4.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI NẤM Colletotrichum HẠI ỚT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG VÀ MỘT SỐ TỈNH
4.2.1. Định danh nấm dựa trên giải trình tự gen các mẫu nấm đại diện thuộc các nhóm hình thái xác định được
Do phân loại nấm Colletotrichum chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái đã tạo
ra quá nhiều sai lầm nên vai trò của phân tích phân tử đã ngày càng trở nên quan trọng và được xem là chuẩn vàng trong phân loại nhóm nấm này (Cannon et al., 2000; Hyde et al., 2009a).
4.2.1.1. Định danh các loài Colletotrichum bằng giải trình tự vùng ITS
Vùng liên gen ITS (internally transcribed spacers) của cụm gien rDNA là môt trong các vùng gen phổ biến nhất để nghiên cứu đa dạng và phân loại nấm (Schoch et al., 2012). Vùng gen này cũng đã từng được sử dụng để định danh nấm Colletotrichum (Martinez-Culebras et al., 2000).
Dựa trên đặc điểm hình thái, 10 mẫu nấm đại diện cho 3 nhóm hình thái đã được lựa chọn để giải trình tự vùng ITS. Các mẫu giải trình tự gồm C1, C4, C6, C9, C14, C26, C33 (nhóm hình thái I), C29 (nhóm hình thái II) và C25, C30 (nhóm hình thái III).
Sản phẩm PCR của 10 mẫu được giải trình tự trực tiếp một chiều và tất cả các mẫu giải trình tự đều có chất lượng tốt. Sau khi loại bỏ các vùng nhiễu 2 đầu, trình tự đọc được vùng ITS của 10 mẫu có kích thước từ 529 đến 563 bp (bảng 4.8, phụ lục 3) và đều chứa 2 vùng ITS1 và ITS2 có giá trị phân loại.
Kết quả tìm kiếm trên Ngân hàng gen bằng phần mềm BLAST cho thấy loài trùng khớp với 2 mẫu C25 và C30 là C. truncatum. Tám mẫu còn lại đều trùng khớp với các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (bảng 4.8).
Bảng 4.8. Kết quả tìm kiếm trên Ngân hàng gen 10 mẫu nấm Colletotrichum dựa trên trình tự vùng ITS
TT Mẫu nấm
Nhóm
hình thái Địa điểm Kích thước
(bp)1 Loài xác định2
1 C1 I Hà Nội 548 C. gloeosporioides s.l
2 C4 I Thái Bình 529 C. gloeosporioides s.l
3 C6 I Hưng Yên 548 C. gloeosporioides s.l
4 C9 I Bắc Ninh 547 C. gloeosporioides s.l
5 C14 I Hải Phòng 549 C. gloeosporioides s.l
6 C25 III Hà Nội 556 C. truncatum
7 C26 I Hưng Yên 560 C. gloeosporioides s.l 8 C29 II Thái Nguyên 563 C. gloeosporioides s.l
9 C30 III Hà Nội 556 C. truncatum
10 C33 I Sơn La 551 C. gloeosporioides s.l
Chú thích: 1 Kích thước sau khi loại bỏ các trình tự nhiễu ở 2 đầu sản phẩm giải trình tự;
2 Dựa trên kết quả tìm kiếm BLAST
Bảng 4.9. Mức đồng nhất trình tự vùng ITS của 10 mẫu Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại thu tại Việt Nam với các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l và các loài đã công bố gây bệnh thán thư ớt
Phức hợp loài TT Loài Mã
GenBank
Mức đồng nhất trình tự (%)
C25 C29 C26 C14 C33 C1 C9 C4 C6 C30
C. gloeosporioides s.l
