2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Thời gian
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/2021 đến tháng 05/2022.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Kỹ thuật thực phẩm, phòng thí nghiệm Hóa sinh, phòng thí nghiệm Phát triển sản phẩm và phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sau thu hoạch Khoa Công Nghệ Hoá học và Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM.
2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị sử dụng
2.2.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu trái nhàu được lựa chọn cho quá trình nghiên cứu là trái nhàu
tươi được thu mua tại Tiền giang. Yêu cầu nguyên liệu đạt độ chín đồng đều từ 2/3
trái nhàu trở lên, không bị giập nát, không bị sâu bệnh, hư hỏng. Nhàu tươi sau khi
thu mua được rửa sạch tạp chất bên ngoài. Nguyên liệu sau đó được bảo quản trong tủ đông (-10°C). Trái nhàu đông lạnh được rã đông ở nhiệt độ môi trường trước khi đem đi cắt lát, bề dày 4mm, sau đó được đem sấy ở 60°C trong 7-8 giờ đến độ âm nguyên liệu đạt đưới 12%. Nhàu sau khi sấy khô được xay, nghiền và rây với kích
thước lưới sàng 0,5 mm. Bột nhàu được bảo quan kin trong tủ đông ở (-18°C) + 3°C
dùng tiến hành trích ly các hợp chat sinh học.
Dịch nhàu dùng tạo hỗn hợp dịch sấy phun được chuẩn bị theo phương pháp
cua Diem va cộng sự (2022). Xử lí siêu âm với tỉ lệ nước/ bột nhau 16/1 (ml/g),
điều kiện xử lí siêu âm được có định 6 50°C trong 10 phút vớ tần sô 37 kHz, điều kiện trích ly tổ ưu la nồng độ enzyme 1%, nhiệt độ ủ 60°C va thời gian ủ 51 phút.
2.2.2. Hóa chất
Chất nhũ hoá (soy lecithin, Tween 80, sugar ester, tinh bột bién tinh va protein) va chat béo (MCT, Medium Chain Triglyceride va axit stearic)
Chất bao: whey protein (Pháp), gum Arabic (Pháp), maltodextrin (Pháp), B-
cyclodextrin (Anh), gelatin (Phap), collagen, alginate Phenoltalein. (Merck, Đức)
Sodium nitrite (Merck, Duc)
Aluminum chloride (Merck, Đức)
Muối hydroxide 4%. (Merck, Đức)
Quercetin. (IDQC/VN)
Dung dich Folin-Ciocalteau. (Merck, Đức)
Dung dich muối carbonate (50/1).
Acid gallic.
Dung dich vanillin 8%.
Acid sulphuric (Merck, Đức) Aecsin. (EP)
Dung dich acid oxalic 1%.
2,6 dichloro-phenol-indophenol 0,02%.
2.2.3. Dung cu va thiét bi
Dung cu
Céc thuy tinh (50mL, 100mL, 250mL, 500mL),
Binh định mức (100mL, 250mL, 1000mL), ống đong (250mL, 500mL) Giấy lọc, giấy bạc, ống ly tâm 50mL, micropipette 100 wL, 1000 pL Ong dong (250mL, 500mL)
Pipette thủy tinh 10mL, 1ml, 2ml, 5ml
Cuvette 1.5mL, nhiệt kế thủy ngân
Binh tam giác (100mL, 250mL),
Thiét bi
Máy xay sinh tố (Philip)
Máy cắt lát rau quả (Việt Nam)
Cân phân tích 4 số lẻ (Ohaus Pioneer, Mỹ) Tủ say + 1°C (Memert, Đức)
Máy Quang phô UV-Vis Genesys 10S (Thermo, Mỹ)
Máy đo pH 7710 (InoLab, Đức)
Cân sấy am héng ngoai (SHS, Nhat Ban)
May đồng hóa mau bằng siêu âm (Hielshcer, Đức) Máy sấy phun, sấy bơm nhiệt
Máy ly tâm 6000rpm (Hermle, Đức)
Máy đồng hóa mẫu (Velp, Ý) Thiết bị lọc chân không
Tủ lạnh (LG, Hàn Quốc) Kính hiển vi điện tử (SEM)
Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS, LC-MS/MS)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ trái nhàu
Đề chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu, trái nhàu tươi được xử lý thu nhận dịch trích ly theo kết quả của Diem và cộng sự (2022).
