2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Vị trí lấy mẫu: Các chủng NS được phân lập từ RNM ở các xã An Thới Đông, Tam Thôn Hiệp, Long Hoà, Lý Nhơn khu Lâm Viên Cần Giờ thuộc Huyện Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh.
Lấy mẫu được tiến hành theo mùa (mùa mưa, đầu mùa khô, và giữa mùa khô); vị trí lấy mẫu (trong rừng, cách khu dân cư và biển tối thiểu 2km).
Mẫu bao gồm: thân cành chết khô còn trên cây, thân cành mục trên đất, lá tươi trên cành, lá vàng mới rụng, lá mục trên mặt đất, đất bề mặt và cách bề mặt từ 5-10cm.
Các VSV kiểm định gồm: E.coli, B. subtilis do viện Paster thành phố Hồ Chí Minh cung cấp 2.1.2. Hoá chất
- Các loại đường chuẩn: glucose, saccarose, lactose, mantose, galactose (Trung Quốc).
- Các loại muối: KNO3, (NH4)2SO4, NaNO3, NaCl, KCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, FeSO4, Na2HPO4 (Trung Quốc).
- Các hợp chất khác: Yeast extract (Mỹ), CMC (Nhật), Maelt extract (Đức), pepton (Anh), kitin, casein, Tween-80 ( Trung Quốc), dầu DO , Agar ( Việt Nam).
- Chất kháng sinh Chloramphenycol (Ấn Độ) 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ:
- Nồi hấp áp lực Huxlex (Đài Loan) - Tủ sấy Memmert (Đức)
- Kính hiển vi quang học, máy chụp hình kĩ thuật số Olympus 5.1 (Nhật Bản) - Máy đo pH Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc)
- Máy li tâm Rotina ( Đức) - Tủ lạnh National – (Nhật Bản) - Tủ giữ mẫu Sanyo – (Nhật Bản).
- Máy giập mẫu. ( Đức) - Máy lắc Gerhardt – (Đức)
- Cân phân tích Sartorius –( Đức) 2.1.4 . Môi trường
- MT1 : MT Czapek - Dox cải tiến ( phân lập nấm sợi) [5], [ 12],
NaNO3 : 3,5 g
K2HPO4 : 1,5g
MgSO4.7H2O : 0,5g
KCl : 0,5g
FeSO4.7H2O : 0,01g (vêt)
Glucoza : 20 g
Agar : 20 g
Nước biển : 1000 ml
PH = 6,5. khử trùng 1atm/30 phút.
- MT2: Yeast extract agar ( YEA ) - Giữ giống và khảo sát khả năng sinh kháng sinh [5], [ 12].
Cao nấm men : 5 g
Glucoza : 20 g
Agar : 20 g
Nước biển : 1000ml
PH = 5,5-6,0. khử trùng 1atm/30 phút.
- MT3 : MT Potato glucose agar ( PGA) - định loại nấm sợi [5], [ 12].
Nước chiết khoai tây : 200ml
Glucoza : 20 g
Agar : 20 g
Nước biển : 1000ml
PH = 5,5-6,0. khử trùng 1atm/30 phút + Cách chế nước chiết khoai tây:
Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. Cân 200g khoai tây đã gọt vỏ, xắt hạt lựu, thêm 1lít nước cất, đun sôi trong vòng 30 phút, lọc lấy dịch trong.
- MT 4 : MT Malt Extract Agar (MEA) - khảo sát khả năng sinh kháng sinh [2].
Cao malt : 20 g
Peptone : 1 g
Glucoza : 20 g
Agar : 20 g
Nước biển : 1000 ml
PH = 5,5-6,0. khử trùng 1atm/30 phút - MT5 : MT thử hoạt tính cellulase[2], [5].
NaNO3 : 3,5 g
K2HPO4 : 1,5g
MgSO4.7H2O : 0,5g
KCl : 0,5g
FeSO4.7H2O : 0,01g (vêt)
CMC : 20 g
Agar : 20 g
Nước biển 1000 ml
PH = 6,5. khử trùng 1atm/30 phút.
- MT6 : MT thử hoạt tính protease [3], [4].
NaNO3 : 3,5 g
K2HPO4 : 1,5g
MgSO4.7H2O : 0,5g
KCl : 0,5g
FeSO4.7H2O : 0,01g (vêt)
Cazein : 20 g
Agar : 20 g
Nước biển 1000 ml
PH = 6,5. khử trùng 1atm/30 phút.
