2.5. Nguyên tắc của quá trình HPLC trong cột
2.6.8. Số đĩa lý thuyết N (Theoreical plates) hay hiệu quả tách N Hiệu quả tách là thước đo độ rộng của các nút chất phân tích khi nó chuyến dịch doc
tuyệt đối và độ lệch chuẩn của peak sắc ký.
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu quả của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định, Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ky như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H. tat nhiên lớp này có tính chất động. tức là một khu vực của hệ phân tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và
trong pha động.
34
Hỡnh 2.10. Xỏc định độ lệch chuẩn ứ của peak từ độ rộng của peak Giá trị N có thé tính bằng 3 công thức sau:
2
Na i M
wasses{ 4]ì
Mẹ
Với w, là độ rộng của đáy peak tính theo đơn vị thời gian
wy là độ rộng tại một nửa chiều cao của peak tinh theo đơn vị thời gian
Chiều cao của một đĩa lý thuyết H được tính : Hf = —
Chiều cao H phụ thuộc nhiều yếu tố:
+ Đường kính va độ hap thụ của hạt pha tinh;
+ Tốc độ và độ nhớt của pha động:
+ Hệ số khuếch tán của các chất trong cột.
Vi vậy, với một số điều kiện sắc ký xác định thi chiều cao H cũng hãng định đối với
một số chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định.Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500- 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000.
35
KHOA LUAN TOT NGHIỆP NGUYEN HIỂU PHƯƠNG
2,6.9. Độ phân giải R (Resolution)
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện
sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai peak cạnh nhau được tính theo một trong các công
thức:
pao nmin) (wy, + Wy, )
Trong đó : — ta; va ta; là thời gian lưu của hai cấu tử j va i.
Wy là độ rộng của đáy peak tính theo đơn vị thời gian ta có : W,, = 2.3550
W; = 4ơ
Và số đĩa lý thuyết hiệu dụng n= s36 |1]Mỹ{ 2
Nên ta có: n= Mắt]l+k, z
'Từ những công thức trên ta được:
fin Ei ees,
4 a Il|+k,
Trong đó:
N: là hiệu quả tách của cột.
a: là độ chọn lọc.
k: là tỷ số phân bố của chất phân tích.
36
Hình 2.11. Sự phụ thuộc hệ số R vào chiêu đài của cột (phụ thuộc vào N - cột càng dài thì số đĩa lý thuyết càng lớn).
Trong thực tế các peak cân đối (Gaussian) thì độ phân giải để 2 peak tách tối thiêu
là R = 1.0. Trong phép định lượng R = 1.5 là phù hợp.
+ Nếu R nhỏ thi các peak chưa tách han, việc tính điện tích peak sẽ không chính xác. lúc
này phải làm tăng diện tích peak theo 3 cách sau đây:
- Làm thay đổi k’ bằng cách thay đối lực rứa giải của pha động (thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC, thay đổi cường độ ion nếu là IE - HPLC,...)
- Lam tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dải hơn hoặc cột có kích
thước nhỏ hơn...
- Lam tăng độ chọn lọc a bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá trinh tách.
hoặc thay đôi thành phần pha động.
+Nếu R lớn thì quá trình phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém, lúc nay phải tim cách giảm R bằng cách: ứng dụng quá trình rửa giải Gradient dé cho chất thứ hai ra nhanh hon, nêu thiết bị không có khả năng nay thì phải thay đổi thành phan hoặc tỷ lệ
pha động.
37
KHOA LUẬN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIỂU PHƯƠNG
2.6.10. Hệ số nghiên f
Hệ số nghiên hay hệ số không đối xứng f cho biết mức độ không đối xứng của peak trên sắc đô thu được.
Hệ số f được tính bằng tỷ số độ rộng của hai nửa peak tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều
cao.
ƒ,=bla
Hình 2.12. Hệ số nghiên
Peak dạng đối xứng hình Gaussian trên thực tế khó đạt được, vì vậy phải quan tâm đến hệ số không đối xứng f, khi f nằm trong khoảng 0.8 — 2.0 thì phép định lượng được chấp nhận, nếu f >2.0 thì điểm cuối của peak rất khó xác định, vì vậy cần thay đổi các
điều kiện sắc ký để làm cho peak cân xứng hơn theo các cách sau:
© Làm giảm thé tích chết, tức là đoạn cuối nỗi từ cột đến detector.
© Thay đối thành phan pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên.
© Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu phân tích hoặc giảm thé tích tiêm.
2.6.11. Phương trình Van Deemter
Khi chúng ta đề cập đến những ảnh hưởng của các thông số đến quá trình tách.
chúng ta chưa đề cập đến tốc độ pha động trong cột. Thực ra tốc độ của pha động có ảnh hưởng đến quá trình phân tách các cấu tử trong mẫu trong quá trình sắc ký.
38
KHOA LUAN TOT NGHIỆP NGUYEN HIEU PHƯƠNG
m——-—_—_—_œầ=ềẰẽ —-—=——msnmmmm=mmmmmmm——————— --
Trong một điều kiện sắc ký đã được xác định, sự dân peak phụ thuộc vào nhiều quá trình động học vả nhiệt động xảy ra ở trong cột: chất tan khuếch tán ngang và dọc theo
dong pha đông, tốc độ hữu hạn của sự thiết lập cân bằng phân bé chất tan vào hai pha (sự chuyển khối). sự khuếch tán chất tan trong pha tĩnh, sự không đồng nhất của các dòng
chảy...
