Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được thiết kế với các nội dung sau:
- Thực hiện mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh thực nghiệm của cao toàn phần tỏa dương in vivo.
+ Đánh giá khả năng hạ acid uric huyết thanh thực nghiệm của cao toàn phần tỏa dương trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kalioxonat.
+ Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần tỏa dương lên hoạt độ xanthin oxidase in vivo.
- Thực hiện mục tiêu 2: Sàng lọc khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro của cao toàn phần, các cao phân đoạn/chất tinh khiết, phân lập từ dược liệu.
+ Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cao toàn phần, các cao phân đoạn chiết xuất.
26
+ Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các chất tinh khiết, phân lập được từ phân đoạn có tác dụng ức chế XO mạnh nhất.
- Thực hiện mục tiêu 3: Xác định cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro của chất có tiềm năng nhất.
Phân lập chất tinh khiết
Xác định cơ chế ức chế XO in vitro Đánh giá tác dụng
hạ acid uric trên mô hình cấp
Đánh giá ảnh hưởng lên hoạt độ
XO in vivo
Phân đoạn có ưu thế nhất
Các chất tinh khiết Sàng lọc khả năng
ức chế XO in vitro
Chất có tiềm năng nhất Đánh giá tác dụng
hạ acid uric
Sàng lọc khả năng ức chế XO in vitro Cao toàn phần tỏa dương Các cao phân đoạn tỏa dương
DƯỢC LIỆU TỎA DƯƠNG Chiết xuất
Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
27 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm bằng kali oxonat
Cách tính liều cao toàn phần dựa trên liều dược liệu thường dùng trên người. Từ kết quả chiết xuất dược liệu, tính lượng cao toàn phần tương ứng. Áp dụng phương pháp ngoại suy tính liều dùng trên chuột nhắt. Từ mức liều này, tăng/giảm gấp đôi để được 3 mức liều thử nghiệm.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng, giống đực, trưởng thành.
Chuột được nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm và chia ngẫu nhiên thành 5 lô:
- Lô chứng: uống dung môi pha thuốc Na-CMC 0,5%.
- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
- Các lô thử: uống cao toàn phần tỏa dương ở các mức liều 300 mg/kg, 600 mg/kg và 1200 mg/kg.
Quy trình thí nghiệm
Áp dụng mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat tiêm màng bụng [7], [54], [57]. Chuột được cho uống dung môi, thuốc đối chiếu hoặc mẫu thử với thể tích 0,1 ml/10 g chuột vào một giờ nhất định trong liên tục 5 ngày. Trước khi uống thuốc hoặc dung môi 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường. Đến ngày thứ năm, chuột ở lô chứng, lô đối chiếu và lô thử được tiêm màng bụng kali oxonat với liều 500 mg/kg một giờ trước khi uống thuốc lần cuối. Sau khi cho chuột uống thuốc 2 giờ, lấy máu từ xoang hốc mắt chuột, để lắng tự nhiên trong khoảng 1 giờ ở nhiệt độ phòng rồi đem ly tâm với tốc độ 3.500 - 4000 vòng/phút, trong 10 phút. Bảo quản huyết thanh ở nhiệt độ - 20oC trong thời gian chờ định lượng acid uric. Định lượng acid uric bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 520 nm trên máy sinh hóa TC - 3300 Plus.
Quy trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.4.
28
Hình 2.4. Quy trình tiến hành thí nghiệm trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat
Thông số đánh giá
- Nồng độ acid uric huyết thanh chuột thực nghiệm.
- Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng:
I (%) =
Cc - Ct
x 100 (1) Cc
Trong đó:
Cc, Ct: nồng độ (àmol/l) của lụ chứng và lụ thử.
I %: tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng.
2.3.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của cao dược liệu lên hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thực nghiệm
Bố trí thí nghiệm
Áp dụng mô hình đánh giá ảnh hưởng lên hoạt độ XO gan chuột thực nghiệm [4], [7], [41].
Chuột nhắt trắng, đực, trưởng thành được chia ngẫu nhiên vào các lô:
- Lô chứng: uống dung môi pha thuốc Na-CMC 0,5%.
- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
29
- Các lô thử: uống cao toàn phần tỏa dương ở các mức liều 300 mg/kg, 600 mg/kg và 1200 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
Chuột được uống dung môi pha thuốc, thuốc đối chiếu allopurinol hoặc cao dược liệu với cùng thể tích 0,1 ml/10 g cân nặng vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 5 ngày trước khi làm thí nghiệm. Trước khi uống dung môi hoặc thuốc 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường.
Phương pháp chiết enzym
Kết thúc thực nghiệm, giết chuột bằng cách kéo dãn đốt sống cổ, lấy ngay gan từng chuột. Cân ngay 1 g gan, cắt thành các mảnh nhỏ, cho vào ống nghiền đồng thể đã để lạnh và có sẵn 1ml dung dịch đệm phosphat lạnh (pH = 7,5).
Nghiền gan trong điều kiện lạnh đến khi thu được dịch đồng thể, sau đó thêm dần đệm lạnh để thu được dịch đồng thể với tỷ lệ gan : đệm tương ứng là 1 : 5.
Dịch nghiền thu được đem ly tâm lạnh ở 0oC với tốc độ 3000 vòng trong 10 phút. Lấy phần dịch nổi tiếp tục đem ly tâm lạnh ở 0oC với tốc độ 10000 vòng trong 60 phút. Phần dịch trong thu được sau khi ly tâm dùng để xác định hoạt độ enzym. Toàn bộ các bước của thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện lạnh (môi trường nước đá đang tan).