Sơ đồ quy trình
Vỏ bao
Nước > Hỗn hợp
Dịch nhàu - |
Đông hóa
Ỷ
Say phun
Bảo quản
|
Phan tich cac chi tiéu
Hình 2.1. Quy trình say phun bột nhàu 2.3.2. Thuyết minh quy trình
Hỗn hợp dịch được chuẩn bị gồm vỏ bao, nước và dịch nhàu. Vỏ bao được khuấy đều trong nước 4m (nước cất - khoảng 50°C) cho tan hoàn toàn dé tránh tình trạng dịch bị vón cục sau khi đồng hóa. Dịch trích nhàu sau khi cô đặc lạnh đông ở nhiệt độ -10°C trong 6 giờ và sau đó được rã đông trong 20 phút nhằm mục đích để tách nước và thu dịch cô đặc giàu các hợp chất sinh học. Dịch nhàu được cho thêm từ từ vào dung dịch vỏ bao, vừa cho vào vừa khuấy ở tốc độ chậm. Tỉ lệ khối lượng phối trộn giữa dung dich vỏ bao và dich nhàu cô đặc là 8:2.
Đồng hóa: sử dụng máy đồng hóa dé đồng hóa hỗn hợp dịch nhằm dé khuấy trộn và phân tán các hạt lỏng đồng đều trong lòng dung dịch, tạo thành dịch vi bao nhàu. Hỗn hợp dich nhàu và vỏ bao được tiễn hành đồng hóa ở tốc độ 10 000
vòng/phút trong 5 phút.
Hỗn hợp dịch nhàu được mang đi sấy phun với tốc độ nhập liệu là 2,5 lit/gid.
Tốc độ Automizer 15000 vòng/phút. Nhiệt độ đầu vào và tốc độ nhập liệu theo từng nội dung thí nghiệm. Khi nhiệt độ vào đạt theo yêu cầu từng thí nghiệm và nhiệt độ đầu ra là 100°C thì bắt đầu hút dịch vào sấy, nhằm tạo một lớp bột tráng máy và điều chỉnh nhiệt độ đầu ra cho phù hợp. Nhiệt độ đầu ra xuống nhiệt độ mong muốn thì lấy lượng bột tráng máy ra và bắt đầu quá trình sấy phun. Nhiệt độ đầu vào có thê chỉnh theo thông số máy nhưng muốn chỉnh nhiệt độ đầu ra cần thay đổi tốc độ
nhập liệu.
Bột nhàu sấy phun sau khi thu nhận đóng vào túi zip trang bạc và mang ghép mí dé tránh bột nhàu hút âm khi bột còn nóng. Dé bột nhàu nguội bảo quản trong tủ đông và mang đi đo hàm lượng chất có hoạt tính sinh học đã được vi bao trong bằng phương pháp say phun.
Phân tích các chỉ tiêu: dịch sau khi được thanh trùng được phân tích các chỉ
tiêu gồm tổng hàm lượng polyphenol (TPC), flavonoid (TFC), triterpenoid saponin
(TSC) .
2.4. Bồ trí thí nghiệm
2.4.1. Thí nghiệm 1: Xác định công thức vỏ bao
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố (công thức vỏ bao) với 3 lần lặp lại. Công thức vỏ bao là tỉ lệ gum arabic và maltodextrin (w/w) với các tỉ
lệ: 1:1, 1:2, 1:3, 2:1, và 3:1.
