Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

a. Hóa chất

- Dung dịch môi trường Walne.

- Formol.

- Phân tích N-NH4+: Sodium salicylate, Trisodium citrate, Sodium nitroprusside, Sodium hydroxide, Sodium dichloroisocyanurate.

- Phân tích P-PO43-: Ammonium molybdate ((NH4)6C4H4O6.4H2O), Acid ascorbic, H2SO4 5N, Potassium antinomyltartrate (K(SbO)C4H4O6.1/2H2O), Phenolphtalein.

b. Dụng cụ

- Máy sục khí, máy đo pH, máy đo DO, nhiệt kế.

- Chai nhựa 110 ml, keo thủy tinh 10 lýt.

- Lame, lamelle, ống nhỏ giọt.

- Kính hiển vi, buồng đếm phiêu sinh Neubaur Improved.

- Dụng cụ phân tích chỉ tiêu N-NH4+ ; P-PO43-.

- Tỳi lọc cơ học với mắc lưới 45àm và lưới lọc phiờu sinh với mắc lưới 5 àm (loại bỏ tảo tạp).

- Giấy lọc Whatman 0,45 àm.

c. Nguồn nước thải

Được lấy trực tiếp từ nước thải của ao cá tra thâm canh trong ao đất do bà Nguyễn Thị Tư quản lý với diện tích gần 9000 m2 và lấy vào buổi sáng trước khi thay nước. Cá nuôi ở độ tuổi 4  4,5 tháng tuổi (đạt khối lượng khoảng 500g/con), mật độ khoảng 28 con/m2 có chế độ thay đổi nước theo chu kỳ và phụ thuộc vào chế độ thủy triều, mỗi lần thay từ 15  30% lượng nước. Nước thay từ ao được thải trực tiếp ra sông Hậu mà không qua bất kỳ hệ thống xử lý nào. Bùn đáy ao được dọn 1 lần/tháng bằng máy bơm hút bùn chuyên dụng và lượng bùn này cũng được thải trực tiếp ra sông Hậu.

Cá được cho ăn 1 lần/ngày vào lúc trời nắng (vào 8  9h sáng hay 14  15h chiều tùy thuộc vào thời tiết), sử dụng thức ăn dạng viên loại ViNa 904 với thành phần dinh dưỡng trong thức ăn được trình bày ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1: Thành phần dinh dưỡng trong thức ăn viên ViNa 904

d. Nguồn tảo giống

Nguồn tảo Chlorella sp. từ khoa thủy sản, được phân lập và nuôi giữ tại phòng thí nghiệm Tài nguyên Môi trường thuộc Bộ môn Khoa học Môi trường, khoa Môi Trường và Tài nguyên Thiên nhiên trường Đại học Cần Thơ.

Tính chất thức ăn Đơn vị tính Độ bền trong nước thấp nhất 30 phút

Protein Min 26%

Tro Max 10%

Năng lượng thô Min 2.100 kCal/kg

Phosphor Min 1%

Xơ thô Max 7%

NaCl Max 2,5%

Độ ẩm Max 11%

Hỡnh 3.1: Lưới lọc phiờu sinh (lỗ lọc 5 àm)

Tảo giống: được bảo quản và nhân giống bằng phương pháp cấy chuyền trong môi trường nhân tạo Walne (Coutteau, 1996) với thành phần dinh dưỡng được trình bày ở phụ lục 1 được sục khí và chiếu sáng 24/24 thuần 100%. Tỉ lệ tảo giống thường được sử dụng trong nuôi cấy thường chiếm từ 2  10% về thể tích trong keo nuôi.

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu a. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên ở ngoài trời cạnh ao nuôi cá tra thâm canh với 3 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Trong thí nghiệm chia làm 2 giai đoạn, mỗi giai đoạn xem như một lần thí nghiệm riêng biệt. Giai đoạn 1 thí nghiệm với 200L nước, giai đoạn 2 với 500L nước với sơ đồ bố trí như phụ lục 2.

Khu vực bố trí thí nghiệm có mái che bằng nylon trong để tránh sự tác động của các yếu tố từ bên ngoài và sử dụng ánh sáng tự nhiên cho qúa trình quang hợp của tảo, với cùng điều kiện môi trường. Ao đất đáy có lót nylon làm thí nghiệm để tránh thoát nước trong quá trình thí nghiệm có kích thước như Hình 3.2.

0 0.8 m

1.2 m

0.1 m 0.2 m

0.8 m

0.1 m 0.1 m

0.2m

0.6m

0.1 m 0.1 m 0.1 m

0.2 m

1.2 m 0.2 m

Hình 3.2: Kích thước mỗi bể nuôi tảo ngoài trời

Bảng 3.2: Nghiệm thức bố trí thí nghiệm

 Tiến hành thí nghiệm: nghiệm thức C2 và C3 được bố trí theo tỉ lệ 10%

tảo với 90% nước ao cá tra về thể tích.

