CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp thực nghiệm
Chủng giống Streptomyces 52.13 được nuôi cấy và giữ giống như sau:
- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT1, ủ cho phát triển ở 28-29°C.Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền.
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
- Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
- Tiến hành:
+ Tạo hỗn dịch VSV: Lấy 1 vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2.5 ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 16-24h (với VK) để tạo thành hỗn dịch VSV có
nồng độ 106-108tế bào/ml.
+ Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào đĩa Petri 20ml/đĩa.
+ Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:
• Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50C, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định.
• Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định.
• Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT đã cấy VSV kiểm định. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng.
+ Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định.
+ Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:
2
1 1
( )
1
n n
i i
i i
D D D
D s
n n
= =
−
= =
−
∑ ∑
Trong đó:
D(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn Di(mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh
n: Số thực nghiệm tiến hành song song (Thông thường n=3) 2.3.3. Phương pháp cải tạo giống
- Mục đích: sử dụng kết hợp các phương pháp cải tạo giống thích hợp nhằm nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp KS của chủng giống Streptomyces 52.13 và tạo ra các biến chủng có HTKS mạnh.
2.3.3.1.Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên
- Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 52.13, cho vào10ml nước vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước).Pha loãng tương tự đến nồng độ 10-6 bằng nước vô trùng.
- Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ 10-4, 10-5, 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT1 trong đĩa Petri. Dùng que trang vô trùng dàn đều lên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng. Cho vào tủ ấm 28°C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.
- Sàng lọc ngẫu nhiên: sau 6 ngày nuôi lấy các đĩa petri ở ra quan sát, chọn lấy các khuẩn lạc phát triển tốt, riêng rẽ. Cấy zigzag ra các đĩa khác (lấy từ 30-33 đĩa). Nuôi trong tủ ấm 6 ngày rồi lấy ra thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.
2.3.3.2. Đột biến bằng ánh sáng UV
- Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 52.13, cho vào 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử
ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó dùng 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến 10-6làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa Petri vô trùng.
- Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ
10-1 đựng trong đĩa Petri được chiếu ánh sáng UV (λ=254nm) với khoảng cách 60cm, thời gian 5 phút, sau đó lấy ra, để chỗ tối 2h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5 bằng nước vô trùng.
- Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng 10-6 và 0,1ml hỗn dịch đã đột biến ở các nồng độ 10-4 và 10-5 vào các đĩa Petri có chứa MT1, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử
trên bề mặt thạch, mỗi nồng độ làm 3 đĩa song song. Các đĩa Petri sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28°C trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:
% độ sống sót = m
o
N
N ×10-6+k×100%
Trong đó: 10-k: nồng độ hỗn dịch bào tử sử dụng.
Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến No: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
- Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên. Làm song song mẫu chứng. Phần trăm biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:
% biến đổi hoạt tính = i 100%
o
D D × Trong đó:
Di: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau ĐB Do: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
- Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả để lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.3.3.Đột biến bằng phương pháp hóa học
- Pha hỗn dịch bào tử tương tự như phương pháp đột biến bằng tia UV - Tiến hành đột biến bằng hóa chất :
Cho vào ống nghiệm chứa 9ml hỗn dịch bào tử 0,07 – 0,075g NaNO2, lắc cho tan hết. Thêm HCl 1N vào đến pH = 4,5 rồi để yên 2 phút. Thêm tiếp NaOH vào đến pH=7,5 rồi để yên 1 – 2 phút. Pha loãng đến nồng độ 10-4 , 10-5.
- Nuôi cấy sau ĐB tương tự như đột biến UV
- Đếm các khuẩn lạc, tính % độ sống sót và tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau đột biến và thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.
2.3.4. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh
- Mục đích: tìm ra MT dịch thể lên men chìm tốt nhất và biến chủng có khả
năng tổng hợp KS cao nhất trong MT dịch thể.
- Tiến hành
+ Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 52.13 sau khi nuôi cấy trên thạch nghiêng (MT1) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT1dt bằng 10ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
+ Lên men chọn MT:
Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên nhiều MTdt khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất. Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml dung dịch các MT dinh dưỡng (mỗi MT làm 2 bình để so sánh) với tỷ lệ
Vgiống:Vmôi trường = 1:10. Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ
quay 140 vòng/phút. Sau 120h lên men lấy các bình ra, lọc loại bỏ sinh khối. Thử
HTKS của dịch lọc, chọn MT có khả năng lên men tốt nhất.
+ Lên men chọn chủng
Các biến chủng tốt nhất được giữ lại sau các lần cải tạo giống đem đi tạo giống cấp 1. Các giống cấp 1 này được cấy vô trùng sang các bình nón chứa MTdt
tốt nhất đã được chọn ra ở trên. Sau khi lên men 120h lấy dịch lọc đi thử HTKS nhằm chọn ra biến chủng có khả năng lên men tốt nhất.
2.3.5. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ
- Mục đích: Chuyển KS từ dịch lọc sang dịch chiết dung môi hữu cơ. Xác định dung môi và pH chiết tối ưu.
- Tiến hành: Dùng phương pháp chiết 1 lần.
