1.1. Cơ sở khoa học
1.1.4. Một số nguyên lý cơ bản về đông lạnh tinh dịch
Tinh trùng là một tế bào sống, vận động ngoài cơ thể, rất mẫn cảm với sự thay đổi của điều kiện môi trường xung quanh. Trong quá trình đông lạnh tinh dịch, ngoài việc dựa vào nguyên lý, lý học, hóa học còn phải dựa vào nguyên lý sinh học và mối tương tác của chúng sao cho tinh trùng khi đông băng vẫn giữ nguyên hình thái, trao đổi chất tạm ngừng và sau khi giải đông tinh trùng vẫn hoạt động bình thường (Ditto, 1992) [49]; Nguyễn Xuân Hoàn, 1994) [17].
1.1.4.1. Hiện tượng đông băng chất lỏng
Khi một chất lỏng được làm lạnh, quá trình đông băng xảy ra, quá trình này gồm các giai đoạn: Tiền đông băng (Supercooling), tạo nhân (nucleation), giãn nở của tinh thể băng (growth of ice crystals) và kết tinh hoàn thiện tại một nhiệt độ nhất định (Eutectic Point), diễn biến nhiệt độ trong quá trình đông băng theo đồ thị như hình số 8. Khi đông lạnh tinh dịch sự tạo tinh thể và giãn nở tinh thể băng chỉ xảy ra trong điều kiện đông lạnh chậm, còn khi đông lạnh cực nhanh thì hai hiện tượng trên không xảy ra, mà xảy ra hiện tượng thủy tinh hóa (Vitrification), tạo ra các hạt băng nhỏ li ti, loại trừ được
hiện tượng giãn nở tinh thể (Mazur, 1989) [63]. Quá trình làm lạnh và đông băng của một dung dịch sảy ra như hình 7 và hình 8.
Hình 1.7. Quá trình đông lạnh dung dịch (Hiroshi, 1992) [53]
Hình 1.8. Đông lạnh nước muối sinh lý (Hiroshi, 1992) [53]
a. Hiện tượng tiền đông băng
Khi làm lạnh một chất lỏng nếu tốc độ làm lạnh chậm, nhiệt độ của chất lỏng hạ xuống điểm đông băng, thậm chí còn xuống thấp dưới điểm đông băng mà chất lỏng vẫn giữ nguyên trạng thái, chưa có tinh thể băng.
Quá trình này gọi là tiền đông băng (Supercooling). Trạng thái của chất lỏng không ổn định, chỉ cần một tác động nhẹ sẽ xảy ra hiện tượng tạo nhân, hoặc phá vỡ hiện tượng tạo tinh thể, thay vào đó sẽ xảy ra hiện tượng kết hạt (Ditto, 1992) [49].
b. Hiện tượng tạo nhân tinh thể
Một chất lỏng đông băng phải có một hạt nhỏ làm “nhân” cho các phân tử nước lần lượt bám vào để hình thành tinh thể. Hiện tượng tạo nhân tinh thể có hai hình thức. Ở nước nguyên chất việc tạo nhân là từ các hạt tinh thể nước, còn ở dung dịch có chất tan, các hạt chất tan này sẽ là nhân cho các phân tử nước bám vào tạo tinh thể. Vì thế ở trường hợp đầu việc tạo tinh thể nước xảy ra ở nhiệt độ thấp hơn so với trường hợp sau (Barios, 1995 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999) [11].
c. Sự dãn nở của tinh thể băng
Khi đông băng các tinh thể hình thành, thể tích của chúng sẽ tăng, sự dãn nở thể tích này giải phóng năng lượng tiềm ẩn sẵn trong các phân tử nước, làm nhiệt độ của dung dịch tăng đến điểm đông băng, mặc dù quá trình làm lạnh vẫn tiếp tục nhưng tại thời điển này nhiệt độ của dung dịch không đổi trong một giai đoạn, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tốc độ đông băng. Nếu tốc độ đông băng nhanh thì giai đoạn trên sẽ ngắn và sự rãn nở của tinh thể băng sẽ bị loại trừ và thay vào đó là hiện tượng thuỷ tinh hoá (Ditto, 1992) [49].
