Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thường quy định trong phòng thí nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn Quốc tế (ISO).
3.4.1. Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm
- Thu thập mẫu thịt lợn theo phương pháp ngẫu nhiên từ các quầy bán thịt.
- Dụng cụ lấy mẫu, vật chứa mẫu phải sạch, vô trùng và không gây ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật của mẫu thịt.
- Lấy mẫu thịt: Khử trùng dao bằng cồn 700C, sau đó dùng dao cắt lấy 100 - 200 gram thịt/mẫu rồi cho mẫu vào túi nilon vô trùng và ghi nhãn có các thông tin cần thiết. Các mẫu thịt lợn sau khi lấy phải bảo đảm không lẫn nhau.
Sau khi mang về phòng thí nghiệm nếu không phân tích ngay thì phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 00C - 20C và phải kiểm tra trong vòng 24 giờ.
3.4.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thịt lợn tươi
Xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt tươi áp dụng theo TCVN 5667:1992 [29]. Bao gồm các bước sau:
* Nguyên tắc
Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy láng, đếm vi khuẩn trên môi trường Plate Count Agar (PCA) có pH = 7,0 ± 0,2; ủ hiếu khí ở 370C trong thời gian 24h.
Số lượng vi khuẩn hiếu khí có trong 1 gram mẫu theo số khuẩn lạc đếm được từ đĩa thạch nuôi cấy theo các nồng độ khác nhau.
* Cách tiến hành
- Chuẩn bị trước khi nuôi cấy: Trước khi tiến hành phân tích thực hiện đồng nhất các bước như sau: Lấy thịt lợn ngẫu nhiên ở các vị trí khác nhau, cho vào cối sứ vô trùng nghiền nhỏ. Cân chính xác trong điều kiện vô trùng 10g mẫu rồi cho vào bình tam giác đã chứa sẵn 90ml muối sinh lý đã được
Cấy láng mẫu trên Plate Count Agar (PCA)
Đếm khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí Đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3...
hấp khử trùng. Lắc đều trong một thời gian nhất định đảm bảo cho mẫu thịt tan trong dung dịch muối sinh lý. Sau khi đồng nhất mẫu, dung dịch thu được có độ pha loãng 10-1 so với ban đầu.
Dung dịch đồng nhất tiếp tục được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman có đầu hút vô trùng chuyển 1ml dung dịch mẫu ở bình tam giác sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý; ta thu được dung dịch có độ pha loãng 10-2. Sau đó sử dụng pipetman có đầu hút vô trùng khác hút 1ml dung dịch có độ pha loãng 10-2 chuyển sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý; ta thu được dung dịch có độ pha loãng 10-3. Thao tác tương tự như vậy để có dung dịch mẫu có độ pha loãng 10-4... cho đến khi có được dung dịch mẫu có độ pha loãng cần thiết.
- Nuôi cấy: Mẫu kiểm nghiệm nuôi cấy ít nhất 2 đậm độ liên tiếp, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch và phải dùng que cấy riêng. Dùng pipetman với đầu vô trùng 0,1ml dung dịch mẫu pha loãng ở các nồng độ khác nhau rồi nhỏ lên mặt thạch, láng đều sao cho dung dịch phân bố đều trên mặt thạch. Sau đó cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 24h rồi đọc kết quả.
Chọn đĩa có từ 10 - 300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 nồng độ pha loãng liên tiếp. Sự phân bố các khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy phải hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít.
Công thức tính số lượng vi khuẩn (CFU/g):
N =
1 2
( 0,1 )
C V n ∑+ n d
ΣC: tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại.
n1 : số đĩa của độ pha loãng thứ nhất có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc.
n2 : số đĩa của độ pha loãng thứ hai có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc.
d : hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
V : thể tích chất nuôi cấy được sử dụng ở mỗi đĩa
3.4.3. Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tươi
Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tươi áp dụng theo TCVN 5153:1990 [28]. Bao gồm các bước sau:
Bước 1: Chuẩn bị, đồng nhất mẫu và tăng sinh lần 1:
Lấy thịt lợn ngẫu nhiên ở nhiều vị trí khác nhau của mẫu, cho vào cối sứ vô trùng nghiền nhuyễn. Cân chính xác trong điều kiện vô trùng 25g mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth, lắc đều trong thời gian nhất định ta được dung dịch mẫu với độ pha loãng 10-1. Để tủ ấm 370C trong 16 - 24 giờ.
