CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp phân tích
2.2.1. Xác định thành phần môi trường lên men
- Nito tổng số xác định theo phương pháp so màu Nesley-Raynhet [27].
Nguyên tắc:
NH3/NH4+ + dd Nestler(HgCl2 + KI + KOH) → NH2Hg2IO + KCL + H2O
(NH2Hg2IO:ioduadimercua amonium màu vàng)
Hóa chất: Thuốc thử Nessler KOH
Dung dịch chuẩn NH4Cl 1g/l Tiến hành:
Hòa tan 10g KI trong 10ml nước, vừa thêm từng ít một vừa khuấy dung dịch bão hòa HgCl2 cho tới khi xuất hiện kết tủa đỏ bền. Thêm 30g KOH cho tan tủa hết, sau đó thêm 1ml dung dịch bão hòa HgCl2. Pha loãng vừa đủ 200ml bằng nước.
Trong dịch thủy phân NH4+
có thể xác định được nhờ phương pháp so màu NH4+ tác dụng với thuốc thử Nessler trong môi trường kiềm cho ra sản phẩm có màu vàng.
Hút 0,5 ml (mẫu hoặc chuẩn) + 2,5ml Nessler
Đo độ hấp thụ của dung dịch khi phản ứng xảy sau 10phút tại bước sóng 430nm. Xác định được NH4+từ đó quy đổi sang Nito tổng số.
21
- Phospho tổng số xác định theo phương pháp so màu Ascorbic acid- Molybdate Method [27].
Nguyên tắc: Amonimolybdat và kalitartrate trong môi trường axit và dung dịch phospho tạo thành phức tạp antimon-phospho-molybdate, sau đó hỗn hợp này bị khử bởi axit ascorbic chuyển thành màu xanh. Màu sắc tỷ lệ thuận với nồng độ phosphor.
Hóa chất: Dịch thủy phân chứa phospho Ammonium molybdate
Potassium tartarate H2SO45N
Ascorbic acid KH2PO4
Tiến hành: Pha ammonium molybdate 12,7g trong 250ml, potassium tartarate 0,291g trong 100ml , H2SO4 5N, Ascorbic acid 2,625 g trong 500ml nước,KH2PO4
1g/l. Sau đó tiến hành hút 1ml (mẫu hoặc chuẩn)+1ml thuốc thử+1ml Ascorbic đợi 15 phút, so màu tại bước sống 580nm.
- Lưu huỳnh tổng số được xác định theo phản ứng với Barium chloride [27].
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng Ba2+ + SO42- ---> BaSO4 tạo thành kết tủa trắng đục. Tỷ lệ SO42-
tăng dần khi màu đục dần.
Hóa chất: glycerol, HCl, ethanol, NaCl, Na2SO4, Barium chloride tinh thể Tiến hành: Hút 50 ml glycerol + 30ml HCl định mức 300ml + 100ml(95%) ethanol + 75g NaCl,
Cho 2ml (mẫu hoặc chuẩn) pha loãng thành 100ml thêm 5ml thuốc thử và 1ml 0,1N Na2SO4 lắc đều thêm 0,2-0,3 g BaCl2 lắc đều trong 1 phút. Sau đó đem đi so màu tại bước sóng 370nm và tính SO42-
rồi quy ra lưu huỳnh tổng số.
- Kali, natri, magnessium, sắt xác định theo phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử [31].
Nguyên tắc: Dựa vào việc đo bước sóng, cường độ và các đặc trưng khác của bức xạ điện từ do các nguyên tử hay các ion ở trạng thái hơi phát ra. Việc phát các
22
bức xạ điện từ do các nguyên tử hay các ion ở trạng thái hơi phát ra do sự thay đổi trạng thái năng lượng của nguyên tử.
2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng Carbonhydrat tổng số theo phương pháp Dubois [29]
- Sử dụng phương pháp Dubois để khảo sát sự thay đổi hàm lượng đường trước và sau các khoảng thời gian lên men
- Xác định carbonhydrate tổng số trong rong biển bằng phương pháp Dubois:
- Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa dung dịch đường với thuốc thử phenol sunfuaric. Cường độ màu của hổn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử phenol sunfuaric sẽ tính được lượng đường khử của mẫu phân tích.
Dụng cụ và hóa chất:
- Dung dịch HCl đặc (d=1,19) - Dung dịch phenol 4%
- Dung dịch H2SO4 đậm đặc.
- Dung dịch glucose tinh khiết.
- Ống nessler 50ml có nắp đậy, cốc thủy tinh đựng ống nessler
Tiến hành:
- Chuẩn bị mẫu: quá trình này nhằm tạo ra dung dịch đường khử dùng để so màu.
Đối với mẫu rong được thủy phân bằng phương pháp axit, sau thủy phân dịch đường được lọc sạch tạp và trung hòa về pH 4,5 chuẩn bị cho phân tích.