+ Dịch lọc chỉnh về các pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng NaOH 1M và HCl 1M.
+ Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với nhiều dung môi khác nhau: Dịch lọc và
dung môi cho vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi:Vdịch lọc = 1:5. Sau đó lắc kỹ trong 1- 2 phút. Để yên 1h cho phân lớp. Tách riêng lấy lớp dung môi và dịch lọc.
+ Sau mỗi lần chiết, lấy lớp dung môi và lớp dịch lọc thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp khoanh giấy lọc.
2.3.6. Sơ bộ xác định thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng - Mục đích: Sơ bộ xác định các thành phần kháng sinh trong dịch lọc, làm cơ sở chọn hệ dung môi thích hợp cho chạy sắc kí cột, xác định thành phần KS trong các phân đoạn thu được sau chạy cột.
- Tiến hành:
+ Cắt bản mỏng có kích thước thích hợp, hoạt hóa ở 110°C/30 phút. Dùng bút chì kẻ vạch đánh dấu điểm chấm.
+ Pha hỗn hợp dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), lót giấy lọc xung quanh thành bình ,để yên bình khoảng 1h để
bão hòa dung môi.
+ Dùng ống mao quản đường kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc ký lên bản mỏng. Chấm nhiều lần, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 50°C.
+ Đặt bản mỏng vào bình sắc ký. Chú ý không để bản mỏng bị lệch và mức dung môi không được ngập vết chấm.
+ Xác định vết theo các phương pháp sau:
• Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt trùng, đổ một lớp vừa phải MT thạch thường đã cấy VSV kiểm định sao cho bản mỏng chìm trong thạch. Để vào tủ 37°C. Sau 18-24h lấy ra quan sát. Vòng vô khuẩn sẽ xuất hiện nếu có kháng sinh.
• Soi đèn tử ngoại:vết chất thử sẽ hiện màu dưới đèn tử ngoại.
• Phương pháp hiện màu hóa học: Bản mỏng được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 70°C trong 10’ để phát hiện vết.
+ Đo và tính hệ số Rf (Retardation factor).Công thức:
Rf = Dv / Ddm
Trong đó: Dv: Khoảng cách từ điểm chấm tới tâm của vòng vô khuẩn hoặc vết hiện hình dưới đèn tử ngoại hay hiện màu bằng thuốc thử hóa học.
Ddm: Chiều dài quãng đường dung môi.
2.3.7. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay
- Mục đích: thu bột kháng sinh thô tạo điều kiện thuận lợi cho bảo quản và
chuẩn bị cho tinh chế kháng sinh.
Pha dung môi hữu cơ thu được sau khi chiết được cất quay bằng máy cất chân không đến cắn. Đổ 1 lượng nhỏ methanol vào bình nhằm hòa tan cắn rồi cho ra đĩa petri. Sấy trong tủ sấy ở 50°C đến khô. Cạo, thu bột kháng sinh thô vào ống sạch, nắp kín, bảo quản trong tủ lạnh.
2.3.8. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột
- Mục đích: loại bỏ các tạp chất, chất phụ nhằm thu được KS tinh khiết.
-Tiến hành
- Pha hệ dung môi chạy theo đúng tỷ lệ.
- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột có đường kính 1cm, dài 50cm được rửa sạch, tráng cồn, sấy khô. Cân khoảng 8g hạt Silicagel nhồi cột, hoạt hóa ở 110°C trong
30 phút, đem hòa thành hỗn dịch với dung môi chạy và đưa lên cột, ổn định cột trong 30 phút.
- Đưa mẫu thử lên cột: Bột kháng sinh thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol rồi trộn với khoảng 2g Silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50°C cho bay hết methanol rồi cho lên cột, để 30 phút cho bão hòa.
- Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch, mỗi phân đoạn 5ml.
- Phát hiện và xác định các phân đoạn chứa kháng sinh cần tách: Thử HTKS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất. Các phân đoạn chính là các phân đoạn có Rf tương đương và có HTKS mạnh.
- Các phân đoạn chính sau khi chạy cột được gộp vào đĩa Petri sạch, sấy ở 50°C đến khô. Cạo thu bột tinh thể KS vào ống nghiệm sạch.
2.3.9.Kết tinh lại KS
- Mục đích: Kết tinh lại KS nhằm thu được KS có độ tinh khiết cao hơn - Tiến hành:
Bột KS thu được sau chạy sắc ký cột ở trên được hòa tan trong khoảng 1ml ethylacetat vào ống nghiệm. Thêm vào ống nghiệm đó một lượng n- hexan với tỉ lệ
(Vethylacetat :Vn-hexan = 1: 5). Lắc đều. Các tinh thể KS sẽ được kết tinh lại dưới đáy và trên thành ống nghiệm. Cất trong tủ lạnh và dung đũa thủy tinh cạo trên thành ống để tăng khả năng kết tinh. Sau đó lọc loại bỏ nước cái nhờ phễu lọc Buchner thu tinh thể KS tinh khiết. Sấy khô ở 50ºC. Cân ,tính hiệu suất quá trình tinh chế.
2.3.10. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được
Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ UV, IR, MS.Các thông số này sẽ bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được