CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
3.3 NỘI DUNG NGHIÊN cứu
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Nguyên liệu - thịt đầu tôm sú
'r
Xác định tỷ lệ mẫu: dung môi tối ưu cho quá trình trích ly enzyme protease
'r
Xác định pH của dung môi tối ưu cho quá ừình trích ly enzyme
'r
Tối ưu hóa điều kiện tích ly enzyme protease từ đầu tôm (nhiệt độ, thời gian) bằng phương pháp bề mặt đáp ứng
Hình 3.1 Sơ đồ bổ trí thí nghiệm tổng quát
3.3.2 Xác định thành phần hóa lý và hoạt tính protease ban đầu có trong thịt đầu tôm
Mục đích: Xác định thành phần hóa lý cơ bản (độ ẩm, protein, pH) và hoạt tính protease của nguyên liệu thịt đầu tôm sú được thu nhận ở các thời điểm khác nhau, làm cơ sở cho việc chuẩn bị nguồn nguyên liệu đồng đều đối với các khảo sát trích ly protease tiếp theo.
Cách tiến hành:
- Tiến hành lấy mẫu ở nhiều đợt khác nhau (5 đợt mẫu, 5 kg/đợt).
- Mầu sau khi được xử lý sơ bộ, để ráo nước được sử dụng để phân tích thành phần hóa lý ban đầu.
- Lấy mẫu ở ít nhất 5 vị trí khác nhau trên khối nguyên liệu cho một lần khảo sát.
- Kiểm tra độ ẩm, protein, pH có trong mẫu theo phương pháp được trình bày ở bảng 3.1.
- Trích ly protease
Ket quả thu nhân'. Đánh giá đặc điểm, thành phần của nguồn nguyên liệu thịt đầu tôm sú
3.3.3 Thí nghiệm 1: Xác định tỷ lệ mẫu và dung môi trích ly protease từ thịt đầu tôm sú phù họp
Mục đích: Tìm ra tỷ lệ nước cất bổ sung thích hợp vào mẫu thịt đầu tôm sú giúp quá trình trích ly protease đạt hiệu quả cao nhất.
Bổ trí thí nghiệm'. Thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố
Nhân tố A: Tỷ lệ mẫu và nước cất (w/v), thay đổi ở 6 mức độ.
Ai: 1: 1 A 3 : l : 3 AS: 1 : 5 A 2 : l : 2 Aa:\-.A A 6 : 1 : ổ Số nghiệm thức: 6.
Số mẫu thí nghiệm: 3 x 6 = 1 8 mẫu.
Khối lượng mẫu sử dụng: 18 X 0,2 kg/mẫu = 3 , 6 kg.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trĩnh bày ở Hình 3.2.
Thịt đầu tôm sú i Trữ đông
Nghiền„ L
Tỷ lệ mẫu:dung môi khác nhau
Ai Ai A3 A4 A5 Aó
I J_ L_jJ I
ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, 20 phút ị.
Lọc, ly tâm ị Dịch chiết
Xác định hoạt tính protease Hình 3.2 Sơ đồ bổ trí thí nghiệm 1
Tiến hành thí nghiệm: Nguyên liệu thịt đầu tôm được đem về trữ đông tại phòng thí nghiệm của bộ môn. Sau đó tiến hành ữích ly và xác định hoạt tính enzyme protease ở các tỷ lệ mẫu: dung môi khác nhau (thay đổi ở 6 mức độ). Việc trích ly protease được thực hiện theo phương pháp được trình bày ở mục 3.2.3. Ở thí nghiệm này, dung môi trích ly sử dụng là nước cất với các tỷ lệ thay đổi theo các nghiệm thức
khảo sát (từ 1: 1 đến 1: 6, w/v), tiến hành trích ly ở nhiệt độ phòng (30 ± 2 °C) trong thời gian 20 phút (hình 3.2). Sau quá trình trích ly, dịch enzyme thô sau khi ly tâm được xác định thể tích và đo hoạt tính theo phương pháp Anson cải tiến.
Chỉ tiêu theo dõi'. Khối lượng và độ ẩm nguyên liệu, thể tích dịch chiết enzyme tương ứng và hoạt tính của protease có trong mẫu khảo sát (U/g CKTĐT).
Kết quả thu nhận: Tỷ lệ mẫu thịt đầu tôm và dung môi sử dụng phù hợp giúp hiệu quả thu nhận protease đạt cao nhất.
3.3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả trích ly protease
Mục đích: Xác định được khoảng pH thích hợp (điều chỉnh bằng dung dịch đệm khác nhau) giúp thu được protease từ mẫu thịt đầu tôm nguyên liệu có hoạt tính cao nhất.
Bố trí thỉ nghiệm'. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên YỚi 1 nhân tố
Nhân tố B: Sự thay đổi pH của dung môi trích ly, thay đổi ở 6 mức độ Bi: pH = 7 B2: pH = 8 B3: pH = 9
B4: pH = 10 B5: pH = 11 Bo: Đối chứng (nước cất 2 lần).
Số nghiệm thức khảo sát: 5 + 1 mẫu đối chứng (trích ly bằng nước cất).
Số mẫu thí nghiệm: 6x3 = 18 mẫu.
Khối lượng mẫu sử dụng: 18 X 0,2 kg/mẫu = 3,6 kg.