Bước 2: Tăng sinh lần 2 mẫu đã đồng nhất (tăng sinh chọn lọc)
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu đã đồng nhất và tăng sinh theo bước 1 cấy vào 9ml môi trường Selenite Broth, nuôi tủ ấm 430C trong 24 giờ (ở nhiệt độ này Proteus spp và nhiều vi khuẩn tạp nhiễm từ phân bị ức chế không phát triển).
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh Nutrient Broth.
Bồi dưỡng ở 370C/16 - 24h
Cấy 1ml dịch sang 9ml môi trường tăng sinh chọn lọc Selenit Broth.
Bồi dưỡng ở 430C/24h
Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường chọn lọc đặc biệt (XLD…).
Bồi dưỡng 370C/24h
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ Salmonella giám định đặc tính sinh hóa: lên men đường, H2S, Indole, urease, citrate…
Salmonella dương tính/âm tính trong 25g mẫu
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Dùng que cấy thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa thạch XLD - một loại môi trường phân lập đặc trưng cho vi khuẩn Salmonella. Sau đó nuôi dưỡng ở 370C trong 24 giờ rồi đọc kết quả.
Salmonella phát triển mạnh, không lên men lactose, khuẩn lạc dạng S, màu đỏ, giữa có chấm đen, tròn (do sản sinh H2S).
3.4.4. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được
Từ môi trường ta đã phân lập ở trên, chọn khuẩn lạc nghi Salmonella, kiểm tra hình thái, kích thước 0,4 - 0,6 × 1 - 3μm, không có giáp mô, không sản sinh nha bào, di động được do có lông, từ 7 - 12 lông (trừ Salmonella pollorum và Salmonella gallinarum), bắt màu Gram âm.
Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên men đường glucose (+), lactose (-), manitol (+), H2S (+), Indole (-), urease (-), catalase (+).
- Kiểm tra khả năng sinh Indole của vi khuẩn: Lấy khuẩn lạc từ đĩa thạch đã cấy thuần vào môi trường Nutrient Broth, bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370C trong 18 - 24h, vi khuẩn sẽ sinh trưởng, phát triển và sản sinh Indole (nếu có). Tiến hành kiểm tra bằng cách nhỏ giọt 2 - 3 giọt dung dịch Kovac’s vào ống nghiệm.
Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: Trên bề mặt môi trường xuất hiện một vòng nhẫn màu đỏ tím hay màu hồng (đó là phản ứng kết hợp giữa Kovac’s màu cafe và Indole không màu).
+ Phản ứng âm tính: Không có sự thay đổi màu.
- Phản ứng catalase: Lấy một phiến kính sạch, dùng que cấy cẩn thận lấy một phần của khuẩn lạc đặt lên giữa phiến kính. Nhỏ một giọt hydrogen peroxidaza (H2O2) lên vùng có khuẩn lạc.
Đọc kết quả: Phản ứng dương tính nếu ngay sau khi nhỏ chất phản ứng, bọt khí được hình thành. Ngược lại không có bọt khí hình thành, kết quả âm tính.
- Sản sinh urease: Dùng que cấy vòng lấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường Urea Broth vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn để ở 370C trong 24 giờ.
Đọc kết quả: Phản ứng là dương tính khi môi trường chuyển từ màu vàng cam sang màu đỏ cánh sen. Khi môi trường giữ nguyên màu vàng cam là âm tính.
- Phản ứng oxidase: Lấy vi khuẩn từ môi trường Nutrient Agar đặt lên giấy thấm. Nhỏ thuốc thử TMPD (Tetramethyl - ρ - phenylenediamine). Quan sát sau 30 giây.
Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: Sinh khối chuyển màu xanh.
+ Phản ứng âm tính: Sinh khối vẫn màu trắng.
- Khả năng dung huyết: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy, cấy ria lên đĩa thạch máu. Sau đó để ở 370C trong 24 giờ, quan sát sự thay đổi trên đĩa thạch.
Đọc kết quả: Có 3 kiểu dung huyết:
+ Dung huyết hoàn toàn: Vòng tan huyết trong rõ
+ Dung huyết không hoàn toàn: Xung quanh và dưới khuẩn lạc chuyển đục và có màu khác.
