1 được cấy với bùn hoạt tính , canh trường 2 được cấy với hỗn hợp hệ bùn hoạt tính và C.pasteurianum ATCC 6013, và canh trường 3 được cấy với C.
pasteurianum ATCC 6013 với nồng độ glycerol thô ban đ ầu là 25g/l. Kết quả trình bày trên hình III.4.
Tương tự như kết quả thu được với hệ bùn hoạt tính, các sản phẩm thu được từ 3 canh trường lên men là ethanol, butanol, 1-3 PDO và các axit acetate, iso- butyrate và n-butyrate.
Hình III.4a cho thấy cả 3 canh trường đều có khả năng chuyển hóa hoàn toàn lượng glycerol thô 25g/l sau khoảng 6 ngày nuôi, trong đó canh trường hỗn hợp bùn hoạt tính và C.pasteurianum ATCC 6013 chuyển hóa glycerol nhanh hơn so với hai canh trường còn lại.
Lượng ethanol sinh ra ở 3 canh trường là tương tự nhau, ethanol bắt đ ầu sinh ra ở khoảng ngày thứ 2 của quá trình lên men, ở cuối giai đoạn lên men, lƣợng ethanol thu được ở cả 3 canh trường khoảng 0,4g/l (Hình III.4b)
Trái ngược với xu hướng của ethanol, có thể nhận thấy sự khác biệt rõ ràng lượng butanol sinh ra của 3 canh trường lên men (hình III.4c). Với canh trường hệ bùn ho ạt tính, gần nhƣ không có sự chuyển hóa glycerol thành butanol, trong khi đó C.pasteurianum ATCC 6013 có khả năng chuyển hóa glycerol thành một lƣợng butanol đáng kể, khoảng 1,4 g/l. Lượng butanol thu được ở canh trường hỗn hợp bùn hoạt tính và C.pasteurianum ATCC 6013 khoảng 1,6 g/l, cho thấy C.pasteurianum ATCC 6013 có khả năng ảnh hưởng đến hỗn hợp vi sinh vật có trong bùn, làm tăng sản lượng butanol sinh ra, so với môi trường lên men chỉ có bùn hoạt tính.
Hình III.4 d chỉ ra lượng 1,3 propanediol thu được của 3 canh trường. Lượng 1,3 propanediol lớn nhất quan sát được ở cuối giai đoạn lên men của canh trường nuôi cấy bùn hoạt tính là kho ảng gần 10 g/l, tiếp đó là C.pasteurianum ATCC 6013 là 8g/l và của hỗn hợp bùn hoạt tính và C.pasteurianum ATCC 6013 là 7 g/l. Hàm lượng tăng lên của 1,3 DPO trong canh trường bùn hoạt tính cũng giải thích sự không có mặt buthanol trong canh trường trong phân tích trước đó. Điều này có thể cho thấy một xu hướng chuyển hóa tiếp tục buthanol tạo thành trong canh trường thành 1,3 DPO sau 200h lên men nhờ hệ bùn. Thí nghiệm này cũng chƣa thể khẳng
định rằng chủng C.pasteurianum ATCC 6013 không có khả năng chuyển hóa tiếp buthanol thành 1,3 DPO, vì thế cần tổ chức thí nghiệm trong thời gian dài hơn nữa.
Một lượng nhỏ axit acetic, khoảng 0,5g /l thu được ở canh trường lên men bùn và canh trường lên men C.pasteurianum ATCC 6013, trong khi đó ở canh trường hỗn hợp của bùn và C.pasteurianum ATCC 6013 thì lƣợng axit acetic thu đƣợc là kho ảng 1,2 g/l. Ở cả 3 canh trường lượng iso- butyric thu được là khoảng 0,5 g/l và n- butyric là 1,5g/l. Các canh trường lên men đều sinh ra khí CO2 tuy nhiên không thể đo đƣợc.
a.
