CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.5.1. Khảo sát phương pháp thu enzyme thô
Trong thí nghiệm này, để thu được enzyme thô sẽ tiến hành khảo sát khả năng
kết tủa của muối trung tính ((NH4)2SO4, NaCl) và dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol và acetone) để chọn ra tác nhân kết tủa protein lactase hiệu quả nhất..
Muối trung tính: ((NH4)2SO4, NaCl)
Chọn loại tác nhân thích hợp sao cho hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của chế phẩm lactase là cao nhất.
Thông số cố định: thể tích dung dịch enzyme, thời gian, nhiệt độ.
Thông số thay đổi: Nồng độ muối thay đổi như sau:
Nồng độ (NH4)2SO4: 76,1%, 65,7%, 56,1%, 47,2%, 39%, 31,4% và 25,1%
w/v (độ bão hòa tương ứng là 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%).
Nồng độ NaCl: 35%, 30%, 25%, 20%, 15% (w/v).
Hàm mục tiêu: Hiệu suất thu hồi và hoạt tính enzyme.
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần.
Thực hiện:
Chuẩn bị dung dịch bào chứa enzyme và muối.
Hút 10 ml dung dịch enzyme (4oC) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung muối ở dạng tinh thể với hàm lượng như đã dự kiến. Khuấy nhẹ để muối hòa tan hoàn toàn trong dung dịch.
Để yên dung dịch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4oC.
Ly tâm lạnh hỗn hợp (4oC) ở 6000 vòng/phút trong 15 phút.
Đổ bỏ phần dịch lỏng phía trên.
32
Hòa tan kết tủa bằng dung dịch đệm natri phosphate pH 7,0.
Xác định hoạt tính lactase và hàm lượng protein thu được.
Dung môi hữu cơ: (ethanol, isopropanol, acetone)
Chọn dung môi và tỉ lệ thích hợp để hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt tính lactase cao nhất.
Thông số cố định: thể tích dung dịch enzyme, thời gian, nhiệt độ.
Thông số thay đổi: tỉ lệ dung môi so với dung dịch enzyme. Tỷ lệ thể tích giữa dung môi và enzyme (Vdung môi:Venzyme)thay đổi lần lượt như sau: 90:10; 85:15;
80:20: 75:25; 70:30; 65:35; 60:40; 55:45; 50:50.
Hàm mục tiêu: Hiệu suất thu hồi và hoạt tính enzyme.
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần.
Thực hiện:
Chuẩn bị dung dịch bào chứa enzyme và các dung môi: acetone, ethanol, isopropanol.
Hút dung dịch enzyme (4oC) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung dung môi (-18oC) với tỉ lệ như đã dự kiến.
Để yên dung dịch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4oC.
Ly tâm lạnh (4oC) ở 6000 vòng/phút trong 15 phút.
Đổ bỏ phần dịch lỏng phía trên.
Hòa tan kết tủa bằng dung dịch đệm natri phosphate pH 7,0.
Xác định hoạt tính lactase và hàm lượng protein thu được.
33
2.5.2. Xác định phương pháp tinh chế:
Mẫu protein lactase thô sau khi kết tủa được tái hòa tan và tiến hành tinh sạch bằng hệ thống sắc ký loại trừ kích thước – sắc ký thẩm thấu gel (Algilent 1100series GPC Analysis System). Hệ thống này mang đến nhiều ưu điểm:
Năng suất cao với thời gian phân tích mẫu ngắn.
Phân tách hỗn hợp polymer thành các phân đoạn riêng biệt.
Xác định sự phân bố khối lượng phân tử của các polymer.
Thích hợp tinh sạch thu nhận mẫu vì thành phần mẫu không bị phá hủy hay biên đổi trong quá trình xử lý.
Với hệ thống sắc ký thẩm thấu gel, những cột thương mại thường sử dụng khi phân tích hỗn hợp protein là ProSEC 300S, Toyo Soda TSK-PW, Waters Ultrahydrogel… Trong đó cột ProSEC 300S thì lý tưởng khi phân tích protein trong dung dịch có chứa muối, cột Toyo Soda TSK-PW thì chỉ có loại PWXL-CP phù hợp để phân tách những protein nhưng ở dạng cation, cột Waters Ultrahydrogel có thể phân tách hỗn hợp protein non-ionic hoặc mẫu protein trong dung dịch chứa muối hoặc dung dịch đệm phosphate, citrate, acetate…
Đối với mẫu protein lactase thô trong nghiên cứu, nếu như tác nhân kết tủa hiệu quả nhất là dung mỗi hữu cơ thì cột ProSEC 300S sẽ không thích hợp sử dụng. Ngoài ra so sánh giữ cột Toyo Soda TSK-PW và cột Waters Ultrahydrogel thì cột Ultrahydrogel thích hợp với mẫu nghiên cứu hơn. Bên cạnh đó cột Waters Ultrahydrogel còn có nhiều ưu điểm khác như:
Khoảng pH hoạt động rộng (2 – 12).
