1.5. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ
1.5.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha tĩnh và pha động.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha dộng. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh.Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.
1.5.2. Cở sở của phương pháp sắc ký.
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha tĩnh và pha động. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
n = n.b.C 1+b.C
n- lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n∞ - lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất bị hấp phụ nào đó.
b - hằng số
C - nồng độ của chất bị hấp phụ
1.5.3. Phân loại các phương pháp sắc ký.
Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa và cách tiến hành sắc ký, người ta chia sắc ký ra thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:
1.5.3.1. Sắc ký cột (C.C).
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng phân tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà người ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp (từ 1/5 - 1/10), còn nếu tách tinh thì tỷ lệ này cao hơn và tùy thuộc vào
hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất) mà hệ số này trong khoảng 1/20 -1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn đưa lên cột. Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ nên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ đơn đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu.Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và làm giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt, gẫy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng tới hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng tới tiến độ công việc.
1.5.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silicagel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải
hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
1.6. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ
1.6.1 Phổ hồng ngoại (Infrareed spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó, dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khỏang 1700-1750 cm-1…
1.6.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của các phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phổ EI- MS (Electron Impact Ionization mass spectrosocopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV.
- Phổ ESI- MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các píc đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
- Phổ FAB (Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tủ nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectrosocopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc ký khí- khối phổ), LC- MS (sắc ký lỏng- khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tách thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tách thuốc trong ngành dược).
1.6.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR(phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của hạt nhân từ (1H và 13C) dưới sự tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học(chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào sự tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
1.6.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều:
- Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học () của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử.
Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hoá học khác nhau. Dựa vào những đặc
trưng của độ dịch chuyển hoá học cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
- Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm).
- Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer):
Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên các phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu phổ của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135o. Còn trên phổ DEPT 90o thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
1.6.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều:
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HMQC: (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này.
Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscop): Phổ này biểu diễn các tương tác xa H-H, chủ yếu của các proton đính với cacbon liền kề nhau. Chính nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này, có thể xác định được cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE defferences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về mặt không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ với cường độ mạnh hơn.
Ngoài các phương pháp phổ nêu trên, trên thế giới, người ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử. Tuy nhiên phạm vi sử dụng của phổ này rất hạn chế, bởi vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp với các chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân tách, so sánh kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó xác định chính xác được chiều dài các mạch. Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thủy phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC- MS với các đường chuẩn dự kiến.