Các hợp chất flavonoid trong lá chùm ngây từ lâu đã thu hút được sự chú ý của các nhà nghiên cứu do tính chất sinh học của nó. Hiện nay, xu hướng chung của các nhóm nghiên cứu là tách chiết hợp chất flavonol từ lá Moringa, nhằm ứng dụng vào lĩnh vực y học để điều trị bệnh góp phần vào nghiên cứu y học hiện đại [13], [42]. Xuất phát từ tác dụng to lớn của lá chùm ngây, chúng tôi muốn đóng góp trong công trình nghiên cứu các hợp chất tinh túy này. Bằng phương pháp tách chiết đơn giản mà vẫn giữ được phẩm chất cũng như thành phần quan trọng của các hợp chất này. Sau khi tiến hành khảo sát các yếu tố dung môi, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi, nhiệt độ thời, phương pháp chiết. Chúng tôi sử dụng phương pháp chưng ninh trong thiết bị Water Bath của hãng Memmert để thu nhận hàm lượng quercetin có trong nguyên liệu.
Chúng tôi đề xuất quy trình tách chiết quercetin từ lá chùm ngây như sau:
Hình 4.11. Quy trình chiết xuất quercetin từ lá chùm ngây Lá non chùm
ngây
Rửa sạch, để ráo
Sấy chân không (500C, 3 giờ, 7,5%)
Nghiền, xay thành bột mịn
Chưng ninh (ethanol, 1/5, 600C, 3 giờ)
Lọc, thu dịch chiết
Cô quay chân không (500C, 50 phút)
Sản phẩm
Thuyết minh
Nguyên liệu
Việc lựa chọn nguyên liệu là yếu tố rất quan trọng, điều này ảnh hưởng rất lớn đến thành phần hóa học và hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học. Lá chùm ngây được mua ở Đà Nẵng, chọn lá non của cây chùm ngây 3 tháng tuổi, loại bỏ cuống lá, lá bị sâu bệnh,vàng úa, hư hỏng.
Xử lý
Lá chùm ngây sau khi thu mua về còn chứa nhiều tạp chất, để cho quá trình chiết tách đạt hiệu quả cao thì giai đoạn làm sạch nguyên liệu phải thật cẩn thận. Các tạp chất trong lá chủ yếu là lớp bụi bẩn bám trên bề mặt lá. Vì vậy, sau khi mua nguyên liệu về cần phải loại bỏ những tạp chất này bằng cách rửa sạch lá, để ráo.
Sấy, xay lá thành bột
Nhiệt độ và phương pháp sấy ảnh hưởng đến sự suy thoái hợp chất quercetin.
Nếu nhiệt độ sấy quá thấp thì thời gian sấy dài làm tăng chi phí sản phẩm, giảm giá trị cạnh tranh trên thị trường, giảm hiệu suất kinh tế, nếu nhiệt độ sấy quá cao gây ra sự biến tính của hợp chất quercetin [28].
Năm 2014, Beate Schulze và các cộng sự đã khảo sát nhiệt độ sấy và phương pháp sấy ảnh hưởng đến quá trình tách chiết quercetin. Kết quả, khi nhiệt độ cao và phương pháp sấy tiếp xúc sẽ làm suy thoái và ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, ở sấy thăng hoa quercetin ít bị biến tính hơn sấy chân không tuy nhiên là không đáng kể. Hơn nữa, sấy thăng hoa có nhược điểm kéo dài thời gian, tiêu thụ năng lượng cao ảnh hưởng đến hiệu suất kinh tế [24].
Mặt khác, để thuận lợi cho quá trình bảo quản và quá trình tách chiết thì lá chùm ngây sau sấy đạt độ ẩm 7,5% [40].
Sử dụng nhiệt độ sấy tại 500C, 3 giờ bằng thiết bị sấy chân không là tốt nhất, lá sau khi sấy có độ ẩm 7,5% rồi được xay thành bột mịn (hình 4.12).
Hình 4.12. Lá chùm ngây trước khi sấy và sau khi xay thành bột
Trích ly, cô quay
Cân khoảng 5g bột lá đã sấy ở trên cho vào bình tam giác 250ml để tiến hành trích ly chưng ninh với dung môi ethanol, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:5, nhiệt độ 600C trong thời gian 3 giờ. Sau đó, lọc thu dịch chiết và tiến hành cô quay ở 500C trong thời gian 50 phút thu được sản phẩm.
Sản phẩm
Sản phẩm sau khi thu được bảo quản trong lọ sẫm màu, để nơi thoáng mát tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng.
