CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm a. Chuẩn bị giống nấm men
Nấm men được nuôi trên môi trường YEPD đặc sau đó cấy nấm men sang môi trường YEPD lỏng nuôi trong bình tam giác trong 3 ngày. Đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu.
b. Chuẩn bị môi trường bã bia và bã đậu nành
Bã bia và bã đậu nành sấy khô ở 105oC sau đó nghiền thành dạng bột mịn. Bã bia và bã đậu nành phối trộn theo tỉ lệ 1:1, pha loãng với nước cất, lọc qua vải thu 30 ml dung dịch và bổ sung rỉ đường theo tỉ lệ được bố trí trong các thí nghiệm. Khử trùng ở 121oC trong 20 phút.
3.2.2. Phân lập nấm men
- Mục đích: Phân lập được dòng nấm men có trong mẫu đã chọn.
- Phương pháp tiến hành:
+ Thu mẫu: Mẫu men bia từ nhà máy sản xuất bia trường Đại học Cần Thơ + Nuôi tăng sinh:
Pha môi trường nuôi tăng sinh với thành phần môi trường gồm:
Yeast extract 5 g
Peptone 5 g
D(+)-Glucose 20 g Tetracyline 100 mg
+ Khử trùng môi trường, bình tam giác và nút gòn trong nồi khử trùng nhiệt ướt ở 121oC trong 20 phút.
+ Để nguội môi trường.
+ Cho vào mỗi bình tam giác 100ml môi trường đã khử trùng (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
+ Cho mẫu vào môi trường (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
+ Ủ lắc 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
- Cấy trải:
Pha môi trường cấy trải với thành phần môi trường gồm:
Yeast extract 5 g
Peptone 5 g
D(+)-Glucose 20 g Tetracyline 100 mg
Agar 20 g
+ Khử trùng môi trường, đĩa petri, ống nước cất pha loãng trong nồi khử trùng nhiệt ướt ở 121oC trong 20 phút.
+ Đổ môi trường vào đĩa petri (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
+ Pha loãng mẫu đã nuôi tăng sinh ở 4 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
+ Rỳt 10 àl dung dịch đó pha loóng nhỏ vào đĩa petri chứa mụi trường (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
+ Tiến hành trải mẫu (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
Trong 1000 ml môi trường
Trong 1000 ml môi trường
+ Úp ngược đĩa và cho vào tủ ủ ở 30oC trong 24 giờ.
Tiến hành cấy chuyển nhiều lần đến khi ròng.
Kiểm tra hình thái tế bào nấm men dưới kính hiển vi.
Kiểm tra khả năng lên men đường trong ống Durham.
3.2.3. Phương pháp xác định mật số nấm men
Mật số tế bào của huyền phù mẫu được tính theo công thức:
N = (a/0,016) x 103 x hệ số pha loãng Trong đó: N là số tế bào trong 1ml
a là số tế bào đếm được trong 4 ô lớn 3.2.4. Quy trình thực hiện
Hình 4. Quy trình thực hiện chung cho các thí nghiệm Bã bia và bã đậu nành
Xay nhuyễn
Pha loãng với nước cất
Nuôi trên môi trường YEPD lỏng
Tách ròng Nấm men giống
Bổ sung rỉ đường
Khử trùng
Lắc ủ 120 vòng/phút Kiểm tra mật số Rỉ đường
Xử lý
Pha loãng Lọc thu dung dịch
3.2.5. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia và bã đậu nành đến khả năng tạo sinh khối nấm men
Mục đích thí nghiệm: Chọn được độ pha loãng bã bia và bã đậu nành thích hợp cho sự phát triển và tăng sinh khối của nấm men trong thời gian ngắn, hiệu quả cao.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức là bã bia và bã đậu nành được pha loãng với nước cất theo 5 mức khác nhau, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại. Tổng cộng có 15 đơn vị thí nghiệm.