Đối với mẫu rong được thủy phân bằng phương pháp enzym, sau thủy phân dịch đường được lọc sạch tạp và gia nhiệt để xử lý enzym chuẩn bị cho phân tích
- Chuẩn bị dung dịch đường chuẩn:
Dựng dung dịch Glucose pha cỏc nồng độ: 20; 40; 60; 80; 100; 120àg/ml.
Xác định lượng đường
23
+ Lấy 0,5 ml mẫu đã pha loãng 200 lần + 0,5 ml dung dịch phenol 4% + 2,5 ml H2SO4 đậm đặc cho vào ống nesler khác.
+ Lắc đều hỗn hợp dịch trong10 phút, sau đó để yên 30 phút. Rồi đem đo ở bước sóng 490nm. Ghi lại chỉ số OD của các mẫu phân tích.
+ Tiến hành tương tự với mẫu trắng (nước cất) và mẫu chuẩn (dung dịch đường chuẩn).
Tính kết quả:
- Lập biểu đồ đường chuẩn từ các kết quả đo được của mẫu chuẩn.
- Rút ra phương trình tuyến tính của mẫu chuẩn.
- Thế chỉ số OD của mẫu phân tích vào phương trình tuyến tính từ đó rút ra hàm lượng carbonhyrate tổng số của mổi mẫu rong.
Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Dubois
Để xác định được hàm lượng đường trong dịch thủy phân trước khi lên men cũng như hàm lượng đường sót sau mỗi khoảng thời gian lên men ta cần xây dựng đường chuẩn theo phương trình tuyến tính.
Tiến hành xây dựng đường chuẩn ta thu được các mức nồng độ đường glucose pha loãng và giá trị OD tương ứng đo tại bước sóng 490 nm được thể hiện trong bảng 2.1 và hình 2.1
Bảng 2.1. Các mức nồng độ đường glucose pha loãng và giá trị OD tương ứng đo tại bước sóng 490 nm
Hàm lượng đường 0 20 40 60 80 100
Giá trị OD tương ứng 0 0,24 0,35 0,53 0,72 0,93 Sau đó tiến hành lập biểu đồ đường chuẩn của mẫu chuẩn
24
Hình 2.1. Biểu đồ đường chuẩn từ các kết quả đo được của mẫu chuẩn Phương trình đường chuẩn Y = 0,0089X + 0,0159 (R2 = 0,9921). Phương trình đường chuẩn này có hệ số R (1> R> 0,9) hệ số tin cậy cao. Do vậy phương trình được lập chuẩn cho các chỉ số phân tích.
2.2.3. Xác định hàm lượng ethanol theo phương pháp Bennet 1971 [14]
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng oxy hóa khử dikalidicromat trong môi trường acid với ethanol. Trong phản ứng này dung dịch dikalidicromat (K2Cr2O7)có màu vàng cam sau phản ứng tạo ra sản phẩm dicromtrisufat (Cr2(SO4)3) có màu xanh lam, dựa vào màu của sản phẩm phản ứng khi đo tại bước sóng 560 nm, ta có thể xác định được hàm lượng ethanol tham gia phản ứng.
Phương trình:
2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH3CH2OH → 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 3CH3COOH + 11 H2O
Vàng - cam Xanh – lam
Dụng cụ hóa chất
- Potassium dichromate (K2Cr2O7); Nitrate bạc (AgNO3); Sulfuric acid (H2SO4).
- Ethanol 96%.
25 - Máy đo quang UV-vis.
Tiến hành:
- Sử dụng các ống nghiệm 15ml bố trí thí nghiệm.
- Cho 5 ml dung dịch potassium dichromate (K2Cr2O7) 0,25M vào ống nghiệm 15ml.
- Tiếp tục bổ sung 5 ml Sulfuric acid (H2SO4) 6M.
- Cuối cùng bổ sung 1 ml: mẫu phân tích, nước cất, thiết kế các nồng độ theo đường chuẩn (0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1% v/v) để phản ứng sảy ra trong 5 phút rồi voctex.
Tính kết quả:
- Lập biểu đồ đường chuẩn từ các kết quả đo được của mẫu chuẩn.
- Rút ra phương trình tuyến tính của mẫu chuẩn.
- Thế chỉ số OD của mẫu phân tích vào phương trình tuyến tính từ đó rút ra hàm lượng đường tổng số của mổi mẫu rong.
Xây dựng đường chuẩn ethanol theo phương pháp Bennet 1971
Để xác định được ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình lên men ethanol, tiến hành phân tích hàm lượng cồn trong dịch lên men dựa theo đường chuẩn ethanol.
Lập biểu đồ đường chuẩn độ cồn từ đó tiến hành đo OD tại bước sóng 580nm để xác định hàm lượng cồn trong dịch lên men.
Giá trị OD tương ứng với nồng độ cồn đo được được ghi lại trong bảng 2.2 và hình 2.2
Bảng 2.2. Các mức nồng độ ethanol pha loãng và giá trị OD tương ứng đo tại bước sóng 580 nm
Nồng độ cồn 0 1 2 3 4 5
Giá trị OD 0 0,16 0,58 1,11 1,44 1,70
Lập biểu đồ đường chuẩn ethanol
26
Hình 2.2. Biểu đồ đường chuẩn ethanol đo được từ mẫu chuẩn Phương trình đường chuẩn Y = 0,39381X - 0,1817 (R2 = 0,9839). Phương trình đường chuẩn này có hệ số R (1> R> 0,9) hệ số tin cậy cao. Do vậy phương trình được lập chuẩn cho các chỉ số phân tích.
2.2.4. Xác định hàm lượng ethanol theo phương pháp sắc ký lỏng
Phương pháp xác định ethanol bằng hệ thống HPLC của hãng Shimadzu, Japan. Cột phân tích Aminex hpx-87h với detector RID.
Xử lý mẫu phân tích: Dịch sau lên men được ly tâm 3000 vòng /10 phút. Sau đú pha loóng 30 lần và lọc bằng màng 0,2 àm. Sau đú mẫu được bơm trực tiếp vào hệ thống phõn tớch, thể tớch bơm 50 àl. Sau thời gian mỏy phõn tớch ta sẽ thu được phổ đồ và hàm lượng ethanol.
2.2.5. Xác định hiệu suất lên men.
Xác định hiệu suất lên men theo phương trình C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2
Htt = Ett / Elt x 100 Elt = Mdt x 0.647
Elt : lượng ethanol thu được theo lý thuyết
27 Ett : lượng ethanol thu được theo thực tế Mdt: khối lượng đường tổng
0,647: hệ số chuyển đổi từ lượng đường sang ethanol tính theo thể tích 2.2.6 Phân tích xử lý số liệu trên phần mềm excel 2003.
2.3. Quá trình thực nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục.
2.3.1. Thủy phân rong biển bằng axit .
Quá trình thủy phân rong biển bằng axit được thực hiện với mục đích thu dịch đường làm nguyên liệu cho quá trình lên men sản xuất ethanol. Chúng tôi tiến hành thủy phân rong Lục như sau.
- 50g rong nguyên liệu đã được tiền xử lý.
- 500ml dung dịch axit H2SO4 3%.
- Thủy phân ở 120 oC trong thời gian 60 phút.
Kết quả thu được dịch thủy phân và bã rong. Lọc bã rong và thu được dịch đường sau thủy phân. Xác định hàm lượng đường trong dịch thủy phân theo phương pháp Dubois và tiến hành thí nghiệm lên men.
2.3.2. Hoạt hóa các chủng nấm men trên môi trường Hasen.
Môi trường Hasen (Glucose = 50g, KH2PO4 = 3g, pepton=10g, MgSO4 = 3g, 1 lít nước, agar = 20g). Quá trình này tạo ra lượng nấm men cần thiết cho lên men.
2.3.3. Xác định số lượng tế bào nấm men.
Số lượng tế bào nấm men được thu mẫu sau khi hoạt hóa và được đếm trên thiết bị kính hiển vi Nikon YS 100. [5]
2.3.4. Tiến hành lên men các chủng nấm men.
Các chủng mấm men lên men với dịch thủy phân rong Lục có điều kiện lên men như sau: nồng độ dịch thủy phân 52 mg/ml, nhiệt độ 28 0C, pH= 4,2-4,5 và thời gian là 108 giờ. Theo các khoảng thời gian 24, 48, 60, 72, 84, 96, 108 giờ chúng tôi bố trí 7 bình thí nghiệm có thể tích mỗi bình 200 ml và dán nhãn, sau mỗi khoảng thời gian chúng tôi lần lượt lấy dịch từ mỗi bình phân tích đường sót và cồn.
28 2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Dịch sau khi thủy phân được tiến hành lên men ở các điều kiện pH = 4,5;
lượng nấm men 2,0 ×107 tế bào/ml trong thời gian 72h. Khảo sát nhiệt độ ở các mốc 20, 25, 30, 35, 40oC. Sau thời gian 72h tiến hành xác định hàm lượng ethanol tạo thành.
2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của pH.
Dịch lên men sau thủy phân được tiến hành lên men ở điều kiện nhiệt độ 30oC, và lượng nấm men là 2,0 ×107 tế bào/ml trong thời gian 72h. Khảo sát pH ở các mốc pH 3,5 ; 4,0; 4,5 ; 5,0 ; 5,5. Sau thời gian 72h tiến hành xác định hàm lượng ethanol tạo thành.
2.3.7. Khảo sát động thái lên men ethanol
Dịch lên men sau thủy phân được tiến hành lên men ở điều kiện nhiệt độ 30oC, pH 4,5 và nồng độ nấm men 2,0 ×107 tế bào/ml. Theo các mốc thời gian 24, 48, 72 và 96h. Sau mỗi 24h lên men tiến hành phân tích hàm lượng đường sót và hàm lượng ethanol được tạo thành.
29