Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Phương pháp giữ giống vi khuẩn
Phương pháp cấy truyền định kỳ: Tiến hành cấy truyền các chủng vi khuẩn giống định kỳ 1,5-2 tháng một lần trên ống thạch nghiêng chứa môi trường MPA nồng độ 5% NaCl, đặt trong tủ ấm 35 OC, sau 24 - 48 giờ vi khuẩn đã mọc tốt thì chuyển sang giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 OC.
2.3.4. Phương pháp hoạt h chủng vi khuẩn tuyển chọn
Cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường MPA có chứa 5% NaCl đặc ở nhiệt độ 35 C trong 24 giờ, cấy chuyển sang môi trường MPA nồng độ 5%
NaCl lỏng, nuôi trong tủ lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35 OC trong 14 giờ. Lúc này chủng vi khuẩn đã được hoạt hóa và nhân giống cấp 1 sẵn sàng để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào
Nhuộm đơn: Cấy vi khuẩn lên môi trường MPA nồng độ 5% NaCl đặc, nuụi trong tủ ấm 35 OC trong 24 giờ. Làm vết bụi lờn kớnh: nhỏ 10 àl nước cất vụ trùng lên phiến kính sạch. Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần nghiên cứu cho vào giọt nước tạo ra dung dịch huyền phù tại chỗ. Dàn đều, để khô và cố định bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm đơn bằng Fucsin kiềm trong khoảng 1-2 phút. Rửa bằng nước, thấm khô, quan sát và mô tả kích thước tế bào dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần.
Hình dạng và kích thước tế bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn cũng được xác định nhờ ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử quét (SEM) tại Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
Nhuộm Gram: Làm vết bôi bằng giọt huyền phù (0,01ml) các vi khuẩn đã được nuôi cấy 24 giờ trên môi trường MPA nồng độ 5% NaCl lỏng. Hong khô và cố định vết bôi bằng dung dịch Genatian trong 2 phút. Đặt nghiêng cho thuốc nhuộm thừa chảy xuống chậu hứng. Nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi và nhuộm trong 1 phút. Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn trong khoảng 15-20 giây, rửa cồn dư bằng nước, nhuộm màu bổ sung bằng dung dịch safranin trong 2 phút. Rửa tiêu bản bằng nước, thấm khô tiêu bản, soi kính hiển vi với vật kính dầu để xác
2.3.6. Phương pháp đông khô
Chủng vi khuẩn sau khi được nuôi lỏng trên môi trường ở các nồng độ NaCl khác nhau trong 30 giờ. Tiến hành li tâm thu sinh khối, sau đó rửa qua với nước muối tương đương với các nồng độ NaCl có trong môi trường nuôi cấy, giữ lại sinh khối tế bào, đông khô bằng máy đông khô Flexi Dry (Mỹ), sau đó dùng để phân tích hàm lượng ectoines trong tế bào.
2.3.7. Phương pháp định loại vi khuẩn bằng kỹ thuật di truyền phân tử Nuôi cấy chủng tuyển chọn trên môi trường MPA nồng độ 5% NaCl lỏng, trong 14 giờ. Tiến hành tách chiết DNA tổng số theo các bước trong bộ kit “ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM”
DNA tổng số được sử dụng để tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn trình tự 16S rDNA với cặp mồi (314F: 5’- CCT ACG GGA GGC AGC AG - 3’ và 907R: 5’ - CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT - 3’). Sử dụng bộ kit
“Dream Taq PCR Master Mix (2X)” (Thermo Fisher Scientific, USA). Phản ứng PCR được thực hiện trong điều kiện: Biến tính DNA ở 94 OC trong 3 phút. Lặp lại 35 chu kỳ với chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: (1) Giai đoạn biến tính DNA ở 94 OC trong 30 giây; (2) Giai đoạn bắt cặp mồi ở 52 OC trong 30 giây; (3) Giai đoạn kéo dài: 72 OC trong 1 phút. Giai đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng là 7 phút ở 72 OC và giữ sản phẩm PCR ở 4 OC (∞). Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose
“PAGErTM EM Gels Mid/High (10-350 kDa) 4 - 12% (Lonza, USA)” với điện áp 220V trong 6-10 phút và hiện hình ảnh sản phẩm dưới tia UV. Sản phẩm PCR được gửi tới công ty Gentis (Singapore) để giải trình tự. Trình tự gen sau đó được so sánh với ngân hàng gen để xác định chủng loại phát sinh của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.3.8. Phương pháp lên men thu sinh khối tế bào
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 14 giờ trong môi trường MPA nồng độ 5% NaCl lỏng vào bình tam giác chứa 25ml môi trường MPA 5%
NaCl .Đặt các bình tam giác trong tủ lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35 OC trong 30 giờ.