4.3.1. Tiến trình thực hiện quá trình tách chiết
Kết quả nghiên cứu về phương pháp trích ly bằng các dung môi cho thấy, hiệu quả của phương pháp chưng ninh bằng dung môi ethanol với điều kiện ở nhiệt độ 600C, tỷ lệ R/L là 1/5, thời gian 3 giờ thì thu được kết quả tối ưu và chúng tôi đã dùng dung môi ethanol để tiếp tục tách chiết nhằm tạo sản phẩm an toàn và hiệu quả nhất (Hình 4.13).
Đánh giá cảm quan mẫu chiết: mẫu thu được sau quá trình chiết là hỗn hợp dạng lỏng, có màu xanh đậm. Thử dịch chiết bằng máy đo pH cho kết quả dung dịch có pH 5,32 -5,56. Do đó ta có thể kết luận trong mẫu dịch chiết có chứa axit. Nồng độ chất khô Bx = 17 bằng thiết bị khúc xạ kế.
Hình 4.13. Lọc dịch chiết Hình 4.14. Dịch chiết trước cô quay
Hình 4.15. Dịch chiết sau cô quay
Cô đặc bằng thiết bị cô quay chân không trong 50 phút, nhiệt độ 500C [41].
Mục đích để làm giàu chất có trong dung dịch, tăng chất màu, đảm bảo nồng độ chất khô, thu hồi dung môi và tách các tạp chất dễ bay hơi.
Bảng 4.2. Bảng tổng kết một số thông số vật lý và thành phần hóa học của dịch chiết
Mẫu Dịch chiết trước cô quay Sản phẩm
Thể tích 45 12
Ph 5,32 -5,56 6.0 -6,8
Bx (%) 17 36
Đánh giá cảm quan Màu xanh đậm Màu xanh có ánh vàng
4.3.2. Bao gói sản phẩm
Việc lựa chọn bao bì trong quá trình bao gói rất quan trọng. Bao bì phải đảm bảo không tác động đến thành phần sản phẩm, phù hợp cho việc bảo quản, vận chuyển, đồng thời mang lại giá trị kinh tế. Đây là sản phẩm dạng lỏng không qua thanh trùng và bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C nên cần lựa chọn bao bì phù hợp. Một số nhân tố tác động đến thời gian bảo quản sản phẩm như là nhiệt độ, ánh sáng. Chính vì thế, chúng tôi chọn bao bì là chai lọ tối màu để tiến hành bao gói sản phẩm.
Từ sản phẩm hình 4.15, chúng tôi nhận thấy: về mặt cảm quan sản phẩm được đánh giá khá tốt. Qua nhiều lần tiến hành thí nghiệm, chúng tôi càng khẳng định màu của sản phẩm được trích ly bằng dung môi ethanol là phù hợp.
4.3.3. Kiểm tra, đánh giá mức độ kháng khuẩn của sản phẩm
Trên thế giới nói chung và của việt nam nói riêng, việc định tính, định lượng thành phần có trong dịch chiết rất nhiều. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định, dịch chiết lá chùm ngây và các thành phần trong đó đặc biệt là quercetin có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn [33], [41], [42].
Năm 2011, Jackson Rafael Oliveira Peixoto và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của dịch chiết lá chùm ngây bằng ethanol trên các chủng vi khuẩn để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của dịch chiết về sự phát triển của các vi khuẩn gram âm và dương. Phương pháp ngâm đĩa giấy được ngâm với 100, 200, 300, 400μl của chiết xuất tại 20g / 180ml và 10g / 190ml. Tất cả các chiết xuất đã được thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn Escherichia, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis. Kết quả các chủng E.coli, P.Aeruginosa kháng với tất cả các nồng độ, ở các ổ đĩa với 400μl là hiệu quả tốt
nhất chống lại Salmonella, E.Faecalis [30].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết chứa hợp chất quercetin tách chiết từ lá chùm ngây có tác dụng kháng khuẩn đối với Ecoli và Salmonella. Chủng Gram (-) và Gram (+) được phân lập từ thịt lợn tại Khoa Chăn Nuôi Thú Y - Trường Đại học Nông Lâm - Huế, được bảo quản lạnh.
Khi nghiên cứu về điều kiện sinh trưởng và phát triển của 2 chủng Ecoli và Salmonella, tác giả Phùng Thị Minh đã đưa ra kết luận như sau: cả 2 chủng này dễ dàng nuôi cấy ở môi trường thông thường, nhiệt độ thích hợp là 370C, môi trường pH axit (pH = 6 - 8) [10]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ là 370C, thời gian 24 giờ mẫu ĐC2 (Hình 4.16). Kết quả cho thấy, hai chủng đã phân lập phát triển trong điều kiện nhiệt độ cũng như pH của môi trường EMB.
