4.2. Lên men của vi khuẩn tự do
4.2.2. Điều kiện lên men
a. pH
pH ban đầu của môi trường lên men phụ thuộc nhiều vào pH tối thích của chủng vi sinh vật sử dụng để tổng hợp butanol. Các thí nghiệm được thực hiện bằng cách điều chỉnh về pH tối thích và không kiểm soát trong suốt quá trình lên men. Các loài Clostridium có khả năng hoạt động tốt trong khoảng pH từ 5.0-6.5. Với mỗi loài nhất định cần tiến hành lên men ở một giá trị pH ban đầu xác định nhằm đạt được hiệu suất tổng hợp cao nhất.
Trong nghiên cứu của Shamsudin và cộng sự (2006), loài C.Saccharoperbutylacetonicum N1-4 được sử dụng để lên men tạo butanol. Thí nghiệm tiến hành ở các giá trị pH ban đầu khác nhau của môi trường lên men nhằm xác định giá trị pH tối ưu của loài này. Môi trường sử dụng là môi trường TYA chứa 40 g glucose, pH được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1M. Kết quả đạt được trên hình 14:
Hình 14: Ảnh hưởng của pH lên nồng độ dung môi (♦), hiệu suất (◊) và tốc độ sinh tổng hợp (○) butanol của chủng C.Saccharoperbutylacetonicum N1-4.
Từ kết quả trên có thể thấy rõ pH tối thích của loài C.Saccharoperbutylacetonicum trong quá trình lên men là 6.0. Trong khi tại pH là 5.5 lại cho hiệu suất tổng hợp thấp nhất. Trong nghiên cứu của Madihah (2002) cũng cho kết quả tương tự khi pH ban đầu của dịch lên men từ loài C.Saccharoperbutylacetonicum cho hiệu suất cao nhất.
Để so sánh các quá trình lên men được thực hiện bằng cách chỉ điều chỉnh pH ban đầu một lần và duy trì pH ổn định trong suốt quá trình lên men. George và Chen (1983) đã sử dụng chủng C.beijerinckii VPI 13436 tiến hành lên men trên môi trường TYS. Thí nghiệm được tiến hành ở pH ban đầu là 6.8, sử dụng dung dịch KOH 8N để điều chỉnh pH trong suốt quá trình lên men.
Hình 15: Khả năng tổng hợp dung môi của C.beijerinckii VPI 13436 trên môi trường TYS không kiểm soát pH và duy trì pH ở 6.8.
butanol (▲), acetate (○), butyrate ( ), mật độ tế bào (●)
Trong môi trường không kiểm soát pH, vi sinh vật bắt đầu sinh tổng hợp dung môi sau 5 giờ lên men khi pH môi trường đạt 4.5-4.6, nồng độ butanol bắt đầu tăng nhanh sau 10 giờ lên men và đạt tối đa 100 đến 120 mM butanol sau 120 giờ lên men ( không hiển thị trên hình). Trong khi đó ở môi trường được duy trì pH ở 6.8, có thể tổng hợp dung môi sau 2 giờ lên men và nồng độ butanol đạt tối đa là 90 mM sau 120 giờ lên men. Việc kiểm soát pH của môi trường lên men đã làm giảm khả năng tổng hợp dung môi của vi khuẩn, trong khi đó nồng độ của các acid (acetate) trong dịch lên men lại tăng liên tục.
Như vậy việc duy trì pH cố định trong môi trường lên men không có nhiều ý nghĩa, do đó hầu hết các nghiên cứu đều thực hiện ở các giá trị pH tối thích ban đầu của vi sinh vật và không điều chỉnh trong suốt quá trình lên men.
b. Nhiệt độ
Tương tự như điều kiện về pH, giá trị nhiệt độ lên men sẽ phục thuộc nhiều vào chủng vi sinh vất sử dụng. Tùy vào từng loài có nhiệt độ tối thích khác nhau mà ta sẽ lựa chọn nhiệt độ lên men thích hợp. Khoảng nhệt độ tối thích của các loài Clostridium nằm trong vùng từ 30-40oC, nhiều thí nghiệm trên các loài Clostridium acetobutylicum và C. beijerinckii đều thực hiện ở nhiệt độ trung bình là 35oC.
Shamsudin và cộng sự (2006) nghiên cứu trên loài C.Saccharoperbutylacetonicum lại cho thấy khả năng tổng hợp butanol cao nhất ở 30oC.
Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng lên men tổng hợp dung môi của C.Saccharoperbutylacetonicum.
Ở 30oC, khả năng tổng hợp dung môi của vi khuẩn đạt cao nhất (15g/L). Trong khi đó, ở 40oC hầu như vi khuẩn đều bị ức chế làm mất khả năng tổng hợp dung môi. Như vậy có thể thấy, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất lên men tổng hợp dung môi, cần kiểm soát và duy trì ổn định nhiệt độ trong suốt quá trình lên men.
c. Nồng độ các muối trong môi trường tổng hợp
Ngoài các đường pentose và hexose là cơ chất chính được Clostridium sử dụng để lên men tổng hợp butanol, môi trường lên men còn chứa nhiều loại muối khoáng (Fe2+, Mn2+, K+, Mg2+, NH4+..) giúp cho vi sinh vật có thể sinh trưởng và tạo sản phẩm. Nhiều nghiên cứu cho thấy nồng độ các muối ban đầu trong môi trường lên men có thể ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng và tổng hợp sản phẩm của vi khuẩn.