- MT 7 : MT thử hoạt tính amylase[ 24].
NaNO3 : 3,5 g
K2HPO4 : 1,5g
MgSO4.7H2O : 0,5g
KCl : 0,5g
FeSO4.7H2O : 0,01g (vêt)
Tinh bột tan : 20 g
Agar : 20 g
Nước biển 1000 ml
PH = 6,5. khử trùng 1atm/30 phút.
- MT8 : MT thử hoạt tính kitinase [24].
NaNO3 : 3,5 g
K2HPO4 : 1,5g
MgSO4.7H2O : 0,5g
KCl : 0,5g
FeSO4.7H2O : 0,01g (vêt)
Bột kitin : 20 g
Agar : 20 g
Nước biển 1000 ml
PH = 6,5. khử trùng 1atm/30 phút.
+ Cách chiết kitin từ vỏ, đầu tôm - Vỏ, đầu tôm rửa sạch, sấy khô.
- Xử lý protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70 -75oC trong 4 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước cất.
- Tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở 26 -30 oC trong 16 giờ, rửa sạch - Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh.
MT 9 : MT Meat peptone agar (MPA) - Nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn kiểm định
Pepton : 5 g
NaCl : 5 g
Cao thịt : 5 g
Agar : 20 g
Nước cất 1000ml
PH = 7,5 khử trùng 1atm 30 phút 2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật
2.2.1.1. Phương pháp lấy mẫu [4], [5], [31], [41]
Chúng tôi phân lập các chủng NS ở RNM Cần Giờ từ các mẫu đất, lá và cành. Các mẫu đất gồm: đất mặt ( ký hiệu ĐM ), đất từ 5- 10cm (ĐS), các mẫu lá gồm: lá vàng trên cây ( LV), lá mục dưới đất ( LM), các mẫu cành gồm: cành khô ( CK ) và cành mục (CM).
Tiến hành thu mẫu vào 3 đợt, tháng 9, tháng 12 năm 2008 và tháng 3 năm 2009 tại 4 xã Long Hòa, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn Hiệp huyện Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh.
Cách lấy mẫu : Đối với mẫu cành và lá, dùng dao, kéo vô trùng cắt lấy khoảng 10 g mẫu cho vào túi nilông vô trùng buộc kín, đánh số, ghi địa danh, ngày tháng lấy mẫu và bảo quản. Đối vối mẫu đất thì dùng dao vô trùng lầy 10 g đất mặt hoặc gạt bỏ lớp đất mặt và lấy mẫu từ 5-10cm. Các mẫu sau khi lấy xong thì được bảo quản lạnh và phân lập ngay trong vòng 24 giờ [ 24], [31].
2.2.1.2. Phân lập mẫu theo phương pháp pha loãng mẫu a. Nguyên tắc
Tách rời bào tử NS, nuôi cấy trên MT thạch đĩa để cho mọc thành các KL riêng rẽ. từ các KL riêng rẽ cấy truyền sang MT thạch nghiêng từ một hoặc nhiều lần cho đến khi các chủng thuần khiết.
b. Tiến hành
Cân 10 g mẫu đất, thân, lá ( đã nghiền nhỏ ) cho vào bình tam giác, cho thêm vào bình 90 ml nước biển vô trùng và cho vào máy lắc 200 vòng / phút lắc 20 phút, thu lấy dịch lọc ta có độ pha loãng 10 -1 .
Lắc đều rồi hút 1ml dịch 10-1 cho vào ống nghiệm đựng 9 ml nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loảng 10-2 . Tiếp tục pha loãng như thế cho đến nồng độ 10-3 , 10-4, 10-5 , 10-6
Dùng pipet hút 0,1 ml dịch lọc ở các nồng độ 10-3 , 10-4, 10-5 , 10-6 nhỏ lên hộp petri có chứa ( MT2 ) . Dùng que cấy trang dàn đều khắp bề mặt thạch, giữ nguyên que trang tiếp tục trang lên đĩa 2 và 3. Lật ngược hộp lại gói bằng giấy báo và nuôi ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày.
Tách các khuẩn lạc riêng rẽ, cấy chuyền cho đến khi đạt độ thuần khiết thì cấy chuyền sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm tiếp theo. [20]
Yêu cầu các chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và có ký hiệu riêng biệt[6],[7],[22].
