Để tuyển chọn đ−ợc các chủng vi khuẩn axetic khác nhau, chúng tôi tiến hành lên men từ các nguồn nguyên liệu khác nhau: dịch hoa quả loãng, bia, r−ợu vang.
Tr−ớc tiên, cần chuẩn bị dịch lên men giấm và dịch hoa quả loãng. Cho vào bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 500 ml khoảng 200ml giấm, hoặc dịch hoa quả, thêm vào đó một vài lát chuối tiêu đã bóc vỏ để cung cấp thêm nguồn gluxit, vitamin cho vi khuẩn axetic phát triển, bổ sung 2 ml r−ợu etylic và axit axetic. Mục đích của chúng tôi là lựa chọn vi khuẩn axetic nên việc bổ sung axit axetic nhằm axit hoá môi tr−ờng kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn khác chỉ để nồng độ axit trong môi trường thích hợp cho sự phát triển của các chủng axetic. Đậy bằng nút bông, cho vào tủ ấm nuôi ở 28°C - 30°C. Sau 5 - 7 ngày trên bề mặt thoáng của bình cầu sẽ xuất hiện lớp màng màu trắng, màng đó chính là tập hợp tế bào vi khuẩn axetic có trong dịch lên men từ các nguồn nguyên liệu trên (hình 2). Từ các mẫu màng này chúng tôi tiến hành phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter.
Môi trường để phân lập vi khuẩn Acetobacter là môi trường số 1 (thành phần môi trường đã trình bày ở mục 2.3). Môi trường số 1(môi trường thạch
đĩa) đ−ợc khử trùng bằng nồi hấp cao áp Autoclave ở áp suất 0,5 atm, nhiệt độ 110°C, hấp 3 lần trong ngày liên tiếp. Nguyên tắc của ph−ơng pháp khử trùng bằng nồi cao áp : là sự kết hợp giữa tác động của áp lực và nhiệt độ cao để tiêu diệt vi sinh vật (kể cả các nội bào tử chịu nhiệt của vi sinh vật). Trong nồi hấp cao áp, môi tr−ờng bị làm nóng bằng hơi n−ớc bão hoà, áp suất trong nồi đ−ợc tạo bởi áp suất của hơi nước. Khi áp suất của đồng hồ áp kế chỉ khoảng 0,2 atm dùng van xả hết trong nồi cho đến khi kim áp suất chỉ về số 0 (để loại hết
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
không khí còn sót lại trong nồi ). Đóng van lại và đ−a áp suất đến mức cần thiết, giữ đủ theo thời gian yêu cầu, ở lần hấp cuối cùng bổ sung r−ợu etylic và axit axetic. Sau khi thanh trùng cần để vào tủ ấm 24h - 28h để kiểm tra độ vô
trùng của môi tr−ờng.
Hình 3.2. Mẫu dịch lên men giấm
Tiến hành phân lập trên môi trường thạch đĩa: dùng que cấy lấy một lượng màng nhất định cho vào ống nghiệm chứa nước cất, vontex đều, tiến hành pha loãng nồng độ theo phương pháp của Pasteur. Sử dụng nồng độ pha loãng 10-4 – 10-7 để tiến hành phân lập trên môi trường thạch đĩa. Dùng bàn trang thuỷ tinh vô trùng dàn đều giọt dung dịch khắp bề mặt thạch để tách riêng rẽ các tế bào vi sinh vật. Mỗi độ pha loãng trang 3 hộp peri. Sau đó bao gói cẩn thận cho vào tủ ấm 28°C - 30°C nuôi cấy 3 - 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc. Dựa vào quan sát về đặc điểm hình dạng, kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền mép quanh khuẩn lạc, vòng phân giải CaCO3 quanh khuẩn lạc với mức độ tương đồng của từng nhóm như sau:
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
+ Nhóm I: các khuẩn lạc có đ−ờng kính khoảng 3,5 - 5mm, bề mặt trơn bóng, ở giữa lồi lên, dày và đậm màu sắc hơn các vùng xung quanh (gồm 30 mÉu).
+ Nhóm II: các khuẩn lạc có đ−ờng kính từ 2- 3,5 mm, bề mặt trơn bóng, ở giữa lồi lên, có màu vàng nâu (30 mẫu).
+ Nhóm III: các khuẩn lạc có đường kính nhỏ 0,8 - 2 mm tròn, đều đặn, màu trắng sữa quanh khuẩn lạc (35mẫu).
Hình 3.3. Khuẩn lạc vi khuẩn axetic của 3 mẫu phân lập
Sau khi có các khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa, dựa vào đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter (đã nêu), chúng tôi chọn ra những khuẩn lạc riêng rẽ, kích th−ớc lớn, tròn, bề mặt trơn bóng, đ−ờng kính 0,8 – 2 mm.
