-Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của lan Hồ Điệp:
+Kiểu gen: các đặc điểm của kiểu gen rất đa dạng, bao gồm: màu sắc hoa, kích thước hoa, số lượng cành hoa, số lượng hoa, chiều cao thân,…
+Tình trạng của cây: cây phải đủ trưởng thành trước khi làm mát, chất khô đầy đủ lưu trữ trong cây, cây phải được bảo vệ chống lại thiệt hại của dịch bệnh, virut, thiệt hại hóa chất, muối tích tụ trong cây trồng.
+Môi trường: phải đảm bảo rằng sự kết hợp của các yếu tố này là tối ưu nhất, bao gồm: ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ, nước tưới, phân bón, chậu…
II. Nhân giống Lan hồ điệp
1. Nhân giống truyền thống
1.1. Nhân giống hữu tính bằng hạt
Trong môi trường tự nhiên, lan được thụ phấn nhờ vào côn trùng. Cánh môi hoa lan có cấu tạo đặc biệt và hình dáng thuận lợi cho côn trùng đậu vào, tiếp xúc với khối phấn và mang đi. Thường thì tỉ lệ thụ phấn thành công thấp nên con người muốn thu hạt phải chủ động thụ phấn cho cây. Những hạt của chúng thường rất nhỏ, có dạng bột, không phôi nhũ mà chỉ có một lớp vỏ rất mỏng, trong điều kiện tự nhiên rất khó tự nảy mầm thành cây con, thường phải gieo hạt trong môi trường vô trùng thích hợp mới có thể thu được cây con.
Năm 1899, nhà thực vật Pháp Noel Bernard đã phát hiện ra điều làm cho hạt lan có thể nảy mầm: có liên quan tới sự cộng sinh của nấm, hệ rễ của nấm xâm nhập vào hạt lan và cung cấp nguồn cacbon cho phôi phát triển
Năm 1922, Knudson đã nghiên cứu thành công việc thay nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt. Gieo hạt in vitro có thể làm cho các hạt chưa chín nảy mầm và việc khử trùng cả quả dễ dàng hơn. Khi quả chín 2/3, có thể khử trùng bằng dung dịch thuốc tẩy và cồn. Sau đó, dùng dao tách vỏ và lấy hạt ra để lên môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, hạt sẽ nảy mầm theo 2 cách:
-Mọc qua thể tiền chồi: khi mới nảy mầm hình thành nên thể tiền chồi màu trắng, lớn dần lên, trên bề mặt sẽ xuất hiện rễ giả dạng lông hút, thể tiền chồi này sẽ chuyển sang màu xanh lục, nhưng không mọc dài thêm nữa. Trên chóp của thể tiền chồi sẽ nảy chồi. Thông thường thì các thể tiền chồi này có khả năng phân hóa thành cây.
-Mọc qua thân rễ: khi hạt nảy mầm ban đầu là thể màu trắng, sau đó sẽ mọc dài ra rất nhanh tạo thành một dạng hình trụ dài, rồi hình thành nên thân rễ. Sau đó trên các kẽ của bề mặt thân rễ mọc ra các rễ giả dạng lông mao, trên môi trường phân hóa, đỉnh chồi của thân rễ sẽ mọc ra cây con, nhưng tỉ lệ phân hóa ra cây con rất thấp.
Chuyển cây con sang môi trường mới sau mỗi 30 - 60 ngày. Khi cây con có 2 – 3 lá thì rễ bắt đầu hình thành. Khoảng 6 tháng sau thì có thể chuyển cây con ra vườn ươm. Quá trình nhân giống này cho tới khi cây trưởng thành cho hoa mất khoảng 4 năm hoặc nhiều hơn nữa tùy vào từng giống.
Nhân giống bằng phương pháp này tốn rất nhiều thời gian, cây con mang tỉ lệ biến dị cao, các cây con không đồng nhất về mặt di truyền và cây con cho hoa không đẹp như cây mẹ. Từ những bất cập liên quan trực tiếp tới giá trị của lan hồ điệp mà người ta ít sử dụng phương pháp gieo hạt.