F. Monot và cộng sự (1982) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ các hợp chất của môi trường tổng hợp đến quá trình lên men ABE sử dụng chủng Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Các thí nghiệm được tiến hành bằng cách lần lượt thay đổi
nồng độ ban đầu của các muối MgSO4, FeSO4, KCl, ammonium acetate trong môi trường tổng hợp.
- KCl:
Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối KCl, các thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ KCl ban đầu là 0, 3, 6, 9, 15, 30, 60, 120, 360, 600 mg/l và 1.2, 2, 4, 8, 12 g/l. Kết quả nồng độ dung môi thu được trong các thí nghiệm cho bởi bảng sau:
Bảng 9: Ảnh hưởng của nồng độ KCl ban đầu tới quá trình lên men ABE.
Nồng độ (mg/l)
Nồng độ tế bào*
Buta nol (g/l)
Aceto ne (g/l)
Etha nol (g/l)
Tổng ABE (g/l)
0 0.8 0 0 0 0
3 0.59 0.48 - - 0.48
6 0.72 0.78 - - 0.78
9 0.88 4.22 1.39 0.23 5.84
15 1.28 4.26 1.28 0.25 5.79
30 1.88 4.26 1.05 0.28 5.59
60- 600
2.60 4.32 1.03 0.50 5.85
0.6-8 (g/l)
2.94 4.72 0.81 0.48 6.01
12 3.10 3.89 0.90 0.37 5.16
*: Nồng độ tế bào tính theo mật độ quang.
Kết quả trên cho thấy quá trình lên men ABE chịu ảnh hưởng khá lớn bởi nồng độ của muối K+. Nồng độ tế bào trong môi trường lên men tăng liên tục khi nồng muối tăng từ 0 đến 60 mg/l và giữ ổn định khi nồng độ muối tiếp tục tăng từ 60-600 mg/l.
Nồng độ dung môi bắt đầu tăng nhanh khi nồng độ muối đạt 9 mg/l, trong khoảng nồng độ muối từ 0.6-8 g/l nồng độ dung môi vẫn duy trì không đổi 6.01 g/l. Khi nồng độ muối tăng cao 12 g/l đã gây sự ức chế làm giảm hiệu suất tổng hợp dung môi của vi khuẩn (nồng độ dung môi chỉ đạt 5.16 g/l).
- Ammonium acetate:
Muối ammonium acetate được khảo sát ở các nồng độ 1.1, 2.2, 3.3, 4.4, 5.5, 6.6 g/l.
Kết quả cho bởi bảng sau:
Bảng 10: Ảnh hưởng của nồng độ ammonium acetate ban đầu tới quá trình lên men ABE.
Ammonim acetate
Nồng độ (g/l)
Nồng độ tế bào
Butano l (g/l)
Aceton e (g/l)
Ethano l (g/l)
Tổng ABE (g/l)
1.1 2.14 3.11 0.99 0.12 4.22
2.2 1.83 2.78 1.10 0.12 4.00
3.3 1.84 2.04 0.65 0.09 2.78
4.4 1.80 1.48 0.47 0.09 2.04
5.5 1.86 1.04 0.35 - 1.39
6.6 1.80 1.04 0.35 - 1.39
Kết quả cho thấy ammonium acetate có ảnh hưởng lớn đến khả năng phát triển của vi sinh vật. Nồng độ ammonium acetate ở 1.1 g/l cho kết quả tốt hơn các nồng độ khác, ở nồng độ cao hơn hầu như vi sinh vật đều bị ức chế. Do đó việc tổng hợp dung môi cũng bị ảnh hưởng khi tăng nồng độ muối lên cao hơn 1.1 g/l. Tại nồng độ ammonium acetate 1.1 g/l tổng lượng dung môi cũng đạt khá thấp 4.22 g/l.
- MgSO4:
Muối MgSO4 được khảo sát ở các nồng độ 0, 50, 100, 200, 350 và 500 mg/l. Kết quả cho bởi bảng sau:
Bảng 11: Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 ban đầu tới quá trình lên men ABE.