Yếu tố có định bao gồm: đồng hóa ở tốc độ 10000 v/p trong thời gian 5 phút, Khối lượng dịch say 400g dich mỗi mẻ, nồng độ vỏ bao 20% (g/g), nhiệt độ đầu vào
150°C, tốc độ nhập liệu 2 lit/h, và tốc độ đầu phun (Automizer): 15.000 vòng/phút.
Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất thu hồi bột, độ âm, hoạt độ nước, hàm lượng polyphenol tổng (TPC), hàm lượng flavonoid tổng (TFC), triterpenoid saponin
(TSC), và hàm lượng Vitamin C.
2.4.2. Thí nghiệm 2: Xác định nồng độ chất tạo màng trong dịch sấy
Thí nghiệm được bồ trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố (nồng độ vỏ bao) với 3 lần lặp lại. Nong độ vỏ bao (gum arabic va maltodextrin (w/w)) trong dich say phun với các nồng độ: 20%, 25%, 30%.
Yếu tố có định bao gồm: đồng hóa ở tốc độ 10000 v/p trong thời gian 5 phút, Khối lượng dịch sấy 400g dịch mỗi mẻ, nhiệt độ đầu vào 150°C, tốc độ nhập liệu 2 lit/h, và tốc độ đầu phun (Automizer): 15.000 vòng/phút, công thức vỏ bao tìm được
tại thí nghiệm 1.
Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất thu hồi bột, độ âm, hoạt độ nước, hàm lượng polyphenol tổng (TPC), hàm lượng flavonoid tổng (TFC), triterpenoid saponin
(TSC), và ham lượng Vitamin C.
2.4.3. Thí nghiệm 3: Xác định nhiệt độ đầu vào
Sau khi kết thúc thí nghiệm | và 2 ta tìm được loại vỏ bao và nồng độ vỏ bao trong dịch mang sấy. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố (nhiệt độ đầu vào) với 3 lần lặp lại. Nhiệt độ đầu vào lần lượt là 140°C, 150 °C, 160 °C,
170°C, 180°C.
Yếu tố có định bao gồm: đồng hóa ở tốc độ 10000 v/p trong thời gian 5 phút, Khối lượng dich say 400g dịch mỗi mẻ, tốc độ nhập liệu 2 lit/h, và tốc độ đầu phun (Automizer): 15.000 vòng/phút, công thức vỏ bao tìm được tại thí nghiệm 1, nồng độ chất bao tìm được tại thí nghiệm 2.
Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất thu hồi bột, độ âm, hoạt độ nước, hàm lượng polyphenol tổng (TPC), hàm lượng flavonoid tổng (TFC), triterpenoid saponin
(TSC), và hàm lượng Vitamin C.
2.4.4. Thí nghiệm 4: Xác định nhiệt độ đầu ra
Sau khi kết thúc thí nghiệm 1, 2 và 3, xác định được loại vỏ bao, nồng độ vỏ bao trong dịch mang sấy và nhiệt độ đầu vào cho quá trình say phun.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố (nhiệt độ đầu ra) với 3 lần lặp lại. Nhiệt độ đầu ra lần lượt là 82 - 83 °C, 87 - 88°C, 91 - 93°C, 97 — 98°C.
Yếu tố cô định bao gồm: đồng hóa ở tốc độ 10000 v/p trong thời gian 5 phút, Khối lượng dịch sấy 400g dich mỗi mẻ, tốc độ nhập liệu thay đổi dé dat được nhiệt độ đầu ra mong muốn, tốc độ đầu phun (Automizer): 15.000 vòng/phút, công thức vỏ bao tìm được tại thí nghiệm 1, nồng độ chất bao tìm được tại thí nghiệm 2 và nhiệt độ đầu vào ở thí nghiệm 3.
Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất thu hồi bột, độ ẩm, hoạt độ nước, hàm lượng polyphenol tổng (TPC), hàm lượng flavonoid tổng (TFC), triterpenoid saponin
(TSC), và hàm lượng Vitamin C.