1 C. aenigma JX010244 90,2 90,5 99,4 99,8 99,8 99,8 100 99,2 99,2 99,6 2 C. aeschynomenes JX010176 90,0 90,3 99,6 100 100 100 99,8 98,8 98,8 99,2 3 C. alatae JX010190 89,8 90,0 98,6 99,0 99,0 99,0 98,8 98,3 98,3 98,6 4 C. alienum JX010251 90,2 90,5 99,4 99,8 99,8 99,8 100 99,2 99,2 99,6 5 C. aotearoa JX010205 90,4 90,6 99,8 99,4 99,4 99,4 99,6 99,2 99,2 99,6 6 C. asianum FJ972612 89,8 89,8 99,0 99,0 99,0 99,0 98,8 98,6 98,6 99,0 7 C. camelliae KJ955081 88,5 88,5 96,9 97,1 97,1 97,1 97,4 97,4 97,4 97,4 8 C. clidemiae JX010265 90,4 90,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,8 99,4 99,4 99,8 9 C. cordylinicola JX010226 90,2 90,5 98,6 98,6 98,6 98,6 98,8 98,8 98,8 99,0 10 C. fructicola JX010165 90,0 90,3 99,6 100 100 100 99,8 98,8 98,8 99,2 11 C. gloeosporioides s.s JX010152 90,2 90,5 99,8 99,4 99,4 99,4 99,2 98,6 98,6 99,0 12 C. henanense KJ955109 88,3 88,3 97,1 97,4 97,4 97,4 97,6 97,4 97,4 97,6 13 C. horii GQ329690 90,2 90,5 99,6 99,2 99,2 99,2 99,4 99,0 99,0 99,4 14 C. jiangxiense KJ955201 87,8 87,8 97,1 97,4 97,4 97,4 97,6 97,4 97,4 97,6 15 C.kahawae JX010231 90,4 90,6 98,8 98,8 98,8 98,8 99,0 99,0 99,0 99,2 16 C. musae JX010146 90,6 90,8 98,8 98,6 98,6 98,6 98,8 98,6 98,6 99,0 17 C. nupharicola JX010187 89,7 89,9 99,0 99,4 99,4 99,4 99,2 98,6 98,6 99,0
61
Phức hợp loài TT Loài Mã GenBank
Mức đồng nhất trình tự (%)
C25 C29 C26 C14 C33 C1 C9 C4 C6 C30
18 C. psidii JX010219 90,6 90,8 98,8 98,8 98,8 98,8 99,0 99,0 99,0 99,2 19 C. queenslandicum JX010276 90,3 90,5 99,4 99,4 99,4 99,4 99,6 99,4 99,4 99,8 20 C. rhexiae JX145128 90,4 90,4 98,8 98,8 98,8 98,8 99,0 99,0 99,0 99,2 21 C. siamense JX010171 90,4 90,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,4 98,8 98,8 99,2 22 C. temperatum JX145159 90,6 90,6 99,0 99,0 99,0 99,0 99,2 99,2 99,2 99,4 23 C. theobromicola JX010294 90,3 90,5 98,8 98,8 98,8 98,8 99,0 98,8 98,8 99,2 24 C. ti JX010269 90,4 90,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,8 99,4 99,4 99,8 25 C. tropicale JX010264 90,4 90,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,8 99,4 99,4 99,8 26 C. xanthorrhoeae JX010261 89,5 89,7 98,3 98,3 98,3 98,3 98,5 98,3 98,3 98,6 C. acutatum s.l 27 C.acutatum s.s AF411700 76,1 76,1 76,5 76,5 76,5 76,5 76,5 76,6 76,6 76,8 28 C.coccodes HM171679 88,3 88,3 88,6 88,8 88,8 88,8 89,0 88,4 88,4 88,8 C. dematium s.l 29 C.dematium s.s GU227819 88,4 88,4 87,2 87,0 87,0 87,0 87,0 86,9 86,9 87,2 C. acutatum s.l 30 C.simmondsii JQ948276 76,9 76,9 77,9 77,7 77,7 77,7 77,9 77,7 77,7 77,9 C. truncatum 31 C. truncatum GU227862 99,8 100 89,6 89,4 89,4 89,4 89,4 89,0 89,0 89,4
62
Vì rất nhiều trình tự gửi trên GenBank chưa được thẩm định nên dựa trên kết quả tìm kiếm BLAST, trình tự vùng ITS của 10 mẫu nấm Colletotrichum được phân tích đầy đủ hơn với trình tự của các mẫu GenBank đại diện cho loài đã được công bố. Tổng số 26 trình tựITS đại diện cho 26 mẫu chuẩn loài (Type specimen) của phức hợp loài C. gloeosporioides theo công bố của Liu et al.