1.2 Nhân giống vô tính bằng cách tách chiết
Thời vụ tách chiết tốt nhất đối với các loại lan là vào đầu mùa tăng trưởng.
Thường là mùa mưa, ẩm độ tốt hoặc là trồng trong các nhà kính mang tiểu khí hậu nhân tạo thì có thể tiến hành tách chiết quanh năm
Hồ điệp là loại đơn thân, nhưng nếu biết chăm sóc và có biện pháp thích hợp thì tạo được cây con ở gốc cây mẹ (thường tiến hành trên cây lớn hơn 3 năm tuổi) và ở gốc phát hoa
a. Tách chiết cây con mọc từ cây mẹ
Ở những loài đơn thân như phalaenopsis không có giả hành nhưng trồng lâu năm vẫn lên cao và cho nhiều rễ gió. Muốn cắt trồng nên cắt phần ngọn có 3-4 rễ gió, bôi thuốc kích thích ra rễ, trồng phần ngọn trong giá thể thoáng với than gỗ.Phần gốc còn lại chăm sóc tốt và bón phân đầy đủ thì nó sẽ nảy chồi 2-3 cây con ở nách lá.
Thông thường, để giữ lại cây mẹ khỏe mạnh, thì không cắt ngọn mà buộc dây kẽm vào thân cây mẹ trên 2-3 lá dưới cùng (hình 1.2a1,a2) để hạn chế sự phát triển của phần ngọn, tập trung dinh dưỡng cho cây nảy chồi con. Dây kẽm buộc lún sâu vào khoảng 1mm là được. Bón phân và tưới nước đầy đủ, khoảng 1-2 tháng sau ở phần nách lá dưới gốc cây mẹ bắt đầu nhú chồi non. Ở giai đoạn này không nên tưới nước lên chồi và không để giá thể chạm vào chồi, vì chồi non rất dể bị thối nhũn.Trong thời gian chờ chồi non nảy mầm, nếu dây kẽm lỏng thì cứ siết thêm vào cho vừa chặt là được.Khi chồi non đã nhú lên như vậy, tiến hành mở dây cho cây mẹ. Để cây con phát triển cùng với cây mẹ trong vòng 6 tháng là cây hoàn chỉnh rễ, thân, lá và có thể tách khỏi cây mẹ sang một chậu mới.
Ngoài ra, phương pháp nhân giống lan Hồ Điệp từ phát hoa cũng được sử dụng phổ biến. Cho Hồ Điệp mọc cây con trên phát hoa nhờ nguồn dinh dưỡng của cây mẹ (hình 1.2a3).Cách này thường dùng khi phát hoa sắp tàn, nhưng không nên để phát hoa héo quá.Lúc này, cắt phát hoa chừa lại 1 đoạn có 3-4 chồi ngủ phát hoa trên cây mẹ.Chăm bón tốt cây mẹ, khoảng 1 – 2 tháng sau thì chồi con nhú ra từ mắt ngủ của
gốc phát hoa. Khi cây con đã có hệ rễ khỏe mạnh (6 tháng) tách chiết cây con trồng vào chậu mới.
Hình1.2 a1,2 : keiky từ gốc cây mẹ phalaenopsis
Hình 1.2a3: keiky từ phát hoa phalaenopsis
b. Tạo cây con bằng cách giâm phát hoa.
Bước 1: chuẩn bị đất kĩ càng
Ngâm các viên than bùn dưới vòi nước cho tới khi thấy ngấm đủ nước là được
Trải than bùn vào một khay nhựa nhỏ, lấp khoảng trống giữa các viên than bùn bằng cát silica
Thêm vào khay đất một ít nước + một ít nước dừa Bước 2: chuẩn bị mẫu
Đầu tiên, ta chọn phát hoa to, khỏe, bông đẹp, phát hoa chỉ mới nở 1 -2 bông Bỏ mắt ngủ đầu tiên, cắt phát hoa ra làm các đoạn có độ dài bằng nhau, khoảng 3 cm (cắt lấy 3 -4 đoạn).Theo nghiên cứu thì các mắt ngủ thứ 2-3-4-5 có tỉ lệ nảy chồi cao hơn các mắt ngủ ở gần ngọn (hình 1.2b1).Lưu ý: dùng dao bén đã khử trùng cắt thật gọn lẹ, tránh làm mô bị dập nát, tổn thương, nên cắt xéo 1 góc 45 độ
Cắt cành xong tiến hành gỡ bỏ lớp màng bao thật cẩn thận, tránh làm trầy xướt, tổn thương tới mắt ngủ (hình 1.2b2).