MgSO4
Nồng độ (mg/l)
Nồng độ tế bào*
Butanol (g/l)
Acetone (g/l)
Ethanol (g/l)
Tổng ABE (g/l)
0 0.65 2.22 0.87 0.14 3.23
50-200 2.99 5.28 1.48 0.74 7.5
350-500 2.64 4.48 1.28 0.61 6.37
Có thể thấy rằng nồng độ tế bào vi sinh vật phụ thuộc khá nhiều vào sự hiện diện của Mg2+ trong dịch lên men. Khi không có mặt Mg2+ trong môi trường, sự sinh trưởng của vi khuẩn bị ức chế nhưng vẫn tổng hợp được dung môi với nồng độ khá thấp 3.23 g/l. Khi có mặt MgSO4 trong môi trường (50-200 mg/l), vi khuẩn phát triển rất tốt đồng thời khả năng tổng hợp dung môi cho hiệu suất cao nhất (7.5g/l). Có thể kết luận nồng độ muối MgSO4 tối ưu cho vi khuẩn phát triển nằm trong khoảng 50-200 mg/l. Khi tăng nồng độ lên 350-500 mg/l, tế bào vi khuẩn bắt đầu bị ức chế và khả năng tổng hợp dung môi cũng giảm rõ riệt (6.37 g/l).
- FeSO4:
Sự hiện diện của Fe2+ trong môi trường lên men ảnh hưởng đến khả năng phát triển của vi sinh vật. Khi môi trường tổng hợp chứa 1 mg FeSO4 trong 1L dung dịch, tế bào
5.5 g/l dung môi. Không có sự khác biệt đáng kể về khả năng sinh trưởng cũng như tổng hợp sản phẩm khi tăng nồng độ FeSO4 từ 1-50 mg/l. Tuy nhiên, khi môi trường không được cung cấp FeSO4, sự phát triển của vi khuẩn bị yếu đi, tổng lượng dung môi chỉ đạt 2.08 g/l.
d. Sự ức chế ngược của butanol trong quá trình lên men
Trong quá trình lên men ABE, butanol được sinh ra với tỉ lệ cao nhất và được xem là sản phẩm chính của quá trình lên men. Tuy nhiên, butanol cũng như những alcohol khác đều có ảnh hưởng xấu đến thành của tế bào vi khuẩn. Ở nồng độ cao, butanol có thể ngăn chặn sự vận chuyển chất dinh dưỡng qua thành tế bào, phá hủy chức năng của thành tế bào.
Trong nghiên cứu được thực hiện bởi Bowles và Ellefson (1985) để khảo sát ảnh hưởng của butanol đến khả năng sử dụng đường glucose của loài Clostridium acetobutylicum. Khả năng sử dụng đường của vi khuẩn được đỏnh giỏ thụng qua số àg glucose được tiêu thụ trên mg protein từ tế bào vi khuẩn tại một thời điểm của quá trình lên men. Thí nghiệm được tiến hành ở các nồng độ butanol ban đầu lần lượt là 0, 139, 167, 208, 236, 278 mM.
Hình 16: Ảnh hưởng của butanol lên khả năng sử dụng glucose của C. acetobutylicum.
0 mM butanol(●),139 mM butanol (○), 167 mM butanol (□), 208 mM butanol (■), 236 mM butanol (▲), 278 mM butanol ( )
Kết quả đã cho thấy rõ sự ức chế của butanol lên khả năng sử dụng cơ chất của vi khuẩn. Nguyên nhân chính có thể là do butanol đã làm cho tế bào mất khả năng duy trì pH bên trong tế bào làm rối loạn chức năng phân giải cơ chất, các ATPase của màng tế bào bị ức chế, ATP nội bào giảm.
Trong một nghiên cứu khác của Zhijie.S và Shijie.L (2010) tiến hành khảo sát ảnh hưởng của butanol đến khả năng lên men ABE của chủng C. acetobutylicum ATCC 824. Quá trình lên men ABE được thực hiện ở 37oC, nồng độ glucose ban đầu là 50 g/l, nồng độ butanol ban đầu trong dịch lên men lần lượt là 3, 6, 9, 12 g/l.
Hình 17: Ảnh hưởng của nồng độ butanol lên quá trình lên men ABE sử dụng chủng C. acetobutylicum ATCC 824. HAB: tổng acid acetic và butylic.
Từ kết quả trên có thể thấy nồng độ butanol ban đầu đã ảnh hưởng đến nồng độ các acid và dung môi trong dịch sau lên men. Khi nồng độ butanol ban đầu tăng lên, nồng độ các acid đã tăng lên và nồng độ dung môi lại giảm xuống. Khi nồng độ butanol ban đầu lớn hơn 6 g/l, vi khuẩn sử dụng glucose chủ yếu để tổng hợp acid làm cho hiệu suất tổng hợp các acid tăng mạnh và đạt cực đại 0.23 g/g trong khi hiệu suất tổng hợp butanol giảm nhanh chóng. Như vậy việc tăng nồng độ butanol đã ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật làm cho vi sinh vật trở về giai đoạn solventogenic chủ yếu sản sinh acid.
Có thề thấy butanol có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của vi sinh vật trong quá trình lên men, để đạt hiệu suất lên men cao cần có các biện pháp tách butanol ngay trong quá trình lên men giảm sự ức chế của butanol đến vi sinh vật. Các phương pháp tách butanol trong quá trình lên men nhằm nâng cao hiệu suất lên men sẽ được đề cập trong chương sau.