(2015) đã được sử dụng trong phân tích trình tự. Ngoài ra, các trình tự tương tự đại diện cho 5 loài C. acutatum, C. coccodes, C. dematum, C. simmondsii và C. truncatum cũng được sử dụng trong phân tích dựa trên công bố của Canon et al. (2012). Kết quả so sánh trình tự tại bảng 4.9 cho thấy:
Hai mẫu C25 và C30 (nhóm hình thái III) có mức đồng nhất trình tự rất cao từ 99,8% đến 100% với loài C. truncatum giống như kết quả tìm kiếm BLAST.
Hai mẫu có mức đồng nhất trình tự thấp hơn nhiều, từ 87,8% đến 90,8% đối với các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l và từ 76,1% đến 88,4% đối với 4 loài còn lại là C. coccodes, C. dematium s.s và C. simmondsii (bảng 4.9).
Tám mẫu còn lại gồm gồm C1, C4, C6, C9, C14, C26, C33 (nhóm hình thái I) và C29 (nhóm hình thái II) có mức đồng nhất trình tự rất cao, từ 96,9% đến 100% đối với các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l nhưng thấp hơn nhiều, từ 76,5% đến 89,6% với 5 loài còn lại là C. coccodes, C. dematium s.s, C. simmondsii và C. truncatum s.s (bảng 4.9).
Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS (hình 4.4) cũng cho thấy 2 mẫu C25 và C30 thuộc cụm loài C. truncatum điển hình. Tương tự như kết quả tìm kiếm BLAST và so sánh trình tự, phân tích phả hệ dựa trên vùng ITS cũng cho thấy tám mẫu còn lại gồm C1, C4, C6, C9, C14, C26, C33 (nhóm hình thái I) và C29 (nhóm hình thái II) phân nhóm rõ rệt trong cụm phức hợp loài C. gloeosporioides s.l.
Dựa trên các kết quả phân tích vùng ITS của 10 mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu tại miền Bắc, có thể kết luận 2 mẫu C25 và C30 là loài C. truncatum, 8 mẫu còn lại C1, C4, C6, C9, C14, C26, C33 và C29 thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l. Như vậy, vùng gen ITS chỉ xác định được chính xác loài C. truncatum mà không định danh chính xác được các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Cannon et al. (2012) về sử dụng vùng gen ITS để xác định các loài nấm Colletotrichum.
Chú thích: Cây được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining (NJ). Giá trị ở các nốt là giá trị thống kê boostrap dưới dạng % (1.000 lần lặp) (chỉ trình bày các giá trị > ngưỡng tin cậy chung 75%).
Ký tự (T) là mẫu đại diện loài (Type strain). Thanh tỷ lệ chỉ khoảng cách di truyền.
Hình 4.4. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS của các mẫu nấm Colletotrichum thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l
và các loài được công bố gây bệnh thán thư ớt
4.2.1.2. Định danh phân tử các loài Colletotrichum bằng vùng liên gen ApMat Do vùng ITS không đủ phân biệt các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l nên để định danh chính xác các loài thuộc phức hợp này, phân tích đa gen (multigenes) thường được sử dụng (Weir et al., 2012). Tuy nhiên, gần đây, một vùng liên gen khoảng 900 bp (ApMat) nằm giữa 2 gen Apn2 (mã hóa Apurinic-apyrimidinic endonuclease 2, một endonuclease sửa chữa DNA, cắt ở vị trí Apurinic-apyrimidinic) và gen MAT1-2-1 (mã hóa yếu tố qui định kiểu ghép cặp) đã được chứng tỏ rất hiệu quả nhằm phân biệt các loài trong phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (Liu et al., 2015; Silva et al., 2012).
Với giải trình tự vùng liên gen ApMat, 8 mẫu nấm đã được giải trình tự vùng ITS (C1, C4, C6, C9, C14, C26, C29, C33) và 1 mẫu số 44 (có bào tử phân sinh hình trụ, nhóm hình thái I, bảng 4.7) được lựa chọn để giải trình tự. Vùng gen ApMat của chúng đã được giải trình tự cả 2 chiều bằng mồi PCR. Tất cả 9 mẫu giải trình tự đều có chất lượng tốt và có kích thước từ 894 đến 930 bp (bảng 4.10).