Có thể dùng cho dung dịch muối (0,5M – 1,0M).
Có thể chịu được nồng độ dung môi hữu cơ cao (lên đến 20%).
Có thể chịu được Urea, SDS hoặc những chất hoạt động bề mặt khác.
34 Vậy, quá trình tinh sạch được thực hiện bằng hệ thống sắc ký loại trừ kích thước – sắc ký thẩm thấu gel (Algilent 1100series GPC Analysis System) sử dụng cột Ultrahydrogel 250.
Tiến hành:
Chuẩn bị pha động:
Pha dung dịch đệm natri phosphate 0,05M, pH 7,0.
Lọc dung dịch đệm vừa pha qua màng membrane 0,45 μm.
Chế độ chạy sắc ký lọc gel:
Lượng mẫu một lần bơm 0,2 ml.
Lưu lượng dòng 1 ml / phút.
Áp suất bơm: 41 bar.
Cân bằng cột và rửa giải bằng sodium phophate 0,05M, pH 7,0.
o Thu nhận mẫu chạy ra khỏi cột ở mỗi peak. Xác định hoạt tính lactase.
o Xác định phân tử lượng lactase tinh sạch bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.
2.5.3. Xác định tính chất của chế phẩm lactase:
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính chế phẩm
Xác định nhiệt độ tối ưu
Tiến hành xác định hoạt tính của chế phẩm ở nhiều giá trị nhiệt độ khác nhau và cố định giá trị pH cố định. Nhiệt độ tối ưu của chế phẩm được định nghĩa là nhiệt độ mà tại đó hoạt tính lactase là cao nhất.
Thông số cố định: pH (7,0), nồng độ cơ chất (3 mM), thời gian (10 phút).
35
Thông số thay đổi: nhiệt độ khảo sát thay đổi như sau: 30oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC, 60oC, 65oC, 70oC.
Hàm mục tiêu: hoạt tính lactase.
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần.
Độ bền nhiệt của chế phẩm
Giữ chế phẩm ở nhiều giá trị nhiệt độ khác nhau. Sau những khoảng thời gian xác định, tiến hành đo hoạt tính hoạt tính enzyme thu được. Khảo sát độ bền nhiệt của chế phẩm trong khoảng thời gian thay đổi.
Thông số cố định: pH, nồng độ cơ chất (3 mM).
Thông số thay đổi: nhiệt độ ủ chế phẩm: 30oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC, 60oC, 65oC, 70oC và tại mỗi nhiệt độ đó, sau những mốc thời gian: 10 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút xác định hoạt tính lactase.
Hàm mục tiêu: hoạt tính lactase.
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần.
Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính chế phẩm
Tiến hành xác định hoạt tính của chế phẩm ở những giá trị pH của dung dịch phản ứng khác nhau. Phản ứng được thực hiện tại nhiệt độ tối thích của chế phẩm.
Thông số cố định: nhiệt độ (40oC), nồng độ cơ chất (3 mM), thời gian (10 phút).
Thông số thay đổi: pH thay đổi khoảng 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0;
7,5; 8,0; 8,5; 9,0.
Hàm mục tiêu: Hoạt tính lactase.
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần.
36
Các thông số động học của chế phẩm
Mục đích: So sánh khả năng xúc tác của các chế phẩm thông qua 2 thông số động học quan trọng là Km và Vmax.
Nội dung: Xác định Km và Vmax theo phương pháp Lineweaver & Burk.
Thông số cố định: nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu
Thông số thay đổi: Nồng độ cơ chất khoảng 0,6 – 5,4 μmol/mL.
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần.
2.5.4. Khảo sát khả năng thủy phân lactose trong sữa tươi
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ lactase
Thông số cố định: thể tích sữa 10 ml, thời gian thủy phân 2 giờ, nhiệt độ tối ưu của lactase.
Thông số thay đổi: lượng enzyme.
Hàm mục tiêu: Hiệu suất thủy phân lactose trong sữa.
Chọn tỷ lệ chế phẩm có hiệu suất thủy phân lactose trong sữa cao nhất.
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Thông số cố định: tỷ lệ chế phẩm lactase, thể tích sữa.
Thông số thay đổi: thời gian thay đổi từ 1 đến 4 giờ.
Hàm mục tiêu: Hiệu suất thủy phân lactose trong sữa.
37