Từ kết quả xác định hoạt độ cho thấy Te cĩ hoạt độ cao nhất, sau đĩ đến Fu và thấp nhất là Dia. Cụ thể đơn vị hoạt động của Te gấp 2,38 lần Ce; 1,21 lần Fu và 9,43 lần Dia. Trong nghiên cứu về “khảo sát quá trình cố định enzym α - amylase (Te) bởi chất mang CMC-Alginate”, tác giả Huỳnh Ngọc Oanh, Vũ Thanh Thảo - Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-TP.HCM dùng phương pháp Smith và Rose đã xác định được hoạt tính củaTer là 13333 (U/ml) [21]. Như vậy đơn vị hoạt độ Te trong đề tài xác định được bằng phương pháp Heinkel (11170,21 U/ml) thấp hơn khoảng 16% so với kết quả nghiên cứu của tác giả Huỳnh Ngọc Oanh, Vũ Thanh Thảo. Cĩ điều này là do: các tác giả dùng phương pháp khác nhau để xác định hoạt độ Te.
3.3.2. Kết quả xác định mức độ thủy phân Car của Fu, Dia, Ce, Te
Hoạt độ của enzyme amylase xác định được ở trên theo phương pháp Heinkel với cơ chất chuẩn là tinh bột. Khi sử dụng enzyme amylase để thủy phân Car cần kiểm tra lại mức độ thủy phân của enzyme amylase trên cơ chất Car. Do vậy, chúng tơi đã tiến hành thử nghiệm xác định mức độ thủy phân Car của các enzyme trên. Tiến hành 4 thí nghiệm với Fu, Dia, Ce, Te với hàm lượng Te dùng
0,2% trên trọng lượng mẫu (w/w). Dựa vào kết quả tại bảng 3.18 phụ lục 1, ta cĩ lượng các enzyme cần dùng như sau:
Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện nhiệt độ là 400C; pH là 6,0; nồng độ dung dịch Car là 0,5%. Sau thời gian 2 giờ, lấy mẫu đi xác định độ nhớt trên máy Fann với tốc độ quay 600v/p tại nhiệt độ 300C. Kết quả trình bày trong bảng 3.19 phụ lục 1 và hình 3.3. 34 33 32 31 30 29 28 33.84 27 26 25.1 26.24 25.86 25 24 Ce Fu Dia Te
Loại enzyme amylase Hình 3.3. Mức độ thủy phân Car của Fu, Dia, Ce, Te
Từ kết quả thí nghiệm đã cho thấy: Te cho mức độ thủy phân Car cao nhất phù hợp với kết quả xác định hoạt độ enzyme trên cơ chất chuẩn là tinh bột bằng phương pháp Heinkel ở trên.
Do vậy từ các kết quả trên, chọn loại enzyme amylase thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty là Te.
Enzyme Te
Fu
3.4. Kết quả xác định thơng số thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong sụn
Thơng số thích hợp cho q trình thủy phân Car từ rong sụn là thơng số để thủy phân cắt mạch Car, đưa Car cĩ khối lượng phân tử trung bình 218.010 Da (xác định ở phần 3.2) về dạng Dexcar cĩ khả năng hịa tan tốt, cĩ hoạt tính cao (khối lượng phân tử 51.000 ÷ 54.000 Da [7]) để sản xuất trà hịa tan. Như nhận xét ở phần trên, mức độ thủy phân Car cần thiết để thu được Dexcar cĩ khối lượng phân tử 51.000 ÷ 54.000 Da xác định theo cơng thức 2.2.6.2. Do vậy, ta cĩ:
Mức độ thủy phân Car cần thiết=
(%)
(218.010 – 52.500) × 100
218.010 = 75,91 %
Đây là cơ sở để chọn chế độ thủy phân xác định khối lượng phân tử trung bình của Dexcar.
3.4.1. Kết quả xác định nồng độ enzyme thủy phân Car
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi tăng nồng độ enzyme, tốc độ phản ứng sẽ tăng nhưng mức độ tăng nồng độ enzyme cũng cĩ giới hạn vì khi tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm sẽ khơng cĩ hiệu quả trong thực tế sản xuất. Để xác định ảnh hưởng của nồng độ Te đến mức độ thủy phân Car, tiến hành 4 mẫu thí nghiệm với các nồng độ Te trong dung dịch thủy phân khác nhau: 0,1%÷0,4%. Trong đĩ, mẫu 1: nồng độ Te 0,1%; mẫu 2: nồng độ Te 0,2%; mẫu 3: nồng độ Te 0,3%; mẫu 4: nồng độ Te 0,4%. Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện pH=6,0; nhiệt độ 400C; nồng độ dung dịch Car là 0,5%. Sau thời gian 2 giờ, lấy mẫu đi xác định độ nhớt trên máy Fann với tốc độ quay 600v/p tại nhiệt độ 300C. Kết quả trình bày trong bảng 3.20 phụ lục 1 và hình 3.4.
