Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hiện nay nguồn thực phẩm sạch, đảm bảo vệ sinh, an toàn thực phẩm luôn là điều kiện đầu tiên mà người tiêu dùng quan tâm. Tuy nhiên, tình trạng mất vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng tăng, thực phẩm bị nhiễm bẫn, hư hỏng có nguy cơ ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe của người sử dụng. Hư hỏng cá và các sản phẩm thủy sản chủ yếu là do số lượng lớn phi protein nitrogen (NPN) như acid amin tự do, căn cứ nitơ dễ bay hơi (TVB-N) tức ammonia, trimethylamine (TMA), Creatine, taurine, axit uric, carnosine và histamine (Malle và Poumeyrol, 1989). TVB-N, TMA và amin dễ bay hơi khác thường được sử dụng như là chỉ báo cho sự suy giảm cá trong hải sản tươi sống và bảo quản nhẹ (Olafsdottir và cộng sự, 1997). Đó là lý do chúng ta cần phân tích các chỉ tiêu TVB-N và vi sinh vật gây bệnh trên nguyên liệu.
Nhóm nghiên cứu thực hiện bảo quản cá Tra fillet ở 5 chế độ nhiệt độ: 1 ± 1°C, 4 ± 1°C, 9 ± 1°C, 15 ± 1°C và 19 ± 1°C để xác định thời gian bảo quản tối đa của sản phẩm đáp ứng quy định về vi sinh vật gây bệnh E.coli và hàm lượng TVB-N cho phép. Do giới hạn về thời gian nghiên cứu, phạm ghi của đề tài này chỉ nghiên cứu bảo quản cá Tra fillet ở 4 chế độ nhiệt độ: 4 ± 1°C, 9 ± 1°C, 15 ± 1°C và 19 ± 1°C.
Hình 2. 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Cá Tra fillet đông lạnh
Rã đông Xếp khay Bảo quản
Khay
Định kỳ lấy mẫu
(7 điểm mẫu từ mỗi chế độ nhiệt độ) Kiểm tra các chỉ tiêu
Vi sinh vật gây bệnh:
Coliforms và E.coli Hóa học: TVB-N (1 ± 1°C) 4 ± 1°C 9 ± 1°C 15 ± 1°C 19 ± 1°C
Cá Tra fillet đông lạnh sau khi được vận chuyển về phòng thí nghiệm được rã đông chậm ở nhiệt độ lạnh trong ngăn lạnh của tủ lạnh, thời gian rã đông trong khoảng 18 giờ, mẫu có thể tiếp tục được rã đông ở nhiệt độ phòng đến khi gần đạt nhiệt độ bảo quản. Sau đó cá Tra fillet được xếp vào các khay xốp đã được mã hóa sẵn, bao một lớp màng co PE mỏng để tránh sự lây nhiễm vi sinh vật ở môi trường và hạn chế sự mất nước. Thao tác xử lý mẫu phải nhanh, chính xác, trong quá trình xử lý phải dùng găng tay. Tránh trường hợp vi sinh vật từ người, môi trường xung quanh, dụng cụ chứa đựng tiếp xúc trực tiếp với cá nhiễm vào làm sai lệch kết quả.
Trong quá trình khảo sát lấy định kỳ 7 điểm mẫu kiểm tra các chỉ tiêu về vi sinh vật gây bệnh (E.coli, Coliforms), TVB-N.
Quá trình thí nghiệm được lặp 3 lần độc lập đối với chế độ nhiệt độ 4
± 1 °C và 9 ± 1 °C với 3 lô khác nhau cho mỗi chế độ nhiệt độ này. Lô đầu tiên bảo quản đến khi mẫu bị hỏng, dùng để khảo sát thời gian bảo quản của mẫu, nhằm phân bố thời gian lấy 7 điểm mẫu thích hợp cho 2 lô sau.
Do giới hạn về thời gian, các chế độ nhiệt độ 15 ± 1 °C và 19 ± 1 °C chỉ thí nghiệm 1 lần.
Bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự biến đổi của vi sinh vật gây bệnh (Coliforms, E.coli) trong thời gian bảo quản lạnh cá Tra fillet [7,8]
Tỷ lệ mẫu: dịch pha mẫu là 1:9. Dùng kéo vô trùng gắp mẫu và cân 25g khối lượng mẫu cho vào bị vô trùng. Đồng nhất mẫu trong vòng 30 giây, dùng ống đong vô trùng đong 225ml đệm phosphat (được pha và hấp vô trùng) cho vào bị mẫu. Các thao tác này đều được thực hiện cạnh ngọn lửa đèn cồn vì chỉ tiêu đang kiểm tra là chỉ tiêu vi sinh nên rất có thể bị nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài vào.
Dùng micropipet hút 1ml dịch mẫu ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 vào ống nghiệm chứa ống Duham đã được mã hóa sẵn có môi trường dinh dưỡng thuận lợi cho sự phát triển của VSV (Coliforms). Sau đó lắc đều và đem đi ủ ấm trong tủ ấm. Sau 24h đọc kết quả.