 Thí nghiệm 1: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu với 3 nghiệm thức, 3 lần lặp lại nhằm nghiên cứu sự phát triển của tảo Chlorella sp. thông qua mật độ, sinh khối khi chuyển từ môi trường Walne sang môi trường nước thải ao nuôi cá tra thâm canh. Và ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của tảo Chlorella sp. qua đó xác định chu kỳ phát triển để thuận lợi cho sự theo dõi các biến động ở thí nghiệm 2. Trong đó:

Nghiệm thức C1.1 là NT đối chứng có thể tích 200L, nước từ ao cá tra được bơm trực tiếp không qua túi lọc, không cho thêm tảo Chlorella sp.. Nhằm theo dõi diễn biến N-NH4+, P-PO43- trong nước để thấy được khả năng hấp thu dinh dưỡng của tảo tự nhiên trong nước ao cá tra theo thời gian.

Nghiệm thức C2.1 tảo giống Chlorella sp. với nước ao cá tra không lọc qua túi lưới với: 10% tảo giống Chlorella sp. và 90% nước ao cá tra. Mật độ tảo đầu vào là 4.050.000 ct/ml. Nhằm theo dõi diễn biến về mật độ, sinh khối và diễn biến nồng độ N-NH4+, P-PO43- trong nước để thấy được khả năng hấp thu dinh dưỡng của tảo Chlorella sp. khi môi trường có sự cạnh tranh của tảo tạp và phiêu sinh động vật.

Nghiệm thức C3.1: tảo giống Chlorella sp. với nước ao cá tra lọc qua túi lưới với: 10% tảo giống Chlorella sp. với mật độ 4.050.000 ct/mL và 90% nước ao cá tra qua lọc. Nhằm theo dõi diễn biến về mật độ, sinh khối và N-NH4+, P-PO43- trong nước để thấy được khả năng hấp thu dinh dưỡng của tảo Chlorella sp. khi môi trường không có sự cạnh tranh.

Nghiệm thức Bố trí Lặp

1 2 lại

C1. đối chứng 200L nước ao cá tra 500L nước ao cá tra 3

C2. Chlorella sp.

với nước thải không lọc

20L tảo giống Chlorella sp. với mật độ 4.050.000 ct/mL + 180 lít nước ao cá tra

50L tảo giống Chlorella sp. với mật độ

3.675.000 ct/mL + 450 lít nước ao cá tra

C3. Chlorella sp.

với nước thải lọc

20L tảo giống Chlorella sp.

với mật độ 4.050.000 ct/mL+ 180 lít nước ao cá tra

50L tảo giống Chlorella sp. với mật độ

3.675.000 ct/mL + 450 lít nước ao cá tra

Bắt đầu theo dõi sự phát triển của tảo cũng như diễn biến về N-NH4+, P-PO43- kể từ lúc cho tảo vào nước thải (ngày 0) và kết thúc thí nghiệm vào ngày 11 đối với từng nghiệm thức (khi tảo đã chết và không có khả năng phục hồi vào các ngày sau đó).

 Thí nhiệm 2: Nghiên cứu, so sánh khả năng hấp thụ N-NH4+, P-PO43- trong nước thải ao nuôi cá tra thâm canh của tảo Chlorella sp. với tảo tự nhiên.

Thể tích bố trí là 500L.

Nghiệm thức C1.2: là nghiệm thức đối chứng với 500L nước từ ao cá tra được bơm trực tiếp không qua túi lọc không cho thêm tảo Chlorella sp..

Nghiệm thức C2.2: tảo giống Chlorella sp. với nước ao cá tra không lọc qua túi lưới với: 10% tảo giống Chlorella sp. với mật độ 3.675.000 ct/mL và 90%

nước ao cá không qua lọc.

Nghiệm thức C3.2: tảo giống Chlorella sp. với nước thải lọc qua túi lưới:

10% tảo giống Chlorella sp. với mật độ 3.675.000 ct/mL và 90% lít nước ao cá tra qua lọc.