36 34 32 30 28 26 28.13 33.84 34.98 35.36 0.1 0.2 0.3 0.4 Nồng độ Te (%) Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ Te đến mức độ thủy phân Car
Từ kết quả các thí nghiệm cho thấy: khi nồng độ Te tăng trong khoảng 0,1 ÷ 0,2% thì mức độ thủy phân Car cũng tăng nhanh. Cụ thể với mẫu 1: nồng độ Te 0,1% thì mức độ thủy phân Car là 28,13%, mẫu 2: nồng độ Te 0,2% mức độ thủy phân Car là 33,84% tăng 5,71% so với mẫu Te 0,1%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ Te thì mức độ thủy phân Car tăng chậm. Cụ thể mẫu 3: nồng độ Te 0,3% thì mức độ thủy phân Car là 34,98% tăng 1,14% so với mẫu Te 0,2%; mẫu 4: nồng độ Te 0,4% thì mức độ thủy phân Car là 35,36% chỉ tăng 1,52% so với mẫu Te 0,2% .
Như vậy, từ kết quả trên cho thấy chọn nồng độ Te 0,2% là hợp lý. Vì nếu chúng ta tiếp tục tăng nồng độ Te thì mức độ thủy phân Car cũng tăng khơng đáng kể.
3.4.2. Kết quả xác định nhiệt độ thủy phân Car
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp tới vận tốc phản ứng của enzyme. Nhiệt độ càng tăng thì vận tốc của phản ứng cĩ xúc tác enzyme càng tăng. Nhưng vì enzyme cĩ bản chất protein nên nhiệt độ chỉ tăng đến một mức độ giới hạn. Nếu vượt quá giới hạn này thì phản ứng sẽ giảm hoặc dừng lại do bản thân enzyme bị biến tính. Nhiệt độ mà ở đĩ tốc độ phản ứng đạt cực đại gọi là nhiệt độ tối thích. Nhiệt độ tối thích của enzyme khơng phải là hằng số mà nĩ cịn phụ thuộc
vào nhiều yếu tố khác như: cơ chất, pH mơi trường, nồng độ enzyme, nguồn enzyme. Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến mức độ thủy phân Car của Te, tiến hành 7 mẫu thí nghiệm với các nhiệt độ trong dung dịch thủy phân khác nhau: 300C ÷ 900C. Trong đĩ: mẫu 1: ứng với nhiệt độ 300C; mẫu 2: 400C; mẫu 3: 500C; mẫu 4: 600C; mẫu 5: 700C; mẫu 6: 800C; mẫu 7: 900C. Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện pH=6,0; nồng độ Te=0,2%; nồng độ dung dịch Car là 0,5%. Sau thời gian 2 giờ, lấy mẫu đi xác định độ nhớt trên máy Fann với tốc độ quay 600v/p tại nhiệt độ 300C. Kết quả trình bày trong bảng 3.21 phụ lục 1 và hình 3.5; 3.6.
+ Trường hợp khơng bổ sung Ca2+
42 40 40.68 39.54 38 37.26 38.02 37.64 36 34 32 30 28 30.79 33.84 30 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ (0C) Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân Car
+ Trường hợp bổ sung 40 ppm Ca2+ 52 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 30.41 33.46 37.64 42.58 48.28 49.8 50.57 30 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ (0C) Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân Car (40 ppmCa2+)
Từ các kết quả thí nghiệm cho thấy:
+ Với trường hợp khơng bổ sung 40 ppm Ca2+: khi nhiệt độ tăng trong khoảng 30÷600C thì mức độ thủy phân Car cũng tăng nhanh. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên trên 600C thì mức độ thủy phân Car lại giảm dần.
