TÁI TỔ HỢP VẬT CHẤT DI TRUYỀN
2. CHU KỲ SỐNG VÀ TÁI TỔ HỢP VẬT CHẤT DI TRUYỀN Ở VIRUT VÀ Ở VI KHUẨN 1. Virut
2.1.1. Đặc điểm chung
- Virut là các thể nội kí sinh bắt buộc, không có cấu tạo tế bào.
- Virut chỉ có một loại axit nucleic (ADN hay ARN).
- Chúng không có hệ thống sinh tổng hợp protein riêng (không có ribosom); không có hệ thống biến dưỡng riêng (ví dụ: không phân huỷ thức ăn để tạo ATP).
- Virut không tạo màng lipit riêng, màng bao của virut được tạo ra bằng biến đổi màng của tế bào chủ trước khi thoát khỏi tế bào chủ.
- Virut không chịu tác động của thuốc kháng sinh.
- Sự di động của virut nhờ khuyếch tán. Khi virut đã hình thành nó không tăng trưởng về kích thước và khối lượng.
2.1.2. Cấu tạo virut
2.1.3. Sự sao chép của các virut
Sự sinh sản và biểu hiện gen của VR chỉ được thực hiện trong một tế bào sống khác.
+) Nếu virut có bộ gen là ADN mạch kép thì sự sao chép giống với sự sao chép ADN của tế bào:
ADN ADN
+) Nếu virut có bộ gen là ARN mạch đơn: dưới tác dụng của enzym sao mã ngược (RT - reverse transcriptase) ARN cADN ARN.
+) Sự sao chép của bộ gen virut là ADN mạch kép dạng vòng theo cơ chế tái bản nửa gián đoạn theo okazaki. Sự sao chép có hình giống chữ sigma () nên được gọi là sao chép sigma hay còn được gọi là vòng tròn xoay. Mạch khuôn tròn ở trong không bị đứt quay tròn làm khuôn cho mạch trước. Sự chuyển dịch của mạch ngoài (mạch bị đứt) gián đoạn để tổng hợp các đoạn ngắn okazaki.
46 5’P mạch mới
3 OH’OH
Hình 4.4. Sao chép sigma hay vòng tròn xoay (Đường đậm chỉ mạch mới được tổng hợp) 2.1.4. Chu kỳ sống
2.1.4.1. Chu trình tan (Lytic cyle)
+) Sau khi ADN trần của virut được bơm vào tế bào, quá trình sao chép, phiên mã, dịch mã các gen của T4 được diễn ra nhanh chóng. Một trong các enzym được tổng hợp đầu tiên là enzym cắt ADN tế bào chủ.
+) ADN của phage được phiên mã đầu tiên nhờ ARN polymerase của vi khuẩn chủ để tạo ra các mARN sớm. Các mARN muộn hơn có thể được tổng hợp bởi ARN polymerase của phage hoặc của vi khuẩn bị biến đổi. Các protein của capsid được tổng hợp riêng, sau đó tự ráp lại với nhau và với ADN của phage để tạo thành các virion.
+) Chu trình hoàn tất khi enzym lysozym được tạo ra để phá vỡ vách tế bào. Mỗi tế bào vi khuẩn bị vỡ có khoảng 100 đến 200 virion được giải phóng. Mỗi chu trình kéo dài 20 – 30 phút ở 370C.
2.1.4.2. Chu trình tiềm tan (Lysogenic cycle)
Các virut có thể sinh sản trong tế bào vi khuẩn mà không làm chết tế bào vi khuẩn chủ được gọi là phage tiềm tan.
Các virut này có 2 khả năng sinh sản: chu trình tan và tiềm tan. Quá trình này được nghiên cứu kỹ ở phage .
+) Chu trình sống bắt đầu khi phage gắn vào bề mặt E.coli và bơm ADN vào trong tế bào vi khuẩn.
ADN của phage tạo vòng nhờ sự bắt cặp của các đoạn đuôi dư thừa theo NTBS.