Đặt mắt ngủ cào trong khay đất đã chuẩn bị: đặt nằm ngang như hình vẽ, chồi hướng lên trên (hình 1.2b3).
Đậy hộp bằng nắp nhựa hoặc túi ni lông để đảm bảo độ ẩm, để hộp ở nơi ấm và có tránh ánh nắng trực tiếp (hình 1.2b4).
Kiểm tra mỗi 3-4 ngày để chúng có đủ độ ẩm
Hình1.2b1: vị trí cắt phát hoa
Hình 1.2b3,4: mắt ngủ trước và sau khi gỡ bỏ màng bao
Hình 1.2b3: đặt mắt ngủ vào khay
Sử dụng phương pháp tách chiết, giâm phát hoa này có thể giúp phalaenopsis ra hoa trong vòng 18 tháng đến 2 năm.
Việc nhân giống vô tính bằng phương pháp tách chiết truyền thống tạo được cây con đồng nhất nhưng thời gian nhân giống rất dài và hệ số nhân rất thấp. Hơn nữa cây con tạo ra có sức sống không cao. Phương pháp nhân giống này chỉ thích hợp với những người trồng lan để thưởng thức. Muốn trồng với qui mô lớn thì không thể áp dụng phương pháp này.
2. Nhân giống hiện đại
2.1. Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh.
Phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh tạo PLB lần đầu tiên được biết tới do trường đại học Hawai thực hiện (Intuwong và Sagawa, 1974). Vật liệu là chồi đỉnh mang 6-7 lá non của các cây P. amabilis, P.x Star của Santa Cruz, P. x Surfrider, P. x Ituby Lips, P.x Arcadia, và P.cochlearis.
Phương pháp nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh được ứng dụng thành công cho nhiều loại lan. Tuy nhiên, đối với các loài lan đơn thân như Phalaenopsis, khi sử dụng phương pháp này sẽ làm tổn thương cây mẹ. Mặt khác nguồn mẫu rất hạn chế nên phương pháp này ít được sử dụng.
2.2. Nhân giống vô tính sử dụng phát hoa Phalaenopsis
Gavino Rotor là người đầu tiên thành công trong việc nhân giống vô tính in vitro lan hồ điệp khi ông còn là nghiên cứu sinh của trường đại học Cornell. Ông đã sử dụng phát hoa bỏ lá bắc mang 4-6 chồi ngủ, cắt phát hoa thành các đoạn mang một chồi nằm giữa cách 2 đầu cắt 7-8 cm. sau đó khử trùng bề mặt và cắt vô trùng thành các đoạn cách hai đầu 1-2 cm. Cấy các đoạn phát hoa vào môi trường Knudson C làm rắn với agar, các đoạn phát hoa được cắm thẳng cho chồi hướng lên. Phương pháp này
của ông ít được nhắc tới vì tỉ lệ nhiễm quá nhiều và hệ số nhân thấp. Khoảng 10 năm sau những nhà nghiên cứu khác đã tạo ra nhiều quy trình mới dựa trên phương pháp này. Nghiên cứu của nhóm Ernst (1984) cho thấy khi nồng độ cytokinin trong môi trường tăng lên sẽ cảm ứng tạo cụm chồi và hình thành cây con từ nốt phát hoa. Về sau rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm tới hướng này.