2.4.5. Thí nghiệm 5: Tối ưu quá trình sấy theo nhiệt độ đầu va ra
Thí nghiệm được bố trí theo 2 yếu tố (dung phần mềm JMP 13 thiết kế các công thức nhiệt độ sấy) với 3 lần lặp lại. Từ các thí nghiệm một yếu tô đơn (nhiệt độ sấy phun đầu vào và đầu ra), khoảng nhiệt độ sấy phun đầu vào và đầu ra lần lượt được chọn. Mục đích xác định chế độ sây phun tối ưu (nhiệt độ đầu vào và đầu ra) nhằm tạo ra bột vi bao các hợp chất có hoạt tính sinh học có tính ôn định cao.
. Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng dé tối ưu hoá chế độ sấy phun dựa vào các chỉ tiêu hiệu suất vi bao tính theo TPC, TFC, va TSC (giá trị tối đa), hoạt độ nước (<0,6) và độ am.
Yếu tố có định bao gồm: đồng hóa ở tốc độ 10000 v/p trong thời gian 5 phút, Khối lượng dich sấy 400g dịch mỗi mẻ, nhiệt độ đầu vào và ra theo bảng bố trí thí nghiệm, tốc độ nhập liệu chỉnh theo nhiệt độ mong muốn ở đầu ra (lit/h), va tốc độ đầu phun (Automizer): 15.000 vòng/phút
Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất thu hồi bột, độ âm, hoạt độ nước, hàm lượng polyphenol tổng (TPC), hàm lượng flavonoid tổng (TFC), triterpenoid saponin
(TSC), và hàm lượng Vitamin C.
Phương trình hồi quy sử dung dé dự đoán sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào các yếu tố thí nghiệm là một đa thức bậc hai có dạng như sau:
Y =ao+aiXi †a¿X¿ + aiaXIX¿ + ayy Xy2 + A22ÃX22 Trong do:
Y là hàm mục tiêu. Xj: nhiệt độ đầu vào (CC); Xa: nhiệt độ đầu ra (°C)
Với bọ là hệ số góc, ay, a2, a1), ai; là các hệ số hồi quy; X; X; là biến số bậc 1;
Xịa, Xz là biến số bậc 2 độc lập; XX biểu thị sự tương tác giữa các biến.
2.4.6. Thí nghiệm 6: Bảo quản bột nhàu sấy phun
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tô (công thức vỏ bao) với 3 lần lặp lại. Các nhiệt độ bảo quản mẫu nhau là nhiệt độ ngăn mát tủ lạnh (8-9 °C),
nhiệt độ phòng, 40°C và 50°C
Mẫu bột nhàu đồng nhất được cân và chia vào các túi với khối lượng đồng đều, được ghép kín đảm bảo hạn chế tối đa việc tiếp xúc với không khí.
Chỉ tiêu theo dõi: các biến đổi theo thời gian, độ ẩm, hoạt độ nước, hàm lượng polyphenol tổng (TPC), hàm lượng flavonoid tổng (TFC), triterpenoid saponin
(TSC).
Nghiên cứu đường cong hấp thụ/ hap phụ
Các dung dịch muối bão hoà sử dụng là NaOH, LiCl, CH;COOK, K;CO¿, Mg(NO2);, NaCl, KCl dé tạo ra các môi trường có hoạt độ nước (độ am tuong đói) khác nhau. Mau bột vi bao (5 g) được cho vào các bình (có độ kin cao) có độ am tương đối khác nhau (RH từ 6 đến 87%) và bao quan ở nhiệt độ môi trường. Sau khi cân bang âm, tiến hành xác định độ 4m của bột vi bao. Dựa vào các mô hình BET va GAB, tính toán độ 4m cân bằng của bột.
2.5. Phương pháp phân tích
Am độ: bột nhau sau khi say phun được mang di đo 4m bằng thiết bị đo âm hồng ngoại, sấy ở nhiệt độ 105°C đến khối lượng không đổi tại phòng thí nghiệm hóa sinh của khoa Công nghệ thực phẩm.
