4.2 Neue Hypothesen zur Warfarinbindung
4.2.2 Ist das TYA-Motiv für die Warfarinbindung verantwortlich?
Ein spezifisches Bindungsmotiv für Warfarin ist in der VKORC1 bisher nicht eindeutig charakterisiert worden. Allerdings konnte in der ebenfalls cumarinsensitiven NQO1 durch Photoaffinitọts-Markierungen eine Dicumarolbindungsstelle identifiziert werden, das sogenannte TYA-Motiv.[13,19,77,78] Auch die VKORC1 besitzt ein homologes TYA- Motiv, welches eine wichtige Rolle in der Cumarinbindung zu spielen scheint, da Mutationen in Nagern an der Stelle Tyr139 in diesem Motiv bekannt sind, die zu einer
Resistenz und die Mutation Tyr139Cys und Tyr139Ser einen hohen Resistenzgrad im VKOR-DTT Assay aufweisen.
Um die Bedeutung des TYA-Motivs (Threonin, Tyrosin, Alanin) für die Cumarin- bindung nọher zu untersuchen, wurde das komplette Bindungsmotiv zu Leucin, Isoleucin und Valin mutiert (LIV). Diese Aminosọuren wurden ausgesucht, da sie keine funktionellen Gruppen besitzten und ihre Grửòe vergleichbar mit den Aminosọuren des TYA-Motivs ist. Im zellbasierten Assay zeigt das komplett zu LIV mutierte TYA-Motiv mit einer IC50 von 360,7 nM eine totale Resistenz (verglichen mit der wt VKORC1 die 14,6-fache Warfarin-Konzentration, siehe Tab. 3.4).
Interessanterweise formt die Dosis-Wirkungs-Kurve für diese Mutation ab einer Konzentration von circa 0,2 àM - 1 àM Warfarin ein Plateau mit einer FIX-Aktivitọt von 52%.
In unserem hVKORC1-Modell sind alle drei Aminosọuren des TYA-Motivs ỹber Wasserstoffbrỹcken mit der dritten Kontaktflọche verbunden (Abb. 4.1). Dies erklọrt, warum das komplett mutierte TYA-Motiv zu einer starken Resistenz führt, da bei dieser VKORC1-Variante keine Wasserstoffbrỹcken zur Kontaktflọche III ausgebildet werden kửnnen. Dieses Ergebnis zeigt deutlich, dass das gesamte TYA-Motiv eine Rolle in der Warfarinbindung spielt und Mutationen an dieser Stelle einen kompletten Warfarin-Resistenzphọnotyp verursachen kửnnen.
Trotz der hohen Frequenz an murinen Mutationen im TYA-Motiv ist nur eine humane Mutation in diesem Bereich bekannt, die zu einer Resistenz führt (Tyr139His). Da das komplett mutierte TYA-Motiv (Leucin, Isoleucin, Valin) einen starken Warfarin- Resistenzphọnotyp aufweist, wurde fỹr die Mutation Tyr139His ein vergleichbar hoher Resistenzgrad erwartet. Jedoch zeigt die Mutation Tyr139His in dem neuen VKORC1-Assay nur einen moderaten Resistenzphọnotyp. Diese VKORC1-Variante besitzt eine IC50 von 113,1 nM. Dies ist im Vergleich zur wt VKORC1 die 4,58-fach erforderliche Konzentration an Warfarin für eine halbmaximale Inhibition. In der Literatur ist bisher nur ein Patient mit dieser Mutation beschrieben, der mit der dreifachen Menge an Phenprocoumon (63 mg/Woche) nicht therapeutisch antikoaguliert werden konnte.[52] Nach unserem Ergebnis müsste dieser Patient mit der circa 4,5-fachen Menge an Phenprocoumon therapeutisch antikoagulierbar sein.
Jedoch müssen die patientenindividuellen pharmakokinetischen und -genetischen Faktoren in diese ĩberlegungen mit einbezogen werden. Dies kann dazu fỹhren, dass der Patient einen hửheren oder niedrigeren Bedarf an oralen Antikoagulantien besitzt als im Assay ermittelt.
Für das betreffende Tyrosin im TYA-Motiv zeigt das Proteinmodell für die hVKORC1 eine Besonderheit auf. Tyr139 ist die einzige Aminosọure aller betreffender cumarinresistenter Mutationen, deren Seitenkette und reaktive Gruppen nicht ins Lumen sondern in die Phosphatidylcholin-Membran ragt (Abb. 4.1). Trotzdem bildet das Tyr139 eine Wasserstoffbrỹckenbindung zur Kontaktflọche III aus. Da sich Tyrosin und Histidin strukturell sehr ọhnlich sind, beide einen aromatischen Ring besitzen und vergleichbar groò sind, bewirkt der Aminosọureaustausch von Tyrosin zu Histidin im TYA-Motiv wahrscheinlich keine groòen Konformationsọnderung in der hVKORC1. Des Weiteren ist die Histidin-Seitenkette generell in der Lage, Wasserstoffbrückenbindungen auszubilden und kann vermutlich in der hVKORC1 anstelle des Tyrosins auch eine Wasserstoffbrỹckenbindung zur Kontaktflọche III ausbilden. Daher führt die VKORC1-Variante Tyr139His nicht zu einer hohen Warfarinresistenz.
Interessanterweise zeigt die murine VKORC1-Mutation Tyr139Phe im TYA-Motiv im alten VKOR-DTT Assay und im neuen Assay einen kompletten Resistenzphọnotyp.[17,20] Die IC50 fỹr diese VKORC1-Variante betrọgt im zellbasierten
Resistenzgrad ist wahrscheinlich auf das Fehlen der Wasserstoffbrückenbindung zur Kontaktflọche III zurỹckzufỹhren, da Phenylalanin wesentlich schlechter Wasserstoff- brückenbindungen ausbildet als Tyrosin oder Histidin.
Zusammenfassend scheint das TYA-Motiv eine wichtige Rolle in der Warfarinbindung zu spielen. Dies wird anhand des kompletten Resistenzphọnotyps der LIV-Variante deutlich. Jedoch führt nicht zwingend jede Mutation im TYA-Motiv zu einem kompletten Resistenzphọnotyp. Die Hypothese, dass insbesondere die Hydroxyl- gruppe des Tyr139 in die Warfarinbindung involviert ist, kann bestọtigt werden, da diese eine Wasserstoffbrỹckenbindung zur Kontaktflọche III ausbildet. Der moderate Resistenzphọnotyp der humanen Mutation Tyr139His begrỹndet sich darauf, dass Histidin wahrscheinlich wie Tyrosin eine Wasserstoffbrückenbindung zur dritten Kontaktflọche ausbildet kann. Andererseits kửnnen Aminosọureaustausche an derselben Stelle komplette Resistenzen verursachen, wenn keine Wasserstoff- brückenbindung ausgebildet werden kann. Dies ist z.B. bei der murinen VKORC1- Variante Tyr139Phe gegeben. Schlieòlich ist der Resistenzgrad im TYA-Motiv nicht nur durch die Position, sondern auch durch die Art des Aminosọureaustausches und der daraus resultierenden Fọhigkeit der Ausbildung einer Wasserstoff- brückenbindung bestimmt.
Allerdings ist das TYA-Motiv nicht die einzige Aminosọuresequenz in der VKORC1, welche für die Warfarinbindung wichtig ist (siehe Abschnitt 4.3.2 - 4.3.4). Andere untersuchte Mutationen zeigen vergleichbare oder deutlich ausgeprọgtere Resistenzgrade, so dass auch andere Aminosọuren der hVKORC1 an der Warfarinbindung beteiligt sein müssen.