+) ADN của phage sẽ tham gia vào một trong 2 chu trình. Nếu ADN của phage gắn vào NST vi khuẩn nhờ cơ chế trao đổi chéo tại điểm chuyên biệt trên NST vi khuẩn để tạo các prophage thì sẽ diễn ra chu trình tiềm tan. Quá trình gắn được thực hiện nhờ enzym intergrase. Khi vi khuẩn sinh sản prophage được sao chép cùng với NST của tế bào chủ.
+) Đôi khi prophage có thể tách khỏi NST vi khuẩn một cách ngẫu nhiên do tác động của các nhân tố môi trường như phóng xạ hoặc hoá chất để trở thành phage và bắt đầu chu trình sinh tan.
2.1.5. Tái tổ hợp vật chất di truyền ở phage
Hiện tượng: Nhiều phage có thể phát triển trong một tế bào vi khuẩn. Khi các phage được nhiễm đồng thời vào vi khuẩn và ADN của chúng tái bản với số lượng lớn. Khi ADN tồn tại tự do sẽ xảy ra trao đổi chéo dẫn đến tái tổ hợp vật chất di truyền.
Ví dụ: Phage T2 có 1 NST mạch thẳng. Các đột biến dùng trong nghiên cứu tái tổ hợp di truyền ở T2
được chia làm 2 nhóm:
- Nhóm tạo nên kiểu hình trông thấy (vết tan hoặc biên độ chủ) - Nhóm đột biến gây chết có điều kiện.
Tái tổ hợp di truyền ở T2 được nghiên cứu trong phép lai sau: E.coli được gây nhiễm đồng thời bởi 2 dòng mang đột biến trông thấy ở T2:
- h- (host): làm tan các VK cả 2 dòng B và B2; trong khi đó dạng dại h+ chỉ làm tan E.coli dòng B.
- r- (rapid): tạo vết tan rộng (làm tan nhanh); dạng dại r+ tạo vết tan bình thường.
Khi tế bào vi khuẩn chủ bị tan người ta thấy có 4 loại phage con được giải phóng. Đó là 2 dạng có kiểu hình giống cha mẹ (h và r) và 2 dạng có kiểu hình khác xuất hiện do tái tổ hợp (hr và h+r+).
Chứng tỏ 2 dòng T2 đã lai với nhau.
h+r hr+
h+r; hr+; hr; h+r+
2 dạng cha mẹ 2 dạng tái tổ hợp
Phép lai các dòng phage có 2 cặp gen được xem xét như trên được gọi là phép lai 2 nhân tố.
Tái tổ hợp di truyền là sự kiện ngẫu nhiên, tần số tái tổ hợp phụ thuộc vào khoảng cách các gen trên nhiễm sắc thể. Bằng cách thực hiện hàng loạt phép lai 2 nhân tố người ta đã xây dựng được bản đồ di truyền ở phage T2.
2.2. Vi khuẩn
2.2.1. Cấu tạo tế bào và sinh sản
2.2.2. Các cơ chế tái tổ hợp di truyền ở vi khuẩn Ở vi khuẩn có 3 kiểu trao đổi vật chất di truyền:
2.2.2.1. Tiếp hợp (Giao nạp)
Nòi F-, F+, Hfr và hiện tượng lai ở vi khuẩn
Tiếp hợp là hiện tượng tiếp xúc trực tiếp giữa hai tế bào vi khuẩn và kèm theo sự truyền vật chất di truyền từ tế bào thể cho (donor - D) sang tế bào nhận (recepient – R).
Hiện tượng tiếp hợp phát hiện được trực tiếp ở trực khuẩn đường ruột E.coli. ở E.coli có 2 nhóm:
Tế bào F+ có chứa nhân tố giới tính (nhân tố F), còn tế bào F- không có. Tế bào D là F+, tế bào F- là R. Khi tế bào F+ và F- giao nạp với nhau ống tiếp hợp được hình thành, bản sao của nhân tố F trong F+ chui qua ống tiếp hợp sang tế bào F-, biến F- thành F+.