Bảng 4.10. Kết quả tìm kiếm trên GenBank 9 mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt dựa trêntrình tự vùng ApMat
TT Mẫu Nhóm
hình thái Địa điểm Kích thước
(bp)1 Loài xác định2
1 C1 I Hà Nội 915 C. fructicola
2 C4 I Thái Bình 919 C. siamense
3 C6 I Hưng Yên 910 C. fructicola
4 C9 I Bắc Ninh 894 C. gloeosporioides s.s
5 C14 I Hải Phòng 915 C. fructicola
6 C26 I Hưng Yên 879 C. gloeosporioides s.s 7 C29 II Thái Nguyên 930 C. aeschynomenes
8 C33 I Sơn La 919 C. siamense
9 C44 I Hà Nội 894 C. gloeosporioides s.s
Chú thích: 1 Kích thước sau khi loại bỏ các trình tự nhiễu ở 2 đầu sản phẩm giải trình tự;
2 Dựa trên kết quả tìm kiếm BLAST
Kết quả tìm kiếm BLAST (bảng 4.10) cho thấy các trình tự GenBank trùng khớp với 3 mẫu C1, C6, C9 là loài C. fructicola, trùng khớp với 2 mẫu C4, C33 là loài C. siamense, trùng khớp với 3 mẫu C9, C26, C44 là loài C. gloeosporioides s.s, và trùng khớp với mẫu C29 là loài C. aeschynomenes.
Để xác định chính xác hơn, trình tự vùng ApMat của 9 mẫu nấm Colletotrichum được phân tích với trình tự tương ứng của các mẫu GenBank đại diện cho loài đã được thẩm định. Tổng số 26 trình tự ApMat đại diện cho 26 mẫu chuẩn loài (Type specimen) của phức hợp loài C. gloeosporioides theo công bố của Liu et al. (2015) đã được sử dụng trong phân tích trình tự. Ngoài ra, các trình tự GenBank bổ sung cho các loài đã được xác định dựa trên kết quả tìm kiếm BLAST gồm C. fructicola, C. siamense, C. gloeosporioides s.s cũng được phân tích cùng nhằm đánh giá mức độ biến động trong loài.
Kết quả so sánh trình tự vùng ApMat (bảng 4.11) cho thấy:
Ba mẫu C9, C44, C26 có mức đồng nhất trình tự rất cao, từ 98,6% đến 98,8% đối với các mẫu của loài C. gloeosporioides s.s và có mức đồng nhất trình tự thấp hơn nhiều, từ 80,3% đến 90,3% đối với các loài trong phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (bảng 4.11).
Hai mẫu C4, C33 có mức đồng nhất trình tự rất cao, từ 98,2% đến 99,7%
đối với các mẫu của loài C. siamense và có mức đồng nhất trình tự thấp hơn nhiều, từ 80,3% đến 94,3% đối với các loài trong phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (bảng 4.11).
Ba mẫu C1, C6 và C14 có mức đồng nhất trình tự rất cao, từ 99,7% đến 100% đối với các mẫu của loài C. fructicola. Ba mẫu này cũng có mức đồng nhất trình tự khá cao đối với 2 loài C. aenigma (98,2 - 98,4%) và C. alienum (99,3 - 99,5%) nhưng thấp hơn nhiều, từ 78,9% đến 96,9% đối với các loài còn lại trong phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (bảng 4.11).
Mẫu C29 có mức đồng nhất trình tự rất cao, 99,3% đối với loài C. aeschynomenes và có mức đồng nhất trình tự thấp hơn nhiều, từ 79,6% đến 94,4% đối với các loài trong phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (bảng 4.11).
Phân tích phả hệ dựa trên trình tựvùng ApMat (hình 4.5) cũng cho thấy ba mẫu C9, C44, C26 thuộc cụm loài C. gloeosporioides s.s điển hình, hai mẫu C4, C33 thuộc cụm loài C. siamense điển hình, ba mẫu C1, C6, C14 thuộc cụm loài C. fructicola điển hình nhưng gần gũi với 2 loài C. aenigma và C. alienum. Riêng mẫu C29, cùng với mẫu loài duy nhất C. aeschynomenes trên GenBank hình thành một cụm loài đặc trưng phân biệt rõ rệt với các loài khác.