0 5 10 15 20 25
0 50 100 150 200 250
Time (h)
Con.Glycerol (g/l)
sludge co-culture C.pasteurianum
b.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
0 50 100 150 200 250
Time (h)
Con.Ethanol (g/l)
sludge C.pasteurianum co-culture
c.
0 0,5 1 1,5 2
0 50 100 150 200 250
Tim e (h)
Con. Butanol (g/l)
slud g e C.p ast eur ianum co - cult ur e
d.
0 2 4 6 8 10
0 50 100 150 200 250
Time (h)
Con. 1,3propanediol (g/l)
sludge C.pasteurianum co-culture
Hình III.4. Sản phẩm dung môi chuyển hóa glycerol nhờ các canh trường bùn- C.pasteurianum ATCC 6013
a. Hàm lƣợng glycerol sau quá trình chuyển hóa; và sản phẩm tạo thành (b.Ethanol; c. Buthanol; d. 1,3 PDO)
Hình III.5 chỉ ra sản lượng axit thu được ở ba canh trường. Nhìn chung axit iso- butyric xuất hiện ở cả ba canh trường với lượng không đáng kể, trong khi đó lượng axit n- butyric là khá cao ở canh trường chỉ có bùn hoạt tính, khoảng 3g/l (Hình III.5a), do axit butyric đƣợc bổ sung ban đầu và sinh ra không đƣợc chuyển hóa thành butanol, nên tích t ụ lại ở cuối quá trình lên men. Kết quả ở canh trường C.pasteurianum ATCC 6013 và canh trường hỗn hợp bùn hoạt tính và C.pasteurianum ATCC 6013 thì lượng axit n- butyric sinh ra là tương tự nhau, kho ảng 1,2 g/l đến cuối giai đoạn lên men. Ngƣợc với lƣợng axit acetic sinh ra ở canh trường bùn hoạt tính là không đáng kể khoảng 0,5 g/l thì ở hai canh trường còn lại, lƣợng axit acetic sinh ra tăng cao nhất vào ngày lên men thứ 2 và giảm dần, đến cuối giai đoạn lên men lượng axit acetic ở các canh trường gần như nhau, lượng axit acetic thu được ở C.pasteurianum và canh trường hỗn hợp bùn hoạt tính và C.pasteurianum ATCC 6013 tương ứng là 0,7 g/l và 0,5 g/l.
a.
sludge
0 5 10 15 20 25
0 50 100 150 200 250
T im e ( h)
Con.Glycerol (g/l)
0 1 2 3 4
Con. Acids (g/l)
Glycerol Acet ic acid iso-but yric n-but yric
b
C.pasteurianum
0 5 10 15 20 25
0 50 100 150 200 250
T im e ( h)
Con.Glycerol (g/l)
0 1 2 3 4
Con. Acids (g/l)
iso- but yr ic acid Glycer ol Acet ic acid n- but yr ic acid
co-culture
0 5 10 15 20 25
0 50 100 150 200 250
Tim e (g/l)
Con.Glycerol (g/l)
0 1 2 3 4
Con. Acids (g/l)
Glycer ol Acet ic acid Iso- but yr ic acid n- but yr ic acid
Hình III.5. Sản phẩm axit chuyển hóa glycerol nhờ các canh trường bùn- C.pasteurianum ATCC 6013 a) Canh trường bùn
b) Canh trường C.pasteurianum ATCC 6013
c) Canh trường bùn và C.pasteurianum ATCC 6013
Kết quả thu đƣợc chỉ ra rằng hỗn hợp gồm hệ bùn ho ạt tính và C.pasteurianum ATCC 6013 có khả năng chuyển hóa 25g/l glycerol thô nhờ phương pháp lên men gián đoạn thành các sản phẩm có giá trị nhƣ butanol, 1,3 PDO, trong đó lƣợng butanol thu được khá cao hơn so với phương pháp lên men chỉ có bùn hoạt tính hoặc C.pasteurianum ATCC 6013, tuy vậy, bùn ho ạt tính cho hàm lƣợng 1,3 DPO tích lũy cao nhất trong thí nghiệm này.