2.2.1.3. Phương pháp giữ giống trên MT thạch có lớp dầu khoáng a. Nguyên tắc :
Bảo quản để không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của chủng giống bằng cách tạo MT yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng của NS.
b. Tiến hành:
Cho một lượng dầu khoáng vào ống eppendofy, khử trùng ở 121 oC 30 phút, để nguội.
NS cần bảo quản đã được nuôi cấy trong ống nghiệm 3-5 ngày, dùng que cấy vô trùng lấy một ít bào tử NS cho vào ống eppendofy, đậy nắp và dùng keo parafin quấn quanh miệng ống và bảo quản ở điều kiện lạnh[4],[5],[6],[12].
2.2.1.4. Phương pháp quan sát hình thái NS
* Quan sát đại thể NS
Quan sát đại thể NS bằng cách tạo KL khổng lồ, cách tiến hành như sau:
- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước cất vô trùng
- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ các ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm đựng 5 ml nước cất vô trùng , lắc đều tạo dung dịch huyền phù
- Dùng que cấy móc nhúng vào dịch huyền phu rồi nhanh chóng chấm một điểm vào giữa đĩa petri có chứa MT3 .
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-7 ngày để tạo khuẩn lạc khổng lồ, hàng ngày lấy ra quan sát và mô tả các điểm sau:
+ Tốc độ phát triển của KL (đo đường kính của khuẩn lạc).
+ Hình dạng, kích thước và mép KL.
+ Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của KL (cả mặt trái và mặt phải).
+ Giọt tiết, sắc tố tiết vào môi trường [4],[5],[6].
Quan sát vi thể NS Phương pháp phòng ẩm
Chuẩn bị các đĩa petri có chứa MT3 thật mỏng ( khoảng 1mm ) Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch có đường kính 8 mm
Đặt một miếng thạch mỏng có kích thước 8 mm lên một miếng lam vô trùng. Cấy NS vào xung quanh của miếng thạch, đậy lamen lên. Cho miếng lam vào giữa đĩa petri có sẵn một miếng giấy lọc hoặc bông đã được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Đậy nắp đĩa petri lại và ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày.
Sau 2 - 3 ngày, lấy lam kính ra, khẽ gỡ lá kính, nhỏ vào một giọt lactophenol và quan sát hình thái NS bằng kính hiển vi ở vật kính 40 và 100 về các đặc điểm như
– Khuẩn ty: hình dáng, màu sắc, vách ngăn, sự phân nhánh.
– Đặc điểm cơ quan sinh bào tử: cuống sinh BT, Thể bình và BT Phương pháp lamen nghiêng
Cấy các chủng NS váo các đĩa petri có chứa MT3 sau đó, lấy một tấm lamen vô trùng đặt nghiêng một góc 30 – 45oC so với bề mặt thạch, nuôi ở nhiệt độ phòng 2- 3 ngày.
Sau 2-3 ngày lấy lá kính ra nhỏ vào một giọt lactophenol và quan sát hình thái nấm sợi bằng kính hiển vi ở vật kính 40 và 100 về các đặc điểm như trên. [ 5 ],[6]
2.2.2. Các phương pháp hoá sinh
2.2.2.1. Kiểm tra hoạt tính enzym ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch
a. Nguyên tắc:
Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu sắc đặc trưng, còn phần cơ chất bị enzym ngoại bào của NS phân hủy sẽ có màu trong suốt quanh KL.
b. Tiến hành
* Phương pháp cấy chấm điểm
Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu trên các MT thích hợp.
Cấy nấm sợi RNM trên đĩa petri chứa MT khảo sát khả năng sinh các enzym ngoại bào amylase, cellulase, protease, pectinase, kitinase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng từ 4 - 6 ngày thu kết quả.
* Phương pháp thỏi thạch
Cấy các chủng NS trên đĩa petri chứa MT amylase, cellulase, protease, pectinase, kitinase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng từ 4 - 6 ngày cho mọc thành KL.
Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch có KL nấm sợi và chuyển các thỏi thạch đó sang đĩa petri có chứa các MT tương ứng ( 3 thỏi một đĩa ) .
Đưa các đĩa chứa các thỏi thạch vào tử lạnh 2 - 4oC từ 6 – 8h cho enzim khuyếch tán, sau đó chuyển sang tủ ấm 37oC trong 24 tiếng và thu kết quả.
c. Kiểm tra kết quả
Xác định khả năng sinh enzym của các chủng NS bằng thuốc thử rồi đo kích thước vòng phân giải (D-d, mm).
D: đường kính vòng phân giải, d: đường kính khuẩn lạc
D-d ≥ 25 rất mạnh D-d ≥ 10 trung bình D-d ≥ 20 mạnh D-d < 10 yếu.
Xác định hoạt tính proteaza bằng thuốc thử HgCl2. , đổ thuốc thử HgCl2. 10% lên bề mặt thạch, nếu nấm sợi sinh enzym proteaza sẽ có màu trong suốt quanh KL ( cấy chấm điểm ) hoặc thỏi thạch ( phương pháp thỏi thạch ), do các phân tử protein đã bị enzim phân hủy. Các protein chưa bị phân hủy sẽ có màu trắng đục.
Xác định hoạt tính amylase, cellulase, kitinase, pectinase bằng thuốc thử lugol.
NS sinh cellulaza tạo vòng trong suốt quanh KL, vùng cellulaza chưa bị phân hủy có màu nâu đỏ.
NS sinh amylaza tạo vòng trong suốt quanh KL, vùng amylaza chưa bị phân hủy có màu tím đậm.
NS sinh chitinaza tạo vòng trong suốt quanh KL, vùng chitinaza chưa bị phân hủy có màu đỏ gạch [4], [5],[6],[ 13].
2.2.2.2. Khả năng sinh chất có hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định
* Phương pháp thỏi thạch a. Nguyên tắc
Nếu VSV trên khối thạch có chất kháng sinh thì chúng sẽ ức chế, và tiêu diệt các VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch.
b. Tiến hành
Cấy NS trên môi trường MEA, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-4 ngày. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có đường kính 8mm.
Chuẩn bị MT trường nuôi cấy VSV kiểm định ( môi trường MEA ), lấy một vòng que cấy VSV kiểm định (vi khuẩn E.coli, vi khuẩn Baciluss), hòa vào 2ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù.
Đổ dịch huyền phù chừa VSV kiểm định vào các bình tam giác chứa môi trường PDA lỏng ở nhiệt độ khoảng 45o C, lắc đều và đổ một lớp mỏng vào đĩa petri.
Dùng kim mũi mác lấy các khối thạch chứa chủng NS nghiên cứu đặt lên các đĩa thạch có VSV kiểm định.
Sau đó đặt mẫu trong tủ lạnh 2 - 4oC từ 6h - 8h, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 24h.
c. Thu kết quả
Xác định hoạt tính kháng sinh bằng cách đo kích thước vòng vô khuẩn D-d. D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính khối thạch. Đơn vị tính là mm.
D-d ≥ 25 rất mạnh D-d < 10 yếu
D-d ≥ 20 mạnh D-d = 0 không kháng.
D-d ≥ 10 trung bình
2.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng, khả năng sinh emzim ngoại bào và khả năng đối kháng với VSV 4 chủng NS
a. Nguyên tắc
Mỗi loại NS thích nghi với mỗi nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ hoạt tính sinh học có thể khác nhau.
b. Tiến hành
Chuẩn bị môi trường YEA, có bổ sung các nồng độ muối NaCl ở các nồng độ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% và 10%.
Cấy chấm điểm các chủng NS nghiên cứu lên MT ở mỗi nồng độ muối trên.
Nuôi ở tủ ấm 3 - 5 ngày ở nhiệt độ 28 - 30oC, mẫu đối chứng trên môi trường không có NaCl.
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng bằng cách đo đường kính khuẩn lạc
- Kiểm tra khả năng sinh enzim ngoại bào và hoạt tính đối kháng bằng cách đo đường kính vòng thủy phân hoặc vòng vô khuẩn tương ứng với từng nồng độ muối[6].
2.2.3. Phương pháp toán học Xử lí số liệu bằng toán thống kê . Phương pháp tính giá trị trung bình
x1 + x2 +…+ xn
X =
n Với n là số lần lặp lại thí nghiệm
Phương pháp tính khoảng ước lượng giá trị trung bình S
à = X ± n
Trong đó
n số lần lặp lại thí nghiệm
S là sai tiêu chuẩn mẫu S = S2 1 n
S2 gọi là phương sai mẫu S2 = ∑ ( xi – x )2 [21].
n -1 i=1