Bảng 4.11. Mức đồng nhất trình tự vùng ApMat của 9 mẫu Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh với các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l
TT Loài Mã GenBank Mức đồng nhất trình tự (%)
C9 C44 C26 C4 C33 C29 C6 C14 C1
1 C. gloeosporioides s.s KJ954584 98,8 98,8 98,7 90,8 90,8 90,6 90,1 90,2 90,2 2 C. gloeosporioides s.s KJ954541 98,6 98,6 98,6 90,9 90,9 90,7 90,1 90,2 90,2 3 C. gloeosporioides s.s KJ954569 98,6 98,6 98,6 90,9 90,9 90,7 90,1 90,2 90,2 4 C. gloeosporioides s.s JQ807843 (T) 98,6 98,6 98,6 90,7 90,7 90,4 90,2 90,2 90,2
5 C. siamense KJ954494 90,3 90,3 90,2 98,4 98,4 94,4 91,5 91,7 91,7
6 C. siamense KJ954495 90,3 90,3 90,2 98,4 98,4 94,4 91,5 91,7 91,7
7 C. siamense JQ899283 90,2 90,2 90,2 98,2 98,2 93,8 91,6 91,7 91,7
8 C. siamense KJ954509 90,1 90,1 89,9 98,4 98,4 94,0 91,4 91,6 91,6
9 C. siamense KJ954508 90,1 90,1 89,9 99,7 99,7 93,7 91,2 91,4 91,4
10 C. siamense JQ894551 89,8 89,8 89,8 98,7 98,7 93,6 91,4 91,5 91,5
11 C. siamense JQ894562 89,7 89,7 89,7 98,6 98,6 93,5 91,3 91,4 91,4
12 C. siamense JQ899289 (T) 89,7 89,7 89,7 98,7 98,7 93,5 91,3 91,4 91,4
13 C. aeschynomenes KM360145 (T) 89,6 89,6 89,4 93,4 93,4 99,3 93,4 93,5 93,5
14 C. fructicola KJ954628 89,5 89,5 89,3 91,4 91,4 93,5 100,0 99,9 99,9
15 C. fructicola KJ954500 89,5 89,5 89,3 91,5 91,5 93,6 99,9 100,0 100,0
16 C. fructicola KJ954499 89,5 89,5 89,3 91,5 91,5 93,6 99,9 100,0 100,0
17 C. fructicola KJ954557 89,4 89,4 89,2 91,4 91,4 93,6 99,9 100,0 100,0
18 C. fructicola KJ954559 89,4 89,4 89,2 91,4 91,4 93,5 99,8 99,9 99,9
19 C. fructicola KJ954624 89,4 89,4 89,2 91,4 91,4 93,5 99,8 99,9 99,9
20 C. fructicola JQ894576 89,3 89,3 89,3 91,3 91,3 93,5 99,9 99,8 99,8
21 C. fructicola JQ807838 (T) 89,1 89,1 89,0 91,1 91,1 93,4 99,7 99,8 99,8
67
TT Loài Mã GenBank Mức đồng nhất trình tự (%)
C9 C44 C26 C4 C33 C29 C6 C14 C1
22 C. aenigma KM360143 (T) 90,1 90,1 89,9 91,7 91,7 94,0 98,2 98,4 98,4
23 C. xanthorrhoeae KC790689 (T) 90,1 90,1 90,1 90,1 90,1 89,6 89,1 89,2 89,2
24 C. ti-ApMat KM360146 (T) 89,5 89,5 89,3 88,7 88,7 88,2 87,4 87,6 87,6
25 C. alienum KM360144 (T) 89,4 89,4 89,2 91,3 91,3 93,5 99,3 99,5 99,5
26 C. tropicale KC790728 (T) 89,0 89,0 89,0 92,5 92,5 92,8 91,5 91,6 91,6
27 C. queenslandicum KC88892 (T) 88,8 88,8 88,8 94,3 94,3 93,3 90,2 90,4 90,4
28 C. musae KC888926 (T) 88,7 88,7 88,5 90,9 90,9 93,2 96,8 96,9 96,9
29 C. jiangxiense KJ954607 (T) 88,6 88,6 88,4 87,8 87,8 87,6 86,7 86,9 86,9
30 C. camelliae KJ954497 (T) 88,1 88,1 87,9 87,4 87,4 87,4 86,3 86,4 86,4
31 C. kahawae JQ894579 (T) 88,1 88,1 88,1 87,3 87,3 87,0 86,5 86,6 86,6
32 C. aotearoa KC888930 (T) 88,1 88,1 87,9 87,9 87,9 87,4 86,6 86,8 86,8
33 C. clidemiae KC888929 (T) 87,9 87,9 87,8 87,1 87,1 86,8 86,3 86,4 86,4
34 C. cordylinicola JQ899274 (T) 87,5 87,5 87,5 87,0 87,0 86,5 85,9 86,1 86,1
35 C. horii JQ807840 (T) 87,2 87,2 87,2 86,0 86,0 86,6 86,4 86,5 86,5