Giá trị CDW được xác định theo các bước: Chuẩn bị eppendorf 2 ml đánh số thứ tự, sấy khô đến khối lượng không đổi sau đó cân để xác định khối lượng ban đầu (M0) của từng eppendorf. Hút lần lượt 3ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf trên. Sau đó li tâm 12000 vòng trong 5 phút, giữ lại sinh khối tế bào.
Rửa sinh khối bằng nước cất, sấy khô eppendorf chứa sinh khối đến khối lượng không đổi, cuối cùng cân eppendorf để xác định khối lượng eppendorf và tế bào (M1), mỗi mẫu lặp lại 3 lần. Tính khối lượng tế bào khô (CDW) theo công thức:
CDW (g/l) = (M1 - M0)/3*1000
Li tâm toàn bộ dịch nuôi cấy, thu sinh khối, rửa bằng nước muối tương đương với các nồng độ muối của môi trường nuôi cấy. Sau đó đông khô để phân tích ectoines.
2.3.9. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng củ điều kiện nuôi cấy và dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của chủng tuyển chọn
2.3.9.1. ghiên cứu ảnh hưởng củ pH đến sự sinh trưởng của chủng tuyển chọn
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 14 giờ vào trong bình tam giác 100ml chứa 25ml môi trường MPA nồng độ 5% NaCl đệm photphate 0,01M có pH khác nhau: 6; 6,5; 7; 7,5; 8. Nuôi trong tủ lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35 C trong 30 giờ. Thu mẫu để xác định khối lượng tế bào khô (CDW).
2.3.9.2. Nghiên cứu ảnh hưởng củ nhiệt độ đến sự sinh trưởng củ chủng tuyển chọn
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 14 giờ vào trong bình tam giác 100ml chứa 25ml môi trường MPA nồng độ 5% NaCl ở các mức nhiệt độ khác nhau: 25 OC, 30 OC, 35 OC, 40 OC, 45 OC lên men trong 30 giờ, rồi đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn dựa vào CDW.
2.3.9.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng và tích lũy ectoines của chủng tuyển chọn
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 14 giờ vào trong bình tam giác 100 ml chứa 25ml môi trường MPA nồng độ 5% NaCl với pH thích hợp (tùy từng chủng) có các nồng độ muối khác nhau: 3%, 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 24%, 27%, 30%. Nuôi trong tủ lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở 35 OC trong 30 giờ. Thu mẫu để xác định sinh khối khô (CDW) đánh giá sự sinh trưởng và xác định hàm lượng ectoines tích lũy trong tế bào của các chủng vi khuẩn nghiên cứu.
2.3.9.4. Phương pháp nuôi cấy hai pha nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cl đến khả năng sinh tổng hợp ectoines của chủng tuyển chọn
Pha sinh trưởng (pha 1): Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa 24 giờ được nuôi cấy nhân giống cấp 1 (14 giờ) trên môi trường MPA 5% NaCl lỏng nồng độ muối là 5%, pH thích hợp. Chuẩn bị bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường MPA nồng độ NaCl 5% đã khử trùng, bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn khi bắt đầu nuôi cấy. Đặt các bình tam giác trong tủ lắc 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 35 OC, sau 24 giờ li tâm thu sinh khối tế bào, xác định khối lượng tế bào khô của tế bào.
Pha tích lũy (pha 2): Chuyển sinh khối tế bào của các chủng tuyển chọn từ pha sinh trưởng sang các bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 50ml môi trường MPA ở các nồng độ muối khác nhau: 10%, 15%, 20%. Đặt các bình tam giác trong tủ lắc 180 vòng/phút, nhiệt độ 35OC. Sau 30 giờ xác định khối lượng tế bào khô và hàm lượng ectoines tích lũy trong tế bào.
2.3.9.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn itơ đến sự sinh trưởng của chủng tuyển chọn
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 14 giờ vào trong bình tam giác chứa 25ml môi trường thu sinh khối với các nguồn nitơ khác nhau (2g/l): cao nấm men, monosodium glutamate (MGS), NH4Cl, KNO3, cao thịt và pepton nuôi
trong tủ lắc với tốc độ 180v/p ở nhiệt độ 35 OC trong 30 giờ. Thu mẫu và xác định sinh khối khô (CDW), dựa vào khối lượng tế bào khô để đánh giá sự ảnh hưởng của các nguồn nitơ.
2.3.9.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn C cbon đến sự sinh trưởng của chủng tuyển chọn
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 14 giờ vào trong bình tam giác chứa 25 ml môi trường thu sinh khối với các nguồn cacbon khác nhau (20g/l): Glucose , saccharose, lactose, galactose, xylose. Nuôi trong tủ lắc với tốc độ 180v/p ở nhiệt độ 35 OC trong 30 giờ.Thu mẫu và xác định sinh khối khô (CDW), dựa vào khối lượng tế bào khô để đánh giá sự ảnh hưởng của các nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của chủng tuyển chọn.