+ Không dung huyết: Hoàn toàn không dung huyết.
- Lên men đường: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc, sau đó cấy ria trên bề mặt thạch nghiêng TSI, để trong tủ ấm.
Đọc kết quả:
+ Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, sau 18 - 24 giờ nuôi cấy phần môi trường bề mặt của ống thạch nghiêng trở lên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH axit. Nếu trong môi trường có chất chỉ thị là đỏ phenol thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu sẽ có màu vàng.
+ Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, sau 18 - 24 giờ nuôi cấy, toàn bộ môi trường trở lên có pH axit (do quá trình oxy hóa và quá trình lên men) và có màu vàng. Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian nuôi cấy quá 24 giờ, bề mặt môi trường có thể trở thành màu đỏ do hết nguồn cacbon nên vi sinh vật phải sử dụng đến pepton.
+ Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả 2 nguồn cacbon này, thì pepton được sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, do peton chỉ được biễn dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa môi trường chỉ diễn ra trên bề mặt môi trường và chỉ phần này trở lên có màu đỏ, phần môi trường sâu trong ống nghiệm sẽ không có sự đổi màu.
- Khả năng sinh H2S: Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần vào phần sâu của ống thạch nghiêng (tránh chạm đáy ống), sau đó ria trên bề mặt thạch nghiêng để ở tủ ấm 370C trong 24 giờ. Ghi nhận màu và sự sinh khí ở phần sâu, màu ở mặt thạch nghiêng, sự tạo thành màu đen bởi FeS.
Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: Khi phần thạch đứng có màu đen.
+ Phản ứng âm tính: Khi phần thạch đứng không có màu đen.
- Tính di động của vi khuẩn: Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5%).
Đọc kết quả:
+ Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy.
+ Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục.
3.4.5. Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn
Sau khi nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu, chúng tôi tiến hành nhuộm Gram nhằm xác định đặc điểm hình thái và khả năng bắt màu của vi khuẩn.
Dùng bút sáp để ghi tên mẫu hoặc số nhận diện, ngày thử nghiệm lên phiến kính chuẩn bị phết vi khuẩn.
Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nước cất vô trùng đặt vào giữa phiến kính. Lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ khuẩn lạc và dàn mỏng với nước cất trên phiến kính. Để dịch khuẩn khô tự nhiên, sau đó hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 đến 3 lần (tránh không để tiêu bản quá nóng).
+ Nhỏ một giọt dung dịch Gentian lên lam kính để lưu lại trong thời gian 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất.
+ Cố định màu vi khuẩn bằng cách phủ dung dịch Lugol lên lam kính trong thời gian 1 phút rồi rửa lại bằng nước cất.
+ Tẩy màu nhanh bằng cồn Axeton trong vòng 15 - 20 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất.
+ Nhỏ 1 giọt dung dịch Fushin lên lam kính sau thời gian 2 phút. Sau rửa lại bằng nước cất.
Dùng giấy thấm để thấm khô hoặc để khô tự nhiên. Nhỏ một giọt dầu bạch dương lên phiến kính quan sát hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu (100x).
3.4.6. Phương pháp xác định serovar của vi khuẩn Salmonella spp phân lập được
- Sử dụng kháng huyết thanh đơn giá.
- Nguyên lý: Đối với kháng nguyên hữu hình, khi gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng thì các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau thành đám lớn mà mắt thường ta có thể quan sát được. Đây là phản ứng ngưng kết, sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể nhanh và xảy ra trên phiến kính.
- Chuẩn bị: Khuẩn lạc vi khuẩn được nuôi cấy vào ống thạch dinh dưỡng, để trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
+ Kháng huyết thanh đơn giá.
+ Que cấy vô trùng loại 1μl.
+ Phiến kính lõm 24 giếng, bông cồn, nước sinh lý, đèn cồn.
- Tiến hành:
+ Trên phiến kính lõm 24 giếng, nhỏ vào một giọt kháng huyết thanh, sau đó dùng que cấy vô trùng loại 1μl lấy 1 vòng vi khuẩn trên môi trường thạch dinh dưỡng, hòa tan trong kháng huyết thanh.
- Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính khi có sự hình thành các hạt ngưng kết li ti phân bố đều sau 30 giây khi cho kháng huyết thanh.
+ Phản ứng âm tính khi huyết dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh không có hiện tượng ngưng kết, huyễn dịch vẩn đục đều.
+ Trong trường hợp nếu vi khuẩn có khả năng tự ngưng kết (tức là khi cho vi khuẩn hòa với nước muối sinh lý có hình thành ngưng kết nhiều hoặc ít) thì chủng này được coi là tự ngưng kết và không thử nghiệm tiếp theo để phát hiện kháng nguyên nữa.
Khi xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella phải nuôi cấy vi khuẩn vào các môi trường để tạo các pha riêng biệt của kháng nguyên H.
Cách bộc lộ các pha của kháng nguyên H:
- Cấy vi khuẩn cần định type vào môi trường thạch dinh dưỡng (được đổ nghiêng trong ống nghiệm) để tạo pha 1.
- Cấy vi khuẩn vào môi trường thạch Gard (thạch có bổ sung kháng huyết thanh nhằm ức chế pha 1) để tạo ra pha 2 của kháng nguyên H.
Tiến hành định type theo bảng định type huyết thanh học của vi khuẩn Salmonella theo sơ đồ của Kauffman - White (1972) [39].
3.4.7. Phương pháp thử độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được trên chuột bạch khỏe
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn đã được nuôi cấy và phân lập trên môi trường XLD, cho vào các ống nghiệm chứa môi trường BHI đã pha chế, đem nuôi trong tủ ấm 370C trong 24 giờ.
Sau đó tiến hành tiêm xoang bụng chuột bạch với liều 0,5ml canh trùng/con. Theo dõi 7 ngày sau khi tiêm. Khi chuột chết tiến hành mổ khám bệnh tích và phân lập lại vi khuẩn trên môi trường XLD.
Đối với chuột bạch đối chứng: Tiêm phúc mạc với liều lượng 0,5ml/con dung dịch BHI nguyên chất. Theo dõi 7 ngày nếu chuột chết tiến hành mổ khám bệnh tích rồi phân lập lại trên môi trường XLD.
3.4.8. Phương pháp xác định tính mẫn cảm với kháng sinh - Nguyên lý chung
Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có độ mẫn cảm khác nhau đối với kháng sinh trị liệu, biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính (ф) vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh trên môi trường nuôi cấy.
- Mục đích
Tìm hiểu tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh sẽ giúp ích rất nhiều cho phương hướng điều trị, lựa chọn kháng sinh đặc hiệu, góp phần đánh giá thực trạng tính kháng thuốc của vi khuẩn.
- Tiến hành
Dùng pipet hoặc xi lanh hút 0,1ml canh khuẩn 24h ở môi trường BHI (nồng độ 10-1) vào ống nghiệm trộn đều với 0,9ml nước muối sinh lý 0,9%, ta
được nồng độ 10-2, sau đó ta lại hút 0,1ml sang ống nghiệm thứ 2 ta được nồng độ 10-3 tiếp tục hút 0,1ml sang ống nghiệm thứ 3 ta được nồng độ 10-4. Ống thứ 3 được sử dụng làm kháng sinh đồ.
Hút 0,5ml đã pha loãng nồng độ 10-4, nhỏ toàn bộ dung dịch này lên mặt thạch sau đó dùng que cấy vòng láng đều dung dịch trên môi trường thạch đĩa cho đến khô.
Đặt nhẹ các khoanh giấy kháng sinh chế sẵn lên mặt thạch đĩa. Các khoanh giấy kháng sinh đặt cách nhau 2cm, không quá 6 khoanh giấy kháng sinh trong một đĩa thạch. Sau đó bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ. Để đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh dựa trên đường kính vòng vô khuẩn.
+ Rất mẫn cảm: ф > 20mm
+ Mẫn cảm trung bình: ф từ 15 - 20mm + Mẫn cẩm yếu: ф từ 10 - 14mm
+ Kháng thuốc: ф < 10mm 3.4.9. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu được chúng tôi xử lý theo phương pháp nghiên cứu trong chăn nuôi của Nguyễn Văn Thiện (2008) [22], ứng dụng chương trình phần mềm Microsoft Excel…
PHẦN 4