Bắt đầu theo dõi sự phát triển của tảo cũng như diễn biến về N-NH4+, P-PO43- kể từ lúc cho tảo vào nước thải (ngày 0) và kết thúc thí nghiệm vào ngày 11 đối với từng nghiệm thức.

b. Chu kỳ thu mẫu

Để có độ chính xác tốt nhất cho kết quả nghiên cứu thì thời gian thu mẫu của từng giai đoạn thí nghiệm được đề xuất như Bảng 3.3. Ở thí nghiệm 1 sẽ thu mẫu liên tục từ ngày 0 đến ngày 11, nhằm xác định được chu kỳ phát triển của tảo Chlorella sp. khi chuyển từ môi trường dinh dưỡng Walne trong điều kiện phòng thí nghiệm sang môi trường nước thải cá tra ngoài thực nghiệm. Thời gian thu mẫu ở thí nghiệm 2 sẽ dựa trên chu kỳ phát triển của tảo thu được từ thí nghiệm 1. Thu mẫu để xác định diễn biến yếu tố mật độ, sinh khối, các chỉ tiêu N-NH4+, P-PO43- mỗi ngày 1 lần vào lúc 8  9h sáng theo từng ngày.

Bảng 3.3: Chu kỳ chu mẫu Chlorella sp.

c. Thu mẫu và bảo quản mẫu

Mẫu được thu vào chai nhựa 110 mL với thể tích và cách bảo quản khác nhau:

+ Đối với mẫu xác định mật độ và sinh khối: thu 110 mL (1 mẫu/ngày), cố định bằng formaline 4%, bảo quản ở nhiệt độ phòng.

+ Đối với các chỉ tiêu N-NH4+

, P-PO43-: thu 110 mL (1 mẫu/ ngày), trữ lạnh 4oC (nhẳm duy trì tính chất và tính trạng mẫu nước trước khi phân tích).

d. Phương pháp phân tích

 Chỉ tiêu N-NH4+, P-PO43-:

Các chỉ tiêu N-NH4+, P-PO43- phân tích tại phòng thí nghiệm theo các phương pháp:

- N-NH4+: dùng phương pháp Indophenol blue (so màu ở bước sóng 660 nm bằng máy so màu U 2800).

- P-PO43-: dùng phương pháp Acid ascorbic (so màu ở bước sóng 880 nm bằng máy so màu U 2800).

Nghiệm thức Tảo Thí nghiệm

Lặp lại

1 2

C1 Đối chứng

Ngày 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11.

Ngày 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11.

Tảo Chlorella sp. (không lọc)

Ngày 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11.

Tảo Chlorella sp. (lọc)

Ngày 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11.

 Xác định mật độ tảo

Việc xác định số lượng tế bào tảo được tiến hành bằng cách đếm tế bào trên buồng đếm Neubaur Improved có 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ, mỗi ô vông nhỏ có diện tích 0.0025 mm2 và độ sâu buồng đếm là 0.1 mm.

Lắc đều mẫu trước khi đếm. Cho mẫu vào buồng đếm bằng ống nhỏ giọt, đậy lamelle lại không để xuất hiện bọt khí. Sau đó đếm số lượng tảo dưới kính hiển vi vật kính 10X và đếm số lượng tế bào tảo ở các vị trí như Hình 3.3.

Đếm số lượng ct ở các ô tương

ứng như trên, mỗi mẫu lặp lại 3 lần. Sau đó xác định mật độ tảo theo công thức:

(Coutteau, 1996) Với:

- Y: mật độ tảo (ct/mL ) - X: tổng số ct đếm được

- S: diện tích 1 ô đếm (0,0025 x16 = 0,04 mm2) - N: số ô đếm.

- H: chiều cao cột nước của buồng đếm (0,1 mm) H

S N Y X

1 0 0 0

 *

Hình 3.3: Vị trí đếm tảo trong buồng đếm

 Xác định sinh khối tảo:

Sử dụng phương pháp trọng lượng tươi:

 Lấy 30 mL dịch nuôi tảo, lọc qua giấy lọc (rửa bằng nước cất nhiều lần, cho đến khi nước rửa trong đem lọc) bằng giấy lọc đã sấy khô ở nhiệt độ 105°C trong 2 giờ và cân đến trọng lượng không đổi. Chú ý cần lọc nhanh và tránh sự co cụm hay phá vỡ tế bào.

 Đem cân.

 Định tính và định lượng tảo tạp:

Định tính: Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch để định tính đã được cố định, nhỏ 1 – 2 giọt lên miếng lame, sau đó đậy lại bằng lamelle. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi và ghi nhận thành phần giống loài định danh bằng tài liệu của A. Shirota (1966), lặp lại 3 lần.

Định lượng: Dùng buồng đếm Neubaur Improved để đếm số lượng cá thể tảo tạp.

Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch dùng để định tính đã được cố định, nhỏ mẫu lên buồng đếm, rồi dùng lame đậy lại sao cho không có xuất hiện bọt khí.

Sau đó quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10X và đếm số lượng cá thể của mỗi loài, mỗi mẫu lặp lại 3 lần.