Hoạt tính nước: Máy đo hoạt độ nước (Aqualab của Mỹ) được sử dụng dé
đo hoạt độ nước của bột vi bao.
Cấu trúc hạt vi bao dạng rắn: sử dụng phương pháp SEM để quan sát và chụp lại hình ảnh của hạt bột sau khi sấy và đánh giá chất lượng sấy phun vi bao, được xác định bằng phương pháp quan sát và chụp anh bằng kính hién vi điện tử quét (SEM-Scanning Electron Microscopy). Mẫu được gửi phân tích tại Viện Han Lâm Công nghệ Hoá học (Số 1, Mac Dinh Chi, Quan 1, Thanh phố Hồ Chí Minh.
Mục đích của việc quan sát hat vi bao dé kiểm tra cấu trúc của hạt bột sau khi vi bao, đánh giá hoạt chất và chất bao dưới dạng hình ảnh thực tế trong từng phần tử
bột nhàu.
Để phân tích hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nhàu cần hoàn nguyên bột nhàu: lấy lượng bột nhàu xác định hoàn nguyên theo nồng độ ban đầu của dịch vi bao trước khi sấy (tổng hàm lượng chất khô bao gồm chat vi bao và lượng chất khô cần vi bao với nước theo đúng tỉ lệ trước khi sấy)
Phân tích flavonoid tổng (TFC): Hàm lượng flavonoid tổng của các mẫu được xác định bằng phương pháp quang phố (Wu và cộng sự, 2008). Khoảng 0,5 ml mẫu được trộn với 2 ml nước cất, tiếp theo bổ sung 150 pL of 5% (w/v) dung dich sodium nitrite. Sau 6 min, b6 sung 150 uL dung dịch 10% aluminum chloride (w/v) vào hỗn hợp va ủ trong 6 phút ở nhiệt độ môi trường. Tiếp đến, bổ sung 2 mL muối hydroxide 4% (w/v) và bổ sung nước cất đến thể tích 5 mL, tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tối trong 15 phút. Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 510 nm. Quercetin được sử dụng là chất chuẩn. Kết quả đo hàm lượng flavonoid tổng được biểu diễn là mg rutin tương tương trong đơn vị khối lượng (mg RE/g).
Phân tích triterpenoid saponin (TSC): Hàm lượng triterpenoid saponin
tổng được xác định bang phương pháp tổng quang phổ (Sing P Tan va cộng sự ,
2014). Dịch trích (0,3 ml) được trộn với 8% (w/v) dung dich vanillin (0,3 ml) va
72% (v/v) axit sulphuric (3 mL). Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 60°C trong 15 phút và làm nguội trong nước đá trong 10 phút. Tiến hành đo độ hấp thu của dung dich ở bước sóng 560 nm. Aecsin được sử dụng là chất chuẩn. Hàm lượng triterpenoid saponin được biểu diễn bằng mg Aecsin tương đương trong đơn vị khối lượng (mg
AE/g).
Phân tích Polyphenol (TPC) Ham lượng polyphenol tổng được xác định bằng phương pháp quang phô (Singleton và cộng sự, 1999). Dịch trích mẫu hoặc dung dịch chuẩn (0,5 ml) được trộn với 2,5 ml dung dịch Folin-Ciocalteau 10% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, tiếp theo bổ sung 2,4 ml dung dịch NazCO; 7.5%.
Dung dịch được lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ và đo độ hap thụ ở bước
sóng 765 nm. Axit gallic được sử dung là chất chuan và hàm lượng polyphenol tông được biểu diễn bằng mg gallic tương đương trong đơn vị khối lượng (mg GAE/g
vek)..
Phan tích axit ascorbic: Ham lượng axit ascorbic được xác định bang
phương pháp chuẩn độ (Instituto Adolfo Lutz, 2008). Cân 1 g mẫu và đồng hoá trong 5 ml dung dich axit oxalic 1%. Dung dịch được chuẩn độ với 2,6 dichloro- phenol-indophenol 0,02% đến khi màu hồng bền xuất hiện. Hàm lượng axít ascorbic được biểu diễn bằng mg/100g.