+ Với trường hợp bổ sung 40 ppm Ca2+: khi nhiệt độ tăng trong khoảng 30 ÷ 900C thì mức độ thủy phân Car cũng tăng nhanh, đặc biệt trong khoảng nhiệt độ 40
÷ 700C và khi nhiệt độ lớn hơn 700C thì mức độ thủy phân Car tăng chậm lại. So sánh hai trường hợp khơng bổ sung Ca2+ và cĩ bổ sung 40ppm Ca2+ nhận thấy ở dải nhiệt độ từ 30÷500C thì trường hợp khơng bổ sung Ca2+ và cĩ bổ sung 40ppm Ca2+ cĩ mức độ thủy phân Car là gần tương đương nhau. Tuy nhiên, khi nhiệt độ thủy phân tăng lên trên 500C thì mức độ thủy phân Car trong trường hợp cĩ bổ sung Ca2+ tăng nhiều hơn trường hợp khơng bổ sung Ca2+. Đặc biệt, khi nhiệt độ
thủy phân lớn hơn 600C thì mức độ thủy phân Car cĩ sự khác biệt rõ rệt giữa trường hợp cĩ bổ sung 40ppm Ca2+ và trường hợp khơng bổ sung Ca2+: với trường hợp cĩ bổ sung canxi, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì mức độ thủy phân Car vẫn tăng lên; cịn trường hợp khơng cĩ bổ sung thêm canxi thì khi tăng nhiệt độ lên mức độ thủy phân lại giảm dần.
Như vậy, từ kết quả trên cho thấy, chọn nhiệt độ thủy phân Car 800C và cĩ bổ sung thêm 40ppm Ca2+ là hợp lý. Vì nếu chúng ta tiếp tục tăng nhiệt độ thủy phân lên thì mức độ thủy phân Car cũng tăng khơng đáng kể. Mặt khác khi thủy phân Car ở nhiệt độ cao sẽ ảnh hưởng nhiều hơn đến chất lượng của sản phẩm. Cịn nếu chọn nhiệt độ thấp hơn sẽ phải kéo dài thời gian thủy phân hơn để đạt được mức độ thủy phân cần thiết.
So sánh với nhiệt độ thủy phân của các enzyme khác như cellulase từ xạ khuẩn (nhiệt độ thủy phân thích hợp là 550C), enzyme papain (nhiệt độ thủy phân thích hợp là 750C) từ nhựa quả Đu Đủ trong các nghiên cứu của tác giả GS.TS. Trần Thị Luyến hay nghiên cứu quá trình thủy phân thịt cá Mối bằng enzyme protease từ vi khuẩn B. subtilis S5 của TS. Vũ Ngọc Bội (nhiệt độ thủy phân thích hợp là 500C) cho thấy nhiệt độ thủy phân của Te là khá cao (800C). Tính bền nhiệt của α-amylase cĩ được là do sự cĩ mặt của canxi trong phân tử enzyme, ở đây canxi giữ vai trị ổn định cấu trúc bậc ba của phân tử enzyme.
3.4.3. Kết quả xác định pH thủy phân Car
Mỗi loại enzyme sẽ cĩ hoạt tính cao nhất ở một pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme. pH ảnh hưởng tới hoạt tính xác tác của enzyme, do nĩ làm thay đổi trạng thái ion hĩa các nhĩm định chức trong trung tâm hoạt động của enzyme, cĩ thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme. Nĩ cũng cĩ thể làm thay đổi trạng thái ion hĩa của cơ chất làm ảnh hưởng tới khả năng hình thành hợp chất trung gian. Để xác định ảnh hưởng của pH thủy phân đến mức độ thủy phân Car, tiến hành 5 mẫu thí nghiệm với các pH trong dung dịch thủy phân khác nhau:
pH=5,5 ÷ 7,5. Trong đĩ, mẫu 1: ứng với pH=5,5; mẫu 2: pH=6,0; mẫu 3: pH=6,5; mẫu 4: pH=7,0; mẫu 5: pH=7,5. Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện nhiệt độ thủy phân Car là 800C và cĩ bổ sung thêm 40ppm Ca2+; nồng độ Te=0,2%; nồng độ dung dịch Car là 0,5%. Sau thời gian 2 giờ, lấy mẫu đi xác định độ nhớt trên máy Fann với tốc độ quay 600v/p tại nhiệt độ 300C. Kết quả trình bày trong bảng 3.22 phụ lục 1 và hình 3.7. 56 54 52 50 47.9 49.8 51.33 50.19 48.66 48 46 44 42 40 5.5 6 6.5 7 7.5 pH
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân Car
Từ kết quả các thí nghiệm đã cho thấy khi thủy phân Car với pH=6,5 thì cho mức độ thủy phân Car là cao nhất. Cụ thể với mẫu 3: pH=6,5 thì mức độ thủy phân Car là 51,33 %. Khi thủy phân ở pH cao hơn hoặc thấp hơn 6,5 thì mức độ thủy phân Car đều bị giảm, và thủy phân ở pH càng xa với pH=6,5 thì mức độ thủy phân