Dùng que cấy đầu tròn đã đ−ợc khử trùng trên gọn lửa đèn cồn, gợt lấy từng khuẩn lạc riêng rẽ cấy chuyển sang môi tr−ờng thạch nghiêng, mỗi ống là một mẫu vi khuẩn đ−ợc mã hoá bằng các ký hiệu khác nhau.
Khi các tế bào trên môi trường thạch nghiêng đã phát triển, chúng tôi tiến hành thử khả năng tạo màng của các chủng trên môi tr−ờng số 2, chúng tôi chỉ lựa chọn những chủng tạo màng mỏng, độ đàn hồi tốt, nhẵn, không nhăn, không ăn theo thành bình… Qua 3 lần liên tiếp từ 95 mẫu này chúng tôi thu đ−ợc 25 mẫu tạo màng cellulose tốt nhất - đây là các chủng vi khuẩn axit axetic.
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
Theo Bergey vi khuẩn axetic thuộc họ Acetobacteriaceae gồm 2 chi quan trọng là Acetobacter và Gluconobacter, điểm khác nhau cơ bản nhất giữa 2 chi này là khả năng oxy hoá axit axetic thành CO2 và H20 và giải phóng ATP, cung cấp cho hoạt động sống của tế bào, đồng thời giải phóng Ca2+ tạo vòng phân giải không màu xung quanh khuẩn lạc.
Bên cạnh đó quá trình hình thành màng BC chỉ gặp ở những loài thuộc chi Acetobacter. Vì vậy, từ những mẫu vi khuẩn axetic thu đ−ợc ở trên chúng tôi tiến hành tuyển chọn ra những mẫu vi khuẩn Acetobacter thuần khiết và có khả năng tạo màng dai trên môi tr−ờng nuôi cấy dịch thể bằng cách sử dụng 2 môi tr−ờng A và B:
Môi tr−ờng A Môi tr−ờng B - Dịch chiết nấm men 3%
- R−ợu etylic 15% - 1ml - CaCO3 2%
- Agar: 20 g
- Dịch chiết nấm men 3%
- R−ợu etylic 15% - 1ml - Xanh lôc bromocrerol 1ml của dung dịch 2,2 % - Agar: 20 g
Với môi trường A và B dùng để thử khả năng oxi hoá ethanol của chủng vi khuẩn axetic đã phân lập được. Khi cấy các chủng trên vào môi trường A và B, môi tr−ờng A thấy xuất hiện vòng sáng ở xung quanh khuẩn lạc và một lớp căn đục ở viền khuẩn lạc hướng về phía vùng sáng, môi trường B làm biến đổi thành màu vàng, tạo thành viền xanh lơ khi oxy hoá axit.
Dựa vào kết quả thí nghiệm và một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá phân biệt giữa 2 giống Acetobacter và Gluconobacter chúng tôi nhận thấy các chủng đều có khả năng oxy hoá etanol thành axit axetic và oxy hoá lactic điều này chỉ có thể thực hiện đ−ợc đối với chủng thuộc giống Acetobacter , còn
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
Gluconbacter không xảy ra quá trình đó. Chúng tôi lựa chọn nhóm khuẩn lạc có đường kính nhỏ (thuộc nhóm III, gồm 5 chủng ký hiệu từ C1 đến C5) nuôi cấy trên môi trường số 2 sau 5 ngày chuẩn độ để xác định lượng axit tạo thành.
Bảng 3.2. Hàm l−ợng axit axetic của một số chủng Acetobacter Stt Tên chủng L−ợng axit tạo thành(%)
1 C1 2,15
2 C2 2,34
3 C3 2,26
4 C4 2,41
5 C5 2,45
Kết quả thực nghiệm cho thấy các chủng thuộc nhóm III xuất hiện viền sáng nhỏ ở xung quanh khuẩn lạc do có sự phân giải CaCO3 xuất hiện vào ngày thứ 7 và thứ 8 có một viền sáng rất nhỏ chứng tỏ axit axetic là một sản phẩm trao đổi thứ cấp vả các chủng thuộc nhóm III có khả năng axit axetic thÊp.
Hình 3. 4. Khả năng oxy hoá axetat của vi khuẩn Acetobacter Tóm lại: Chúng tôi đã phân lập và thu đ−ợc 25 mẫu vi khuẩn axetic từ các nguồn nguyên liệu là giấm và dịch hoa quả loãng và chia làm 3 nhóm, đã
xác định đ−ợc hàm l−ợng axit axetic của 5 mẫu thuộc nhóm III. Những mẫu vi
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
khuẩn phân lập đ−ợc ở trên đ−ợc giữ trong ống thạch nghiêng, cấy chuyển từ ống thạch nghiêng này sang ống thạch nghiêng kia với chu kỳ 2 tháng một lần
để tránh thoái hoá giống.