Kết quả được xác định bằng cách lắc đều các ống nuôi cấy VSV. Các ống sinh hơi mạnh, có bọt khí đi lên nhiều thể hiện sự có mặt của Coliforms, các ống sinh hơi này sẽ được cấy ria trên môi trường EMP để xác định được sự có mặt của E. coli đặc trưng. Khuẩn lạc rời đỏ tím, ánh kim. Đọc kết quả E.coli sau 24 giờ ủ trong tủ ấm 350C vì khi cấy trên môi trường EMP có thể xuất hiện sự dương tính giả.
Các khuẩn lạc rời đặc trưng của E.coli được cấy vào trong môi trường peptoncasein sau đó ủ ở 350C và kiểm tra lại bằng kovac. Kiểm tra bằng cách cho từ từ 0,1ml dung dịch kovac vào các ống nghiệm peptoncasein đã nuôi cấy E.coli nếu xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường nuôi vi sinh vật thể hiện sự có mặt của E.coli.
Hình 2. 2. Quy trình tóm tắt xác định vi sinh vật gây bệnh Coliforms, E.coli
Test kovac đếm số ống dương tính
E.coli
Ghi nhận ống dương tính (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng
Cấy ống dương tính lên EMB Ủ ở 350C/24 – 48giờ
Chọn khuẩn lạc điển hình cấy trên peptoncasein Ủ ở 350C/24-48 giờ
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 … vào ống chứa 5ml LSB (mỗi nồng độ pha loãng cấy 3 ống lặp lại)
Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4… Chuẫn bị mẫu: cân 25g mẫu + 225ml dung dịch đệm
phosphate. Đồng nhất mẫu
Bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự biến đổi của tổng bazơ nitơ bay hơi (TVB-N) trên cá Tra fillet trong thời gian bảo quản lạnh
Tổng bazơ nitơ bay hơi được xác định theo phương pháp chưng cất lôi cuốn bằng hơi nước trong thiết bị chưng cất đạm bán tự động (Gerthard, Germany) theo phương pháp của Malle và Poumeyrol (1989). Tổng bazơ nitơ dễ bay hơi được tách chiết bằng dung dịch acid trichloroacetic 7,5%; dịch ngưng tụ được thu nhận trong dung dịch acid boric sau đó được chuẩn độ bằng acid sulphuric. [8,60]
Xác định tổng bazơ nitơ bay hơi
o Lấy mẫu tại các thời gian tương đương với thời gian lấy mẫu đi kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh.
Bước 1: Đồng nhất 100g mẫu bằng cách làm nhỏ sơ bộ sau đó dùng ống đong đong 200ml TCA (trichloroacetic) cho vào cùng với mẫu dùng máy xay sinh tố, đồng nhất trong thời gian khoảng 2 phút.
Bước 2: Hỗn hợp sau khi xay được lọc qua giấy lọc, dịch lọc trong, sau đó thu dịch lọc vào trong lọ thủy tinh bảo quản ở nhiệt độ lạnh trong vòng 1 tuần.
Hơi nước chưng cất được sử dụng bằng thiết bị chưng thủ công.
Bước 3: 25ml dịch lọc được chuyển vào một bình cất thêm 6ml dung dịch NaOH 10%.
Bước 4: Cho vào cốc hứng (bình tam giác 50ml) lần lượt các dung dịch sau: 10 ml acid boric 4%, 0,04 ml metyl đỏ, 0,04 ml chất chỉ thị bromocresol màu xanh lá.
Bước 5: Quá trình chưng được bắt đầu, tiếp tục chưng tới khi lượng dịch cất trong cốc hứng đạt 40ml dịch cất. Dung dịch trong cốc hứng chuyển dần từ màu hồng sang màu xanh, màu xanh nhạt dần. Sau khi chưng
cất xong thu được dịch cất đem chuẩn độ với dung dịch acid sulfuric 0,025 N.
Trung hòa tới khi dịch có màu phớt hồng thì quá trình dừng lại. Đọc lượng acid sulfuric đã dùng để chuẩn độ.
×××⁄
(mgN 100g⁄ ) Trong đó:
a. Số ml acid sulfuric tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ.
b. Nồng độ mol acid sunfuric dùng trong quá trình chuẩn độ.
Hình 2. 3. Quy trình tóm tắt xác định TVB-N 2.2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Phần mềm MS-EXCEL 2007 được dùng để tính các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị. Phần mềm SPSS 16.0 được sử dụng trong xử lý thống kê ANOVA (Analysis of Variance, phân tích phương sai) và kiểm định Tukey để kiểm tra sự khác nhau giữa các giá trị trung bình với mức ý nghĩa α
= 0,05.
Đồng nhất mẫu: 100g mẫu + 200ml TCA
Lọc
Mẫu chưng: 25ml dịch lọc + 6ml NaOH 10%
Cốc hứng: 10 ml acid boric 4% + 0,04 ml metyl đỏ + 0,04 ml chất chỉ thị bromocresol màu xanh lá
Chưng