Đây là một quy trình đơn giản tạo chồi từ phát hoa lan hồ điệp. Từ mẫu phát hoa, đoạn mang mầm ngủ được cắt ngắn, các mẫu này được lau bằng cồn 70o.Sau đó được rữa trong dung dịch có vài giọt teepol, rữa mẫu với nước sạch và khử trùng trong dung dịch hypocloric canxi 7% trong 10 phút, rữa lại với nước cất vô trùng từ 3-4 lần.trong tủ cấy vô trùng, các đoạn trên được cắt cách đầu trên và đầu dưới mang mầm 1.5 cm, tách vẫy lá bao mầm. Sau đó mẫu được cấy trong các môi trường dinh dưỡng MS có bổ sung BA 3 mg/l và đặt nuôi trong điều kiện nhiệt độ là 25oC, chiếu sáng 12 giờ/ngày và ẩm độ từ 75 – 80%. Sau 2-3 tháng chồi phát triển, cấy chuyền sang môi trường REM chứa 10% nước chuối xay và không có chất điều hòa sinh trưởng để cây ra rễ sau 1-2 tháng tiếp theo (hình 2.2a).
Hình 2.2a: phát sinh chồi từ phát hoa
Một số hình ảnh cảm ứng tạo mô sẹo từ mắt ngủ phát hoa
Ở phalaenopsis, phương pháp nhân giống từ phát hoa là phương pháp phổ biến nhất. Nhân giống bằng phương pháp này tạo được cây con sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, và đặc biệt là phương pháp này không làm tổn thương cây mẹ. Tuy nhiên, khuyết điểm của phương pháp này là hệ số nhân thấp. Hiện nay phương pháp mới như phát sinh PLB trực tiếp từ mô in vitro, tạo mô sẹo và phát sinh phôi vô tính đem lại kết quả rõ rệt, cải thiện tình trạng thiếu giống của mảng nuôi trồng hoa lan. Phương pháp này được thực hiện nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu các phương pháp mới sau này.
2.3. Tạo mô sẹo
Mô sẹo (hình 2.3a) là một khối tế bào không phân hóa, phát triển vô tổ chức, có đặc tính phân chia mạnh, hình thành do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ. Do đó, cây non (nguyên vẹn hay được cắt khúc) hay mảnh thân
non của cây trưởng thành dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh (như 2,4-D) được áp dụng riêng lẽ hay phối hợp với citokinin. Ngược lại những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo. Nói chung, sự tạo mô sẹo in vitro nhờ auxin thuộc về 3 quá trình:
-Sự phản phân hóa của tế bào nhu mô: nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi.
-Sự phân chia của tế bào thượng tầng.
-Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi.
Hình 2.3a: mô sẹo
Mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo.Mô sẹo được thực hiện đối với các loại cây không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Mô sẹo được thu nhận từ nhiều loại mô khác nhau.
Ở phalaenopsis, mô sẹo được thu nhận từ chồi ngủ trên phát hoa bằng cách gây vết thương.
Trong quá trình phát triển, mô sẹo thường xuất hiện 2 loại tế bào:
-Loại tế bào xốp, không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng.
-Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ và tế bào chất đậm đặc.
Có 3 phương pháp gây vết thương như sau:
-Bỏ 2/3 chồi bằng cách cắt xéo theo trục hoa, song song trục thân.
-Cắt đôi chồi bằng cách cắt dọc trục cuống.
-Đâm thủng chồi theo chiều dọc bằng kim nhọn vô trùng.
Phương pháp 1 và 3 cho kết quả hình thành mô sẹo cao nhất trên môi trường Knudson C hoặc MS (Murashige và Skoog, 1962) thay đổi.Các chồi bất định hình thành mô sẹo trên bề mặt, sau đó các mô sẹo tiếp tục phát triển thành chồi. Khoảng 12 cây con có thể hình thành trong 6 tháng tiếp theo trên mỗi nốt, và sau đó các cây khác được tạo ra. Từ phương pháp này, tác giả tiếp tục phát triển phương pháp nhân giống mới thông qua mô sẹo.
Theo Thomas và Davey (1975) sự hình thành chồi mô sẹo được kích thích bởi:
-Các chất sinh trưởng đưa vào môi trường.
-Chất sinh sản trong nuôi cấy mô sẹo.
-Các chất có chứa sẵn trong mẫu nuôi cấy.
Khả năng hình thành chồi sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài (Gautheret, 1959) và sự hình thành tế bào xốp.
Mô sẹo được thu nhận khi nuôi cấy chóp rễ của cây gieo hạt in vitro có dạng màu vàng, các mô sẹo tiếp tục phát triển thành PLB và tái sinh cây con (Tanaka, 1976).