2.3.9.7. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp ectoines của chủng tuyển chọn sử dụng nguồn cacbon glucose và nguồn nitơ cao nấm men ở các nồng độ NaCl khác nhau
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 14 giờ vào bình tam giác chứa 25 ml môi trường thu sinh khối với các nồng độ NaCl khác nhau 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, pH 6,5. Nuôi trong tủ lắc với tốc độ 180v/p ở nhiệt độ 35 OC trong 30 giờ.Thu mẫu và xác định sinh khối khô (CDW) và hàm lượng ectoines tích lũy trong tế bào, dựa vào CDW để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng và khả năng tích lũy ectoines của chủng tuyển chọn.
2.3.9.8. Nuôi cấy hai pha ghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp ectoines của chủng tuyển chọn sử dụng môi trường khác nhau ở mỗi pha
Pha sinh trưởng (pha 1): Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa 24 giờ được nuôi cấy nhân giống cấp 1 (14 giờ) trên môi trường MPA lỏng nồng độ muối là 5%, pH thích hợp. Chuẩn bị bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường thu sinh khối đã khử trùng, bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn khi bắt đầu nuôi
cấy. Đặt các bình tam giác trong tủ lắc 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 35 OC, sau 24 giờ li tâm thu sinh khối tế bào, xác định CDW của tế bào.
Pha tích lũy (pha 2): Chuyển sinh khối tế bào từ pha sinh trưởng sang các bình tam giác 100ml, mỗi bình chứa 25ml môi trường MPA ở các nồng độ NaCl khác nhau: 7%, 10%, 13%. Đặt các bình tam giác trong tủ lắc 180 vòng/phút, nhiệt độ 35 OC. Sau 30 giờ xác định CDW và hàm lượng ectoines tích lũy trong tế bào.
2.3.10. Nghiên cứu sản xuất ectoines từ chủng tuyển chọn sử dụng nồi lên men 10L
Bổ sung 400ml giống cấp 1 vào nồi lên men chứa 3,6 lít môi trường MPA 5% NaCl. Quá trình lên men được chia làm 2 pha.
Pha 1: Tiến hành lên men ở điều kiện nhiệt độ 35 OC, pH = 6,5, giai đoạn từ 0-12 giờ duy trì tốc độ khuấy 200-300 vòng/ phút, sục khí 1lít/phút. Bắt đầu từ thời điểm 12 giờ tốc độ khuấy tăng lên 400-500 vòng/phút, sục khí tăng lên 3 lít/phút.Sau 6 giờ nuôi cấy bắt đầu lấy mẫu phân tích OD600, và xác định CDW, khoảng thời gian giữa hai lần lấy mẫu là 6 giờ.
Pha 2: Sau 24 giờ lên men lọc thu toàn bộ sinh khối chuyển sang môi trường MPA 5% NaCl. Sau 6 giờ, tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm khác nhau (3 giờ/lần) để xác định CDW và hàm lượng ectoines tích lũy trong tế bào. Dung dịch 36% NaCl cũng được bơm dần dần vào nồi lên men để đạt được nồng độ NaCl trong dịch lên men là 12% sau 27 giờ nuôi cấy.
2.3.11. Phương pháp phân tích hàm lượng ectoines trong tế bào vi khuẩn Ectoines trong tế bào được tách chiết theo phương pháp đã được mô tả bởi Kunte và cs (1993). Cõn 10 mg sinh khối tế bào khụ hũa trong 570 àl dung dịch có chứa hỗn hợp methanol/chloroform/nước theo tỷ lệ 10:5:4 (v/v). Trộn đều hỗn hợp trong 5 phỳt sau đú bổ sung 170 àl chloroform và 170 àl nước. Tiếp tục trộn đều hỗn hợp trong 10 phút, sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút để phân
tách pha chloroform và pha methanol với nước. Dung dịch ưa nước phía trên có chứa ectoines sẽ được sử dụng để phân tích. Hàm lượng ectoines tích lũy trong tế bào được xác định bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột Aminex HPX-87C, dung dịch chạy là 5mM CaCl2 tốc độ dòng chảy là 0,3 l/phút, nhiệt độ cột 65 OC (Van-Thuoc và cs, 2010). Ectoines tinh sạch được mua của công ty Sigma (Mỹ) được sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn. Dựa vào kết quả phân tích thu được để tiến hành lựa chọn chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Ectoine và hydroxyectoine (Sigma) tinh sạch được sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn.
y = 0.0335x + 0.0014 R² = 0.9999
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Hàm lượng ectoine (mg)
Diện tích đỉnh
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng ectoine bằng sắc kí lỏng
Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Hydroxyectoine bằng sắc kí lỏng