Phương trình Van Deemter mô tả ánh hưởng của tốc độ dòng pha động và các thông số động học khác đến hiệu lực của cột (đến chiều cao của đĩa lý thuyết H) :
Hinh 2.13. Mé ta phwong trinh Van Deemter Trong đó:
- _ A: mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xoáy do các dòng chảy không đều của pha động qua pha tĩnh làm cho tốc độ di chuyển của các chất tan cũng không đồng đều dẫn đến sự dain peak. A cảng lớn khi các hạt chất nhồi cảng lớn hoặc các hạt nay
không được nhỏi đồng đều.
- B/u: mô ta ảnh hưởng của sự khuếch tán doc (ngược vả xuôi) của các phân tử chat tan theo phương dòng chảy của pha động (u là tốc độ dòng). làm cho chúng di chuyển không đồng đều gây ra su dan peak. B nhỏ khi hệ số khuếch tán của chat tan
trong pha động nhỏ, ngoài ra B còn phụ thuộc vào kích thước hạt và kỹ thuật nhoi
của cột giống như A,
39
KHOA LUẬN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIỂU PHƯƠNG
- C: mô tả ánh hưởng của vị trí đi chuyên khác nhau của các phân tử chat tan (trong lòng pha động, phân tiếp giáp hai pha, trong lòng dòng pha tĩnh). nên chúng
di chuyển không đồng đều gây ra ra sự dẫn peak, C phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố:
các hệ số khuếch tán trong pha tĩnh và pha động, cỡ hạt, chiều dày lớp pha tĩnh, hệ số dung lượng...
Ngày nay, phương trình Van Deemter đã được nâng lên chỉ tiết hơn, có phân biệt giữa
sắc ký lỏng và sắc ký khí. Tuy vậy, qua các yếu tố ảnh hướng trên cũng thấy được sự dần
peak xảy ra khi chiều cao đĩa lý thuyết H tăng do pha tĩnh là một tất yếu khách quan, chi có thé hạn chế nó bằng cách sử dụng các cột có kích thước hạt nhỏ và được nhdi đồng đẻu.
2.7. Tối ưu hóa trong quá trình sắc ký
Vi phương pháp sắc ký vốn có là phương pháp định lượng, nó dựa trên việc đo chính xác diện tích peak. Vì vậy, các chất muốn được xác định phải được tách tốt. Để có được kết quả này can phải sử dụng các thiết bị phan mềm điều khiển sao cho các thông số vật lý của quá trình đạt kết quả tốt nhất. Đồng thời ta cũng hiểu rõ bản chat của quá trình.
Trong sắc ký khí, quá trình tách có thé rất phức tap, vì nó rất khó dé đưa ra giá trị cho một thông số nào đó. Liệu nhiệt độ làm tăng hay làm giảm hiệu quả của quá trình, tất cả các công việc như: chọn loại cột, chiều dài của cột, đường kính của nó, chọn pha tĩnh, tỷ số pha,...tat cả những điều này đều ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tách. Chưa kẻ là các
thông số này có ảnh hưởng lẫn nhau.
Trong quá trình sắc ký, dung dịch rửa giải và thời gian rửa giải là hai thông số quan
trọng và giá trị của chúng phụ thuộc vào nhau. Mục đích là hướng tới tách các thành phan
trong mẫu phân tích ra khỏi nhau trong thời gian ngắn nhất, để không mat thời gian đưa
thiết bị về trạng thái ban đầu nhằm thực hiện quá trình phân tích tiếp theo. Nếu dung môi
rửa giải là tốt. thì nó sẽ ảnh hưởng tốt đến thời gian lưu của các cấu tử. Lúc đó chúng ta có
thể sử dụng những cột ngắn hơn mà vẫn thực hiện tết quá trình tách.
Hình dưởi đây cho chúng ta thấy được sự ảnh hưởng của thanh phan pha động trong sắc ky lóng đến kha năng tách các thành phần hydrocacbon trong mẫu ban dau. Sắc ký đỗ cũng cho ta thấy khi thay đổi thành phan pha động thì chu ky thời gian chạy mẫu cũng
thay đôi.
40
Hình 2.14. Sự ảnh hưởng của thành phần pha động trong sắc ký long đến kha năng
tách
Quả trình tách sắc ký: pha động được thay đổi theo những tỷ lệ khác nhau giữa hai thành phan: nước va acetonitril a.50/50 b.55/45 c. 60/40 d. 65/35
Trong sắc ký luôn có sự tồn tại phụ thuộc giữa ba thông số được đặc trưng bởi hình tam
giác là : độ phản giải, tốc độ pha động và dung lượng cột. Ba thông số này là mâu thuẫn lẫn nhau. Thông thường trong quá trinh sắc ký người ta lưu ý tới tính chất chọn lọc của
dung dich rửa giải. Vi vậy, mà trong sự phụ thuộc lẫn nhau theo hình tam giác thì hai yếu
tổ dung lượng cột và tốc độ của pha động ít xét đến, coi như là hằng số dé kháo sát tính rửa
giải của pha động.
4l
Hình 2.15. Sự phụ thuộc ba thông số trong sắc ký
Đồ thị mô tả tương ứng với quá trình sắc ký. Nền tảng của ching dựa trên 5 thông số K, k, N, R và sự phụ thuộc tam giác của 3 thông số trong sắc ký.