Dựa trên kết quả nghiên cứu của Santosh Kumar Singh, từ dịch chiết chứa querctin từ lá chùm ngây thu được (Hình 4.14), tiến hành thử hoạt tính sinh học của nó. Có 2 phương pháp thử kháng khuẩn là phương pháp khuếch tán trên thạch và phương pháp đo độ đục trên môi truờng. Nhằm định tính hàm lượng quercetin từ dịch chiết, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm sản phẩm trên môi trường EMB với 2 chủng Ecoli, Salmonella bằng phương pháp khuếch tán.
Chúng tôi tiến hành trích ly quercetin từ lá chùm ngây với dung môi ethanol, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:5, nhiệt độ 600C trong 3 giờ để lọc thu dịch chiết và cô quay chân không ở 500C với thời gian 50 phút, thu sản phẩm, tiến hành thử nghiệm bằng phương pháp đục lỗ (cách tiến hành ở phụ lục 3). Kết quả ĐC1 (Hình 4.16 ) cho thấy, chế phẩm dịch chiết lá chùm ngây chứa quercetin không bị nhiễm vi sinh vật có hại. Từ đó, chúng tôi tiến hành thử kháng khuẩn trên môi trường EMB với 2 chủng vi khuẩn E. Coli, Salmonella. Chúng tôi nhận thấy, cả hai chủng đều xuất hiện vòng kháng khuẩn. Chứng tỏ thành phần trong chế phẩm vẫn giữ được hoạt tính sinh học ban đầu của nó. Các kết quả đều cho chủng Salmonella có đường kính vòng kháng lớn hơn chủng Ecoli (Bảng 4.3).
Bảng 4.3. Kết quả thử kháng khuẩn của dịch chiết lá chùm ngây bằng ethanol trên vi khuẩn Ecoli và Salmonella nuôi cấy trên môi trường EMB
Chủng vi sinh vật kiểm định
Đường kính vòng phân giải (ΔD, mm)
Ecoli 15,35
Salmonella 18,62
Qua quá trình thực nghiệm (thử hoạt tính kháng khuẩn của quercetin tách chiết từ lá chùm ngây), cho thấy: chế phẩm đều có khả năng kháng với 2 loại vi sinh vật kiểm định. Trong đó, Salmonella là chủng kháng mạnh hơn, với kết quả được trình bày trong bảng 4.3 và hình 4.17.
Theo nghiên cứu của tác giả Santosh Kumar Singh về hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá chùm ngây trên các loại dung môi nước, ethanol, methanol cho thấy dịch chiết với ethanol có khả năng kháng khuẩn rất tốt, đường kính vòng kháng khuẩn đối với chủng Ecoli là 11mm [38]. Ngoài ra, khi nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của đậu tương chiết xuất dầu gừng đường kính vòng kháng khuẩn với chủng Ecoli là 8mm và Samonella là 11,67mm [34].
So với dịch chiết ethanol chúng tôi thu được thì đường kính vòng kháng khuẩn (bảng 4.3) cao hơn nhiều.
Nghiên cứu của Hoàng Văn Tuấn và cộng sự về hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết diếp cá đối với chủng E.coli đường kính vòng phân giải đo được là 18mm, khi đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết bột tỏi đối cới chủng Ecoli đường kính đo được là 24mm [39]. Kết quả này cao hơn so với kết quả dịch chiết lá chùm ngây mà chúng tôi nghiên cứu được (15,35mm).
Hình 4.16. Mẫu đối chứng sản phẩm, vi sinh vật Gram (+) và Gram (-) Khi thấy vòng kháng khuẩn xuất hiện xung quanh lỗ, chứng tỏ rằng sản phẩm chúng tôi tạo ra vẫn giữ được tính chất vốn có ban đầu của nguyên liệu, chứng tỏ hàm lượng quercetin có trong sản phẩm nhiều.
ĐC1 ĐC2 E.coli ĐC2 Samonella
Dưới đõy là cỏc hỡnh ảnh ghi lại trong quỏ trỡnh theo dừi:
Hình 4.17. Vòng vô khuẩn của chế phẩm đối với 2 chủng Ecoli và Salmonella của dịch chiết sau cô quay
Từ đó, chúng tôi khẳng định rằng việc ứng dụng quy trình tách chiết quercetin bằng dung môi ethanol từ lá chùm ngây có ý nghĩa và là công cụ hỗ trợ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Ecoli Samonella