PHẦN II THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
♦ Phương pháp tạo giống: Cải tạo giống bằng phương pháp đột biến gây tạo kết hợp với sàng lọc ngẫu nhiên.
, , ' , ... .... (Ị
a) Phương pháp gây đột biến bằng ánh sáng ƯV:
- Pha hỗn dịch bào tử: dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy bào tử Micromonospora N °9 cho vào 10ml nước muối đẳng trương vô trùng lắc cho bào tử phân tán đều. Dùng 9ml hỗn hợp dịch bào tử này cho vào một đĩa petri vô trùng.
- Chiếu ánh sáng UV: đĩa petri chứa hỗn dịch bào tử đem chiếu ánh sáng UVvới liều lượng xác định. Để đĩa petri chữa hỗn hợp dịch bào tử sau chiếu ánh sáng u v vào chỗ tối 2 - 4 giờ, sau đó dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10'5'
- Cấy các bào tử sau đột biến: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 1er4 và 10'5 nhỏ vào bề mặt môi trường Gauze 1 trong đĩa petri,dàn đều bằng que trang.Mỗi độ pha loãng làm 3đĩa.Tiến hành tương tự với mẫu chứng ở nồng độ 10'6.Các đĩa được ủ ở 32°c trong 6 ngày.
- Đếm số khuẩn lạc để xác định % độ sống sót theo công thức:
% Độ sống sút = JẽLxl00%
m Ni : là số khuẩn lạc trung bình sau đột biến NO : là số khuẩn lạc trung bình trong mẫu chứng.
♦ Phương pháp sàng lọc sau đột biến:
Các khuẩn lạc sau đột biến khi đã đủ thòi gian nuôi cấy 6 ngày được lựa chọn ngẫu nhiên và cấy zigzac lên bề mặt môi trường Gauze 1 trong đĩa petri ủ ở 32°c trong 6 ngày rồi lấy ra thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp khối thạch. Làm tương tự với mẫu chứng, % biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:
% Biến đổi hoat tính = =*100%DO
Di: là đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng DO: là đường kính trung bình vòng vô khuẩn của chủng chứng
Dựa vào kết quả, ta lựa chọn các biến chủng có % biến đổi hoạt tính dương cao để tiếp tục nghiên cứu.
♦ Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:
Hoạt tính kháng sinh được thử theo phương pháp khuếch tán với 3 cách khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu cần thử (khoanh giấy lọc, đục lỗ thạch và khối thạch).
Nguyên tắc của phương pháp khuyếch tán: trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định ta cho mẫu thử vào theo các cách trên. Trong thời gian nuôi cấy kháng sinh sẽ khuyếch tán trên lớp thạch ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
a) Tiến hành:
- Chuẩn bị giống vi sinh vật kiểm định: vi sinh vật kiểm định được cấy từ ống giữ giống thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 5ml môi trường canh thang, ủ 37°c trong 1 ngày.
- Cấy vi sinh vật vào môi trường thạch thường: môi trường thạch thường sau khi đã pha chế được tiệt trùng và chờ nguội đến 45 - 50 0 c, rồi cho mồi trường giống vi sinh vật kiểm định theo tỷ lệ Vgiống / Vthạch thường = 5/200, lắc đều. Mỗi đĩa petri vô trùng cho 20ml.
- Đưa mẫu thử vào: mỗi đĩa petri cho 6 mẫu.
+ Mẫu thử là các mẫu thạch chứa kháng sinh: dùng patuyn vô trùng chuyển các khối thạch ((ị) = 6mm ) đặt trực tiếp lên bề mặt thạch chứa vi sinh vật kiểm định.
+ Mảu thử là các khoanh giấy lọc: tẩm chất cần thử lên khoanh giấy lọc. Làm 1-3 lần, mỗi lần 5 phút, sấy nhẹ cho khô (< 50 0 C). Dùng panh vô trùng đặt các khoanh giây đã tẩm lên bề mặt môi trường chứa vi sinh vật kiểm định.
+ Mẫu thử là các dung dịch (dịch lên men, dịch chiết nước...): Dùng bộ dụng cụ đục lỗ thạch ((ị) = 6mm) trên mặt thạch. Dùng pipet vô trùng nhỏ vào mỗi lỗ 0,05ml dịch cần thử có độ pha loãng thích hợp.
Để các đĩa petri đã đặt mẫu thử ở nhiệt độ 37°c trong 18-24giờ cho vi sinh vật kiểm định phát triển. Đường kính vòng vô khuẩn được đo bằng thước kẹp panmer độ chính xác 0,02mm.
c) Đánh giá kết quả: mỗi mẫu thử trên 4 đĩa đối với một loại vi sinh vật kiểm định để có 4 số liệu song song. Kết quả được xử lý theo phương pháp toán thống kê.