d. Điểm đông băng hoàn chỉnh và sự kết tinh tinh thể của dung dịch Khi hiện tượng làm lạnh tiếp tục, lượng tinh thể nước tăng lên và pha loãng giảm dần, nồng độ dung dịch tăng. Dung dịch sẽ tách làm hai phần: Pha tinh thể nước và pha lỏng. Nếu hiện tượng làm lạnh tiếp tục thì pha lỏng sẽ bị biến mất tại một nhiệt độ nhất định. Điểm đó gọi là điểm đông băng hoàn chỉnh của một dung dịch (Rodriguez và Duverger, 1997 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999) [11]
1.1.4.2. Ảnh hưởng của đông băng lên tế bào tinh
Tinh trùng rất mẫn cảm và luôn tồn tại trong tinh thanh, khi đông lạnh, tinh trùng chịu sự tác động của các hiện tượng sau (Ditto, 1992) [49]:
a. Hiện tượng đông băng nội bào
Tinh trùng bị chết, hoặc mất năng lực hoạt động, khi cấu tạo nội bào bị phá vỡ do việc hình thành tinh thể nước nội bào. Nếu tinh trùng nằm trong dung dịch muối sinh lý có thể loại trừ được hiện tượng này vì được các phân tử nước dạng lỏng bao quanh, mặc dù dung dịch ngoại bào bắt đầu đông băng ở nhiệt độ - 20C hoặc -50C. Như vậy quá trình đông băng sẽ không làm hại tới tế bào tinh trùng cho đến khi nước nội bào đông lạnh mặc dù dung dịch môi trường bao quanh đã đông lạnh (Mazur, 1989) [63].
b. Sự mất nước của tế bào tinh trùng
Nếu nước nội bào thoát ra ngoài, tinh trùng sẽ bị teo lại, nhưng vẫn có tinh trùng sống được ở nhiệt độ thấp hoặc siêu thấp chẳng hạn -1960C. Trong quá trình làm lạnh tinh dịch, nước ngoại bào đông băng làm áp suất thẩm thấu chênh lệch, nước nội bào thoát ra khỏi ngoài tinh trùng và tiếp tục đông băng phần ngoại bào. ở -150C có 80 % nước nội bào bị đông lạnh và được thoát ra ngoài do đó ngăn ngừa được hiện tượng đông băng nội bào (Maria, 1995 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999) [11]. Ở -300C phần lớn nước nội bào thoát ra khỏi tinh trùng. Với tinh trùng có thể chịu lạnh ở -300C, có thể tồn tại được ở - 1960C, còn tế bào bình thường thì bị phá hủy, tuy nhiên cũng có tinh trùng không có khả năng chịu lạnh do các biến đổi lý - hoá - sinh xảy ra. Những biến đổi hóa sinh có thể xảy ra trong tế bào bị phá hủy ở nhiệt độ thấp như vậy, bao gồm thay đổi trong cấu trúc nội bào, do thay đổi trong cấu trúc nội bào, do thay đổi liên kết hydro ở chuỗi polyme. Sự đông đặc hóa không thể quay trở lại như cũ và sự kết tủa protein do mất nước của nguyên sinh chất (Aritani, 1989) [40].
c. Hiện tượng đông băng ngoại bào
Trong khi đông lạnh ngoại bào, sẽ xảy ra hiện tượng nồng độ chất hòa tan kèm theo áp suất thẩm thấu tăng lên và kéo theo những thay đổi về độ pH.
Các chất điện giải như Natri và kali có nhiều nhất trong tinh thanh và chúng tồn tại ở dạng Natri clorua, Kali clorua. Ở điểm eutectic, nồng độ các muối này cao nhất, là khi nhiệt độ -21,20C đối với Natri clorua và -11,10C đối với Kali clorua và biên độ nhiệt độ này có hại cho tinh trùng. Do có sự tăng nồng độ chất hòa tan đi kèm với tăng áp suất thẩm thấu cũng như pH thay đổi tất cả xảy ra trong biên độ nhiệt độ này, mà người ta không rõ cái gì có tác hại nhất đến tinh trùng (Maria, 1995 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999) [11].
d. Chuyển động của nước và sự dãn nở của tinh thể nước gây ra huỷ hoại cơ học đối với tinh trùng
Hiện tượng giải đông giống như đông lạnh cũng làm huỷ hoại tinh trùng do chênh lệch áp suất thẩm thấu, sự di chuyển của nước qua màng tế bào tinh trùng và sự dãn nở của các tinh thể nước đá trong quá trình đông lạnh hoặc tan băng có thể gây tổn thương tế bào tinh trùng. Các bọt khí tồn tại trong tinh thể băng cũng có thể gây tổn hại tinh trùng trong quá trình này (Maria, 1995 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999) [11].
Các tổn thương trên có thể loại trừ được bằng cách giảm kích cỡ các tinh thể băng và làm tăng số lượng tinh thể nhỏ hơn. Tốc độ làm lạnh nhanh có thể làm tăng tinh thể nhỏ đó khi đông lạnh. Nói cách khác là khi làm lạnh nhanh sẽ ngăn chăn được sự lớn lên của các tinh thể băng trong dung dịch và tạo điều kiện đông lạnh giống như thủy tinh hóa. Tuy vậy, băng thủy tinh gồm các tinh thể băng sẽ không ổn định ở nhiệt độ trên -1290C và sự chuyển động và tái tinh thể hóa của chúng sẽ gây tổn hại tế bào tinh trùng. Chuyển động sẽ tăng lên ở trên -400C và dễ gây tổn hại tinh trùng đặc biệt là ở khoảng -200C (Hiroshi, 1992) [53].