36 C. asianum FR718814 (T) 87,2 87,2 87,2 93,1 93,1 92,7 89,9 90,0 90,0
37 C. alatae C888932 (T) 87,1 87,1 87,1 87,8 87,8 87,6 87,5 87,7 87,7
38 C. psidii KC888931 (T) 86,9 86,9 86,9 86,4 86,4 86,0 85,8 85,9 85,9
39 C. henanense KJ954524 (T) 86,9 86,9 86,6 86,5 86,5 87,2 85,5 85,7 85,7
40 C. temperatum JX145298 (T) 86,4 86,4 86,4 85,5 85,5 85,2 84,8 84,9 84,9
41 C. rhexiae JX145290 (T) 86,1 86,1 86,1 85,3 85,3 84,9 84,5 84,7 84,7
C. theobromicola KC790726 (T) 80,3 80,3 80,3 80,3 80,3 79,6 78,9 79,1 79,1
Chú thích: (T): Type species: là mẫu chuẩn của loài (Liu et al., 2015)
68
Chú thích: Cây được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining (NJ). Giá trị ở các nốt là giá trị thống kê boostrap dưới dạng % (1000 lần lặp) (chỉ trình bày các giá trị > ngưỡng tin cậy chung 75%).
Ký tự (T) là mẫu đại diện loài (Type strain). Thanh tỷ lệ chỉ khoảng cách di truyền.
Hình 4.5. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ApMat của các mẫu nấm Colletotrichum thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l
Từ kết quả phân tích vùng ApMat của 9 mẫu nấm Colletotrichum thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l có thể kết luận:
Hai mẫu C4 và C33 là loài C. siamense. Đây là loài được phát hiện thấy đầu tiên trên cà phê tại Thái Lan năm 2009 (Prihastuti et al., 2009) và cũng có phổ ký chủ rất rộng (Weir et al., 2012). Hiện trạng phân loại của loài này khá phức tạp.
C. siamense s.s và nhiều loài gần gũi như C. communis, C. dianesei, C. endomangiferae, C. hymenocallidis, C. jasmini-sambac, C. melanocaulon và C. murrayae đã được phân loại là các thành viên của phức hợp loài C. siamense s.l. Tuy nhiên, một nghiên cứu phân loại mới đây nhất, dựa trên phân tích đa gen, giao phối chéo, hình thái học đã kết luận tất cảcác loài trên đều là thành viên của một loài duy nhất là C. siamense (Liu et al., 2016). Đây là lần đầu tiên, loài này được phát hiện thấy tại Việt Nam.
Ba mẫu C1, C6 và C14 là loài C. fructicola. Đây cũng là loài được phát hiện đầu tiên trên cà phê tại Thái Lan năm 2009 (Prihastuti et al., 2009) và cũng có phổ ký chủ và phân bố địa lý rất rộng (Weir et al., 2012). Đây là lần đầu tiên, loài này được phát hiện thấy tại Việt Nam.
Ba mẫu C9, C26 và C44 là loài C. gloeosporioides s.s. Đây là loài có phổ ký chủ khá hẹp, nhiễm chủ yếu trên cây có múi. Ngoài ra, loài này cũng được phát hiện thấy trên một số cây như xoài, nho, Ficus, Pueraria, chè (Liu et al., 2015; Udayanga et al., 2013; Weir et al., 2012). Đây là lần đầu tiên loài này được phát hiện thấy tại Việt Nam.
Mẫu C29 là loài C. aeschynomenes. Đây là loài được định danh lại từ C. gloeosporioides “f. sp. aeschynomenes”. Loài này có phổ ký chủ và phân bố rất hẹp, mới chỉ được công bố gây bệnh trên cây đậu dại (Aeschynomene virginica) tại Mỹ (Weir et al., 2012) và cây ca cao tại Brazil (Nascimento et al., 2019). Đây là lần đầu tiên, loài này được phát hiện thấy tại Việt Nam.