Nhân tố F (Fertility) là một vòng ADN kép dài khoảng 105 bp (khoảng 1/40 chiều dài ADN vi khuẩn). Trên nhân tố F chứa các gen đặc trưng qui định sự hình thành lông F trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Các gen khác trong nhân tố F điều khiển sự hình thành ống tiếp hợp nối tế bào cho với tế bào nhận để nhân tố F có thể chuyển qua ống. Mỗi tế bào F+ chỉ có 1 nhân tố F, được tái bản đồng thời với NST vi khuẩn.
Thí nghiệm chứng minh có hiện tượng lai ở VK
Hình 4.10. Tế bào F-, F+, Hfr Tái tổ hợp
Tiếp hợp giữa tế bào F+ và F- dẫn đến sự trao đổi gen (phát hiện nhờ sự xuất hiện các thể tái tổ hợp) nhưng với tần số rất thấp (1/106). Về sau người ta phát hiện các tế bào Hfr (high frequency recombination) được phát sinh với tần số tái tổ hợp cao (>35%). Hfr cũng có lông F như F+ ở trên bề mặt cũng có dạng lông sợi tóc. Giữa Hfr với F+ có khác biệt quan trọng là ở Hfr nhân tố F được đính với NST qua cơ chế trao đổi chéo đơn, vì vậy Hfr còn có khả năng truyền đi NST qua ống tiếp hợp.
Hình 4.11. Sự truyền ADN từ thể cho sang thể nhận
Khi giao nạp Hfr với F- ống tiếp hợp được hình thành, nhân tố F đính trên NST phân làm đôi, một đầu chui qua ống tiếp hợp kéo theo các gen trên NST (chỉ có một sợi được chuyển qua, sợi còn lại
Hfr F-
F- F+ Hfr
được tổng hợp bên F-). Nếu tế bào nhận mang các alen khác với các alen truyền sang thì sự trao đổi chéo xảy ra, các tế bào tái tổ hợp dễ dàng được phát hiện.
Trường hợp cầu tiếp hợp bị đứt gãy nửa chừng, khi đó 1 phần NST của Hfr được truyền sang F-, phần còn lại vẫn nằm trong Hfr. Vì vậy phần lớn F- vẫn là F- ít khi F- trở thành Hfr.
Lập bản đồ di truyền nhiễm sắc thể ở vi khuẩn bằng giao nạp đứt quãng
Hayes, Jacob và Wollman đã sử dụng sự đứt gãy ngẫu nhiên của cầu tiếp hợp khi giao nạp F- với Hfr để lập bản đồ gen bằng cách xác định vị trí và khoảng cách các gen chuyển sang F-.
Ví dụ: dòng Hfr mang các gen nguyên dưỡng đánh dấu a+b+c+ trộn với dòng F- mang các gen khuyết dưỡng a-b-c-. S ti p h p ến dị di truyền và biến dị không di truyền ợc ở E.coli một đoạn xen IS1 chứa 720 bp nằm giữa đoạn được ở E.coli một đoạn xen IS1 chứa 720 bp nằm giữa đoạnc ng t quãng (cho v o máy rung) v i các kho ng th i gianắt quãng (cho vào máy rung) với các khoảng thời gian ài 24 bp. ới các khoảng thời gian khác nhau, sau ó pha loãng d ch nuôi v c y lên môi trđ ị di truyền và biến dị không di truyền ài 24 bp. ấy lên môi trường tối thiểu (MM), người ta ư ng t i thi u (MM), ngố loại ADN ểm của một số loại ADN ư i ta
thu được ở E.coli một đoạn xen IS1 chứa 720 bp nằm giữa đoạnc k t qu :ến dị di truyền và biến dị không di truyền
Thời gian (phút) Các thể tái tổ hợp
5 ab+c
10 ab+c+
15 a+b+c+
Như vậy trình tự gen dòng Hfr là b+c+a+ và mỗi gen cách nhau khoảng cách thời gian 5 phút.
2.2.2.2. Hiện tượng tải nạp
Tải nạp là hình thức chuyển vật chất di truyền từ tế bào cho sang tế bào nhận thông qua vật truyền trung gian là phage.
Tải nạp chung (generalized transduction): Trường hợp bất kì gen nào của thể cho cũng có thể chuyển sang thể nhận bằng phage.