♦ Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng: I
a) Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường: pha môi trường Gauze, chỉnh pH, phân đều vào các ống nghiệm mỗi ống 5-6ml. Tiệt trùng ở 1200 C/30 phút rồi đặt thạch nghiêng.
b) Cấy giống vào ống môi trường: khi môi trường nguội dùng que cấy vô trùng cấy zigzac các bào tử Micromonospora N°9 đã chọn và không bị lâynhiễm lên bề mặt môi trường ủ ở 32°c trong 6-14 ngày rồi đem cất giữ trong tủ lạnh 4-10°C trong 3-6 tháng hoặc tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
♦ Phương pháp lên men: trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày phương pháp lên men gián đoạn. Quá trình tiến hành như sau:
a) Tạo giống cấp I: chủng MicromonosporaN°9 sau khi cấy vào ống thạch nghiêng 7-14 ngày tuổi được cấy vào bình nón 500 ml chứa 100 ml môi trường Gauze 1 lỏng qua 10 ml nước cất vô trùng. Lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 30-32°C tốc độ 250-300 vòng / phút trong 48giờ.
b) Lên men: giống cấp I được cấy vào các bình nón 500ml chứa 100ml môi trường lên men tối ưu với tỷ lệ V giống / V môi trường = 1/10. Mỗi bình giống cấy ra 3 bình lên men. Các bình lên men được lắc ở 31°c1 l°c với tốc độ 250-300 vòng/phút trên máy lắc tròn trong 120giờ.
♦ Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ:
Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được lọc loại sinh khối. Phần dịch lọc được chỉnh về pH thích hợp với từng dung môi chiết và tiến hành trong bình gạn theo phương pháp:
- Chiết nhiều lần: dịch lọc đã chỉnh pH được cho vào bình gạn cùng với dung môi theo tỷ lệ Vdung môi/ Vdịchlọc = 1/15. Lắc 1 phút, để phân lớp lgiờ rồi gạn lấy dung môi. Làm tiếp 2 lần với cùng thể tích dung môi như trên.
Hiệu quả của quá trình chiết được kiểm tra bằng cách thử hoạt tính kháng sinh từng pha sau một lần chiết bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
♦ Phương pháp sắc ký:
a) Sắc ký lớp mỏng: bản mỏng sắc ký được hoạt hoá ở 110°c trong 30 phút.
Dung môi chạy sắc ký là những dung môi sạch được pha theo đúng tỷ lệ và cho vào bình sắc ký với một lượng vừa đủ sao cho chiều dày lớp dung môi không quá lcm. Dùng giấy lọc lót phía trong thành bình để bão hoà dung môi được nhanh hơn.
Chấm dung dịch chứa hoạt chất cần sắc ký lên bản mỏng cách mép dưới l,5cm. Tuỳ theo độ đậm đặc của mẫu thử mà số lần chấm nhiều hay ít. Sấy nhẹ bản mỏng cho khô.
Đặt bản mỏng đã chấm mẫu thử vào bình sắc ký cho dung mội chạy hết khoảng 3/4 bản mỏng thì lấy ra đánh dấu vết dung môi chạy (Ddm). Sấy nhẹ bản mỏng cho khô rồi đem xác định vết.
- Xác định vết bằng đèn tử ngoại: khi soi đèn tử ngoại vết chất thử sẽ có màu sẫm trên nền huỳnh quang sáng.
- Xác định vết bằng phương pháp hiện hình vi sinh vật: bản mỏng sau khi đã chạy cho vào đĩa petri vô trùng, đổ môi trường thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định phủ lên bề mặt bản mỏng. Sau khi ủ 18-24giờ ở 37°c tại vết chất thử nếu là kháng sinh sẽ xuất hiện vòng vô khuẩn.
Đo khoảng cách từ điểm xuất phát đến điểm chạy của vết (Dv). Giá trị Rf được tính theo công thức sau:
Rf = Dv / Ddm b) Sắc ký cột: Quá trình được tiến hành như sau:
- Chuẩn bị cột: cột sắc ký đường kính lcm, dài 50cm chiều cao lớp chất nhồi 25cm. Chất nhồi được dùng là Sillicagel sau khi đã hoạt hoá ở 110°c trong lgiờ được hoà thành hỗn dịch với dung môi chạy rồi đưa lên cột cho dung môi chảy qua cột trong 2giờ để ổn định cột.
- Cho mẫu thử lên cột: dung dịch mẫu thử được cô đặc rồi trộn với một lượng nhỏ Sillicagel đã hoạt hoá, bốc hơi hết dung môi, đưa phần Sillicagel này lên cột.
- Cho dung môi chảy qua cột: hệ dung môi thích hợp sau khi đã pha đúng tỷ lệ được cho chảy qua cột đã có mẫu thử với tốc độ 0,5ml/phút. Dịch chảy được hứng lần lượt vào các ống nghiệm sạch mỗi ống 5ml.
- Phát hiện phân đoạn chứa thành phần chính cần tách: lần lượt chấm dịch trong từng ống nghiệm lên một bản mỏng sắc ký đã hoạt hoá và cho chạy trong hệ dung môi của sắc ký cột phân đoạn chính được xác định từ khi bắt đầu xuất hiện đến khi không còn vết có Rf tương ứng với Rf mẫu chứng.
♦ Phương pháp kết tinh kháng sinh bằng dung môi hữu cơ:
Dịch lên men được đem ly tâm để tách riêng sinh khối, dịch ly tâm được chiết bằng dung môi thích hợp, sau đó dịch chiết được cô đặc trong chân không đến cắn và hoà tan trong dung môi kết tinh. Để kết tinh, lọc tinh thể đem bốc hơi dung môi thu được tinh thể thô. Đem phần tinh thể thu được thử hoạt tính, xử lý tinh thể tiếp.
V