Tiến hành thỉ nghiệm: Quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm được thực hiện tương tự như thí nghiệm 1. Thay thế nước cất bằng các dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau, bao gồm dung dịch đệm phosphate (pH 7, 8), đệm Glycine - NaOH (pH 9
^ 11). Tỷ lệ mẫu và dung môi được sử dụng dựa trên kết quả của thí nghiệm 1. Điều kiện ủ và phương pháp tách chiết giữ cố định (Hình 3.3)
Tỷ lệ mẫu : dung mội (Thí nghiệm 2)
Chỉ tiêu theo dõi'. Hoạt tính của protease (U/g CKTĐT) tương ứng với các nghiệm thức khảo sát.
Kết quả thu nhận: Loại dung dịch đệm và pH thích hợp được sử dụng làm dung môi trích ly protease có hoạt tính cao nhất.
pH của dung
B 1 B 2 B 3 B 4 B 5 B o
Dịch chiết ị
Xác định hoạt tính protease Hình 3.3 Stf đồ bổ trí thí nghiệm 2
3.3.5 Thí nghiêm 3: Xác đinh tưong tác của nhiêt đô và thòi gian ủ đến hiêu
9 • • 9 • • o •
quả trích ly protease
Mục đích: Xác định được nhiệt độ trích ly và thời gian ngâm thích hợp cho quá trình trích ly protease từ mẫu thịt đầu tôm nguyên liệu có hoạt tính cao nhất bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
Bổ trí thỉ nghiệm'. Thí nghiệm tiến hành với 2 nhân tố Nhân tố C: Nhiệt độ ủ (trích ly), thay đổi ở 5 mức độ
Sử dụng phương án trực giao cấp 2 với số nghiệm thức tối ưu: N = 3x5 = 15, trong đó có một thí nghiệm ở tâm phương án. Bổ sung thêm ba thí nghiệmở tâm để kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi quy.
Tổng số đơn vị thí nghiệm (đvtn): 15 + 3 = 18 đvtn.
Số mẫu thí nghiệm: 1 8 x 3 = 54 mẫu.
Khối lượng mẫu sử dụng: 54 X 0,2 kg/mẫu = 10,8 kg.
Tiến hành thỉ nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện dựa trên quy trình trích ly ở mục 3.2.3 và các thông số thích họp đã được lựa chọn từ thí nghiệm 1, 2). Mẩu sau khi nghiền được ủ theo 18 đvtn (Bảng 3.2). Tương ứng với từng điều kiện khảo sát, lọc và ly tâm, thu dịch chiết enzyme (Hình 3.4).
Ci: 30 °c (mức thấp nhất, -2).
c2: 40 °c (-1).
c3: 50 °c (tâm, 0).
c4: 60 °c (+1).
c5: 70 °c (mức cao nhất, +2).
Thời gian ngâm trích, thay đổi ở 3 mức độ Di: 20 phút (thấp nhất, -1).
D2: 40 phút (tâm, 0).
D3: 60 phút (cao nhất, +1).
Thịt đàu tôm sú ị Trữ đông Tỷ lê mẫu : dung môi (TN2) fẰ
„1---► Nghiền pH và dung môi trích ly (TN3)
y ủ (ngâm trích)
Quy hoạch thực nghiệm 2 biến, cấu trúc có tâm (Nhiệt độ: -2 đến +2; Thời gian: -1 đến +1)
N = 18 đon vị thí nghiệm Lọc, ly tâm
L.
Dịch chiết ị
Xác định hoạt tính protease 'ị Thiết lập phương ừình hồi quy Xác định nhiệt độ và thời gian ủ tối ưu
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3
Bảng 3.2 Ma trận quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm TT mẫu Giá trị mã
hóa Giá trị thực
nghiệm
Xi x2 Nhiệt độ ủ (°C) Thòi gian ủ (phút)
1 -2 -1 30 20
2 -1 0 40 40
3 0 +1 50 60
4 +1 +1 60 60
5 +2 0 70 40
6 +2 -1 70 20
7 +1 0 60 40
8 0 0 50 40
9 -1 -1 40 20
10 -2 +1 30 60
11 -2 0 30 40
12 -1 +1 40 60
13 0 -1 50 20
14 +1 -1 60 20
15 +2 +1 70 60
16 0 0 50 40
17 0 0 50 40
18 0 0 50 40
Ghi chú: (-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên.
Dựa trên hoạt tính trung bình của protease thu được tương ứng YỚi 18 đơn vị thí nghiệm, sử dụng chương trình Statgraphics Centrution 16.1 để giải bài toán qui hoạch thực nghiệm và tính các hệ số phương ừình hồi quy, trong đó hàm mục tiêu Y:
Tổng hoạt tính protease có trong dịch chiết enzyme (U/g CKTĐT); Xi: Nhiệt độ trích ly (°C) và X2 (thời gian trích ly, phút).
Ý nghĩa của các hệ số được kiểm tra theo tiêu chuẩn Student với p = 0,05, số bậc tự do f = 3-1= 2. Kiểm tra sự tương thích phương trình hồi qui với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher, đảm bảo F < Fo,95(9-2, 3-1).
Vẽ đồ thị bề mặt đáp ứng và xác định điều kiện nhiệt độ và thời gian trích ly tối ưu.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính của protease (U/g CKTĐT) trong dịch chiết tương ứng với 18 đvtn.
Kết quả thu nhân'. Điều kiện ly trích (thời gian và nhiệt độ) tối ưu giúp thu nhận protease có hoạt tính cao nhất.