Phản ứng enzym
Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm gồm 2,90 ml đệm phosphat (0,05 M, pH 7,5); 2,50 ml dung dịch đệm cơ chất gồm xanthin 0,12 mM, EDTA 0,192 mM, kali oxonat 2,2 mM. Trước khi phản ứng, dịch enzym và cơ chất được ủ ở 37oC trong 15 phút. Thời gian phản ứng được tính từ lúc thêm 0,1 ml dịch enzym vào dung dịch cơ chất. Tiếp tục ủ trong 30 phút. Hút 200 μl dịch sau phản ứng ra đĩa UV 96 giếng Costar để tiến hành đo quang ở bước sóng 290 nm.
Song song tiến hành với mẫu trắng: 5,40 ml đệm phosphat pH 7,5 + 0,1 ml enzym.
30
Thông số đánh giá
- Mật độ quang ∆OD của acid uric - sản phẩm được tạo ra trong phản ứng giữa cơ chất xanthin với enzym XO được chiết ra từ gan chuột ở các lô.
- Tỷ lệ giảm mật độ quang của lô thử so với lô chứng được tính theo theo công thức:
I (%) =
ΔOD chứng – ΔOD thử
x 100% (2) ΔOD chứng
Trong đó:
ΔOD chứng = OD chứng – OD trắng chứng
ΔOD thử = OD thử - OD trắng thử
2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa UV 96 giếng Costar
Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase trên đĩa UV 96 giếng Costar 3635 được triển khai theo phương pháp của Noro trong ống nghiệm và của Nguyễn Thị Thanh Mai trên đĩa UV 96 giếng và được điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [6], [56], [58].
Tác dụng ức chế XO của các dược liệu/phân đoạn/chất chiết tách được đánh giá theo giá trị IC50, là giá trị nồng độ (tính toán theo lý thuyết) tại đó mẫu thử ức chế 50% sự tạo thành acid uric trong hỗn hợp phản ứng so với mẫu chứng.
Với từng mẫu thử được lựa chọn, thiết lập dãy nồng độ khảo sát, từ đó xác định IC50 và giới hạn khoảng tin cậy.
Nguyên tắc của phương pháp
Dựa trên sự tạo thành acid uric từ xanthin nhờ sự xúc tác của xanthin oxidase. Lượng acid uric tạo ra tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym và được định lượng bằng phương pháp đo quang ở 290 nm. Mẫu có chất thử được so sánh với mẫu không có chất thử để đánh giá tác dụng ức chế enzym của chất thử.
31
Bố trí thí nghiệm
Trên mỗi đĩa UV 96 giếng Costar 3635 gồm có: giếng chứng, giếng đối chiếu (allopurinol) và các giếng thử. Bố trí hỗn hợp thử trong các giếng được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng Giếng
chứng
Giếng đối chiếu
Các giếng thử
Mẫu thử ở cỏc nồng độ nghiờn cứu 0 0 50 àl
Allopurinol ở cỏc nồng độ nghiờn cứu 0 50 àl 0 àl
Đệm phosphat pH 7,5 85 àl 35 àl 35 àl
Xanthin 60 àl 60 àl 60 àl
XO 30 àl 30 àl 30 àl
HCl 25 àl 25 àl 25 àl
Tổng thể tớch 200 àl 200 àl 200 àl
Quy trình thực hiện được mô tả ở hình 2.5.
- Mẫu thử là cao phân đoạn/chất chiết tách, phân lập từ dược liệu ở các nồng độ khác nhau.
- Song song với mỗi mẫu chứng, mẫu đối chiếu, mẫu thử có một mẫu trắng của chứng, trắng của đối chiếu, trắng của thử được tiến hành tương tự nhưng thay đổi trình tự cho enzym vào giếng (enzym được cho vào sau HCl 1N).
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Thông số đánh giá
- I (%) ức chế được tính theo công thức (2).
- Nồng độ ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase (IC50) của từng phân đoạn/chất chiết tách, phân lập từ dược liệu.
32
Hình 2.5. Qui trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro
2.3.4. Phương pháp xác định cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro của chất có tiềm năng nhất
Cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro của chất có tiềm năng nhất được xác định dựa trên việc xây dựng đồ thị Lineweaver - Burk với nồng độ cơ chất xanthin thay đổi theo phương pháp của Hoàng Thị Thanh Thảo [6].
33
Bố trí thí nghiệm
Hình 2.6. Quy trình xác định cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro - Song song với mỗi mẫu thử có một mẫu trắng của thử được tiến hành
tương tự nhưng enzym được cho vào sau khi cho dung dịch HCl 1N.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Đánh giá kết quả
- Xây dựng đồ thị Lineweaver - Burk cho enzym XO khi có mặt và không có mặt chất ức chế.
- Dựa vào đồ thị xác định cơ chế ức chế enzym của chất có tiềm năng nhất được phân lập từ dược liệu.
34 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được lưu trữ và xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007. Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0.
Kết quả được biểu diễn dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình lô, SE:
sai số chuẩn) hoặc tỉ lệ phần trăm. So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng hậu kiểm LSD để so sánh giá trị trung bình của các lô thử so với lô chứng. Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
Tính IC50 và khoảng tin cậy 95% của IC50 bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0
35