Hình 4.13. Thí nghiệm chứng minh hiện tượng tải nạp ở Salmonella typhimurium
Thí nghiệm: Dùng ống thuỷ tinh hình chữ U, giữa có màng ngăn vi khuẩn, phage có thể chui qua được. Bên trái ống chứa nòi vi khuẩn LA2 với kiểu gen phe+ trp+ met- his-. Bên phải ống chứa nòi vi khuẩn LA22 với kiểu gen phe- trp- met+ his+. Sau đó người ta lấy một ít vi khuẩn LA22 cấy lên môi trường không có phenylalanin và triptophan và thấy có một ít vi khuẩn mọc được trên môi trường này. Như vậy, một số tế bào LA22 đã có khả năng tổng hợp được phenylalanin và triptophan mà trên môi trường nuôi cấy không có. Về sau người ta xác định đó chính là do phage22 kí sinh trên LA2 sau khi chui qua màng lọc đã làm xuất hiện các thể tái tổ hợp ở LA22 do sự trao đổi chéo đoạn ADN của LA2 mà phage22 mang sang với ADN của LA22, dẫn đến sự xuất hiện LA22 dạng dại với kiểu gen phe+ trp+ met+ his+.
Phân tích di truyền bằng tải nạp chung: Từ các hợp tử từng phần có thể thu nhận thông tin về sự liên kết của các gen vi khuẩn. Chẳng hạn, tải nạp từ vi khuẩn cho a+b+ sang vi khuẩn nhận a-b- sẽ sinh ra các tải nạp khác nhau đối với a+ và b+, có thể thu được thông tin về sự liên kết từ tỉ lệ:
49 LA2
2 LA2
Các tế bào vi khuẩn
Phage 22
Màng lọc
Tế bào VK tan phe+ trp+ met- his- phe- trp- met+ his+
Phage 22
Các thể tải nạp gen đơn
) ( ) (
) ( )
( ) (
) (
b a b
a
b hay a
b a b a
b a
Khả năng sinh ra các tải nạp a+ và b+ riêng biệt tỉ lệ với khoảng cách giữa chúng, nếu liên kết chặt chẽ thì có thể đồng tải nạp a+b+.
Tải nạp đặc hiệu (specialized transduction): Trường hợp phage chỉ truyền đi những gen nhất định từ tế bào cho sang tế bào nhận.
Ví dụ: Tải nạp đặc hiệu ở phage lamda () (tải nạp giữa các nòi vi khuẩn E.coli)
Phage có ADN sợi kép, mạch thẳng dài 50000 bp với 2 đầu đính tự nhiên. Khi E.coli bị nhiễm phage thì ADN tạo vòng tròn và bắt đầu tái bản, bắt đầu chu kỳ sinh tan hoặc có thể xen vào NST vật chủ để chuyển sang prophage. Trên ADN vật chủ có 1 điểm dính cho phage (att - attrachment site) nằm giữa gen gal (galactose) và bio (biotin), đó là đoạn tương đồng với đoạn b2
trên ADN phage . Sau đó xảy ra trao đổi chéo giữa ADN chủ với ADN tại điểm nói trên dẫn đến việc xen bộ gen vào giữa gen gal và gen bio trên NST E.coli.
Trong tế bào E.coli, bộ gen phage có thể tạo vòng và tách ra nhờ trao đổi chéo, trong đó chứa phần lớn gen và 1 đoạn ngắn NST vi khuẩn chủ mang gen gal. Như vậy chỉ có gen gal (nằm sát điểm att ) mới được phage truyền sang thể nhận sau này, vì vậy gọi là tải nạp đặc hiệu.
2.2.2.3. Biến nạp (transformation)
Biến nạp là hiện tượng truyền ADN tách ra từ vi khuẩn cho trực tiếp vào vi khuẩn nhận.
Biến nạp không cần sự tiếp xúc trực tiếp giữa tế bào cho và tế bào nhận, cùng như không cần vật truyền trung gian.
Cơ chế biến nạp : Vi khuẩn nhận tiếp nhận ADN của vi khuẩn cho và sau đó ADN này có thể trao đổi chéo với đoạn ADN tương đồng của vi khuẩn nhận bằng trao đổi chéo.