Khi nuôi cấy phát hoa non, tỉ lệ mô sẹo tạo thành trên các môi trường 1mg/l BAP là 26% và môi trường 5mg/l BAP là 53 % (Lin, 1986), mô sẹo này có màu vàng sáng. Mô sẹo còn được tạo ra khi nuôi cấy lát cắt mỏng phát hoa phalaenopsis (Kim và cộng sự, 1994).Các mô sẹo này sẽ tiếp tục biết hóa thành phôi, hình thành PLB và tái sinh cây con.
Ngày nay, người ta thường tạo mô sẹo từ nuôi cấy mô lá in vitro 5 x 5 mm và từ PLB, tạo mô sẹo từ PLB dễ hơn tạo mô sẹo từ mô lá khi nuôi cấy trên môi trường VW bổ sung 40g/l sucrose, 20% nước dừa và làm đông với gellan gum.
Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị soma lại cao hơn.
2.4. Tái sinh PLB từ mô lá.
Protocorm được Bernard dùng để mô tả những cấu trúc hình cầu nhỏ của hoa lan hình thành từ hạt. Các thể có cấu trúc tương tự hình thành từ các mẫu cấy in vitro không được gọi là protocorm.
PLB ( protocorm like body) (hình 2.4a) là thuật ngữ dùng để chỉ các cấu trúc tương tự protocorm được hình thành từ mô nuôi cấy hoặc mô sẹo in vitro.
Hình 2.4a: PLB của lan hồ điệp
M.tanaka và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu việc nhân giống vô tính cây phalaenopsis từ mô lá tại Đại học Osaka, Nhật Bản (1975, Tanaka và Sakanishi, 1977, 1980, 1985). Nguyên liệu ban đầu cho thí nghiệm là mô lá lấy từ cây trưởng thành và mô lá lấy từ cây con in vitro tạo thành nhờ gieo hạt. Tuy nhiên kết qủa cho thấy, các lá trưởng thành không có khả năng tạo PLB, trong khi đó lá của các cây con mới nảy mầm thì tạo được PLB. Điều này cho thấy khả năng tạo PLB giảm xuống khi độ tuổi cây giống tăng lên (Tanaka và cộng sự, 1975).
Hiện nay nguồn mẫu cung cấp tạo PLB là chồi non được tạo ra từ nuôi cấy phát hoa trong môi trường MS, mỗi mẫu tạo ra trung bình khoảng 3,8 PLB tại mặt cắt của mẫu lá. Các PLB này có thể biệt hóa tiếp tục trên môi trường lỏng Vacin-Went bổ sung
20% nước dừa và tiếp tục được tái sinh trên môi trường gieo hạt phalaenopsis. Quy trình này tạo được số lượng lớn cây giống đồng nhất về mặt di truyền.
Các mẫu phát hoa 1-1,5 cm mang một chồi bên của cây lai phalaenopsis Munssterland Stern “Alpha”, Babette “Symphony”, Windspiel “Duseldorf”, và Barbara Moler “Firecracker” cũng như mẫu lá tạo từ các phát hoa này được Hass-von Schmude sử dụng (1983, 1985) để tạo PLB (hình 2.4b). Khử trùng mẫu với dung dịch sodium hypochlorite 0,6%, mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS lỏng, lắc 100 vòng/phút trong vài tuần hoặc nuôi trên môi trường rắn. Các mẫu nuôi trong môi trường rắn tạo cây con, mẫu nuôi trong môi trường lỏng tạo PLB. Các nhà khoa học đã tìm thấy nhiều tế bào với nhân to tương tự ở phôi.Các mô này được cắt và nuôi cấy lỏng lắc trong môi trường MS như mô tả ở trên. Phương pháp này có thể tạo ra 30000 cây con từ một phát hoa phalaenopsis Babette “Symphony” trong vòng 3 năm, phalaenopsis Munssterland Stern “Alpha” tạo 10000 cây con trong 2 năm, phalaenopsis Barbara Moler
“Firecracker” tạo 3000 cây trong vong 18 tháng (Hass-von Schmude).