Hiệu suất vi bao bột
Hiệu suất vi bao dạng bột tính theo TPC, TFC, và TSC la phần trăm hàm
lượng TPC (mg GAE/ g, vck), TFC (mg QE/ g, vck), và TSC (mg AE/ g, vck) trong
dung dich trước khi sấy phun so với bột thu được sau khi say phun (tính theo vật chất khô) (Tan và cộng sự, 2015).
Tinh thời gian bao quản theo Qj
Q¡o là sự gia tăng tỷ lệ phản ứng khi nhiệt độ tăng lên 10°C (18°F). Ví dụ, nếu một thực phẩm có tính ồn định ở 20 tuần ở 20 °C và 10 tuần ở 30°C, thì Qi sẽ 20/10 = 2. Nghĩa là, tốc độ phản ứng tăng gấp đôi khi nhiệt độ tăng 10°C.
Bước đầu tiên trong việc thiết lập một nghiên cứu về thời hạn sử dụng là chọn chỉ tiêu theo dõi phù hợp ở nhiệt độ bảo quản, có thể định lượng được và có thể được sử dụng như một chỉ số về giảm chất lượng. Nhiệt độ bảo quản chọn cho
nghiên cứu này là 40 va 50°C; nhiệt độ bảo quản mát (<10°C) cho vi bao dạng bột
làm đối chứng
Áp dụng phương trình tính thời gian bảo quản theo Phương trình Labuza:
ty = tr x Quê”
Trong do:
A =T,- T là su chênh lệch giữa hai nhiệt độ
T¡: nhiệt độ gia tốc
T;: nhiệt độ bảo quản dự kiến (mong muốn) tị là thời gian kiểm tra ở nhiệt độ T,
ty là thời gian kiểm tra ở nhiệt độ T>
Đường cong hấp phụ của bột vi bao
Các dung dịch muối bão hoà sử dụng là NaOH, LiCl, CH:COOK, K;CO¿, Mg(NO2);, NaCl, KCl dé tạo ra các môi trường có hoạt độ nước (độ am tuong đối) khác nhau. Mau bột vi bao (5 g) được cho vào các bình (có độ kin cao) có độ am tương đối khác nhau (RH từ 6 đến 87%) và bao quan ở nhiệt độ môi trường. Sau khi cân bằng ầm, tiến hành xác định độ âm của bột vi bao. Dựa vào các mô hình BET và GAB, tính toán độ âm cân bằng của bột.
Độ âm cân bằng của bột vi bao tối ưu được tính bằng phương trình Brunauer
Emmett Teller (BET) và Gugenheim Anderson de Boer (GAB) (Lee và Lee, 2008) nhu sau:
BET:
McCAw
M, = (1—-Ay)f + (6 = Ay]
GAB:
— M,C,K;Aw
° (1 — K,Aw)(1 — Kg Aw + CK Aw)
Trong đó M, là độ âm của bột vi bao tinh bang g trên 100 g vck; M, là g nước tương đương với lớp đơn phân tử bị hấp phụ trên 100 g chất rắn khô; Aw là hoạt độ nước ở độ âm MC; C là hang số BET; Cy, Kg va Cg là các tham số phương
trình GAB.
2.6. Phân tích thống kê
Các thí nghiệm nghiên cứu được thực hiện với một số lượng mẫu nhất định nhằm tìm sự khác biệt có ý nghĩa bằng phương pháp phân tích thống kê. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1, 2 hoặc 3 yếu tố. Thí nghiệm tối ưu được bồ trí theo phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodogloy). Số liệu của các thí nghiệm được phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 25.0 và JMP 13.0. Kết quả được trình bay bằng giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (Mean+SD).
Sự khác biệt giữa các giá trị trung bình được kiểm chứng bằng ANOVA (Analysis
of Variance) va LST ở mức ý nghĩa 5% (P<0,05).