CHƯƠNG 6: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GLUXIT TRONG THỰC PHẨM
6.4 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
6.4.1 Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với
BM Quản lý Chất lượng Thực phẩm Trang 126 thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sóng 540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucoza tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid:
Hình 6.1(a) Acid dinitrosalicylic, (b) 3-amino, 5- dinitrosalicylic acid 6.4.2 Xử lý mẫu
Tùy vào đối tượng nghiên cứu (hạt, quả...) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau:
Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin, có thể trích lyđường từ nguyên liệu bằng nước. Cân và cho vào cối sứ 1 g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô... đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi).
Nếu là nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thì cân 5 – 10 g. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30ml nước cất nóng 70 – 80°C.
Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 1000 ml. Đun cách thủy 70 – 80°C trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì acetate Pb(C2H2O2)2.3H2O hoặc chì nitrate Pb(NO3)2 10%.
Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). Sau đó loại bỏ lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút. Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc
hay bình khô. Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm.
▪ Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang, sắn, khoai tây... cần trích ly đường bằng rượu 70 – 80°C, đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí. Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều.
▪ Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua, dứa, chanh, khế... cần chú ý là trong quá trình đun khi trích ly, đường saccharoza có thể bị thủy phân một phần. Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharoza. Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4 – 7,0.
6.4.3 Tiến hành:
❖ Hóa chất
Thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS): cân 1g DNS pha trong 20ml NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối Sodium potassium tartrate, đun cách thủy cho tan rồi định mức tới 100ml.
Dung dịch glucoza chuẩn (500ppm): cân 0.5g D_glucoza pha trong nước cất thành 1lit.
Dung dịch glucoza mẫu (50ppm): hút 10ml dung dịch glucoza chuẩn 500ppm cho vào bình định mức, thêm nước cất, định mức thành 100ml.
❖ Thực hiện
Cân khoảng 4 – 6 g nguyên liệu, tiến hành trích ly bằng 40ml cồn 960 bằng cách chưng cách thủy cho sôi khoảng 10 phút trong một becker 250.
Chuyển dịch trong suốt của quá trình trích ly qua một becker khác. Cho tiếp vào becker trích ly 40ml cồn 960 rồi tiến hành như trên, làm 3 lần để đảm bảo lượng đường được trích ly là hoàn toàn. Song song với quá trình trích ly
BM Quản lý Chất lượng Thực phẩm Trang 128 là quá trình cô đặc dịch trích ly bằng phương pháp chưng cách thủy. Khi dịch cô đặc còn 30ml thì dừng lại, cho vào bình định mức 100ml, lắc đều định mức 100ml. Hút 10ml dd sau khi định mức cho vào bình định mức 100ml, lắc đều định mức 100ml. Đây là dung dịch chuẩn bị tạo phức để đo độ hấp thu. (Nếu lượng đường trong mẫu ít có thể định mức 1 lần).
Lập đường chuẩn với các dung dịch glucoza chuẩn có nồng độ 50ppm và tiến hành tạo phức màu cho mẫu theo bảng sau:
Bảng 6.3 Bảng xác định đường chuẩn cuarglucoza với DNS
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 M1 M2
Chuẩn glucoza 50ppm 0 1 2 3 4
Dịch xác định 2 2
Dung dịch DNS 1 1 1 1 1 1 1
Nước cất 9 8 7 6 5 7 7
Chú ý: sau khi cho thuốc thử DNS vào thì tiến hành chưng cách thủy cho sôi 3 phút (chuyển toàn bộ ống nghiệm vào becher 250ml rồi chưng cách thủy) sau đó để nguội rồi thêm nước cất vào cho đủ 10ml như trong bảng.
Tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 530nm
❖ Một số chú ý khi đo
Nếu màu là phức đo quá đậm hoặc quá nhạt thì có thể giảm hoặc tăng thể tích chuẩn cho phù hợp và bổ sung thể tích còn lại bằng nước cất cho đủ 10ml hoặc có thể pha chuẩn có nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn.
Nếu độ hấp thu của mẫu là nằm ngoài đường chuẩn thì có thể tăng hoặc giảm lượng mẫu sao cho giá trị đo nằm trong đường chuẩn.
Từ số liệu thu được lập đường chuẩn y=ax Tìm Cx
Công thức hàm lượng đường khử được tính như sau:
H+ Trong đó:
- Vđo: là thể tích dung dịch phức đo trong bài là 10ml
- Vxd1,Vxd2: là thể tích đem đi xác định lần 1 và lần 2 trong bài là 10ml và 2ml
- Vdm1, Vdm2: là thể tích định mức lần 1 và lần 2 trong bài là 100ml - mbđ: là khối lượng mẫu đem đi xác định.