Nghiệm thức 1: bã bia và bã đậu nành 10%.
Nghiệm thức 2: bã bia và bã đậu nành 15%.
Nghiệm thức 3: bã bia và bã đậu nành 20%.
Nghiệm thức 4: bã bia và bã đậu nành 25%.
Nghiệm thức 5: bã bia và bã đậu nành 30%.
Cách thức tiến hành: Thực hiện thao tác như đã trình bày ở mục 3.2.1. Chủng 0,3 ml dung dịch nấm men giống đã chuẩn bị có mật số 6,2x105 tế bào/ml. Lắc ủ 120 vòng/phút ở 30oC.
Chỉ tiêu theo dõi: mật số nấm men sau mỗi khoảng 12 giờ và kết thúc sau 72 giờ ủ.
3.2.6. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng tạo sinh khối nấm men
Mục đích thí nghiệm: Xác định mức pH thích hợp cho sự phát triển của nấm men.
Bố trí thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức gồm 5 mức pH, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Tổng cộng có 15 đơn vị thí nghiệm.
Nghiệm thức 1: pH = 3 Nghiệm thức 2: pH = 4 Nghiệm thức 3: pH = 5
Nghiệm thức 4: pH = 6 Nghiệm thức 5: pH = 7
Cách thức tiến hành: thao tác được thực hiện như đã trình bày ở mục 3.2.1. Độ pha loãng bã bia và bã đậu nành 25%. Chủng 0,3ml nấm men giống có mật số 5,1x105 tế bào/ml.
Chỉ tiêu theo dõi: mật số nấm men sau mỗi khoảng 12 giờ và kết thúc sau 72 giờ ủ.
3.2.5. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường bổ sung đến khả năng tạo sinh khối nấm men
Mục đích thí nghiệm: Xác định tỷ lệ rỉ đường bổ sung thích hợp cho sự phát triển của nấm men.
Bố trí thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức gồm 4 mức rỉ đường bổ sung và nghiệm thức đối chứng không bổ sung rỉ đường, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Tổng cộng có 15 đơn vị thí nghiệm.
Nghiệm thức 1: Không bổ sung rỉ đường.
Nghiệm thức 2: Bổ sung rỉ đường 2%.
Nghiệm thức 3: Bổ sung rỉ đường 4%.
Nghiệm thức 4: Bổ sung rỉ đường 6%.
Nghiệm thức 5: Bổ sung rỉ đường 8%.
Cách thức tiến hành: Thực hiện thao tác như đã trình bày ở mục 3.2.1. Độ pha loãng bã bia và bã đậu nành, thời gian nuôi cấy, mật số tế bào ban đầu được chọn lựa từ thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2. Chủng nấm men giống có mật số 3,6x105 tế bào/ml.
Chỉ tiêu theo dõi: mật số nấm men sau mỗi khoảng 12 giờ và kết thúc sau 72 giờ ủ.
3.2.6. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và mật số tế bào ban đầu đến khả năng tạo sinh khối nấm men
Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian nuôi cấy và mật số tế bào ban đầu thích hợp cho sự phát triển của nấm men.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố - Thời gian nuôi cấy (giờ): 12, 24, 36, 48, 60 và 72.
- Mật số tế bào ban đầu (tế bào/ml): 100, 102, 104, 106.
- Tổng số nghiệm thức: 6 x 4 = 24. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, tổng cộng có 72 đơn vị thí nghiệm.
Cách thức tiến hành: Thực hiện thao tác như đã trình bày ở mục 3.2.1. Độ pha loãng bã bia và bã đậu nành 25%. Chủng nấm men giống theo các nghiệm thức, lắc ủ 120 vòng/phút ở 30oC và đếm mật số ở các mốc thời gian 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ.
Chỉ tiêu theo dõi: mật số nấm men sau mỗi khoảng 12 giờ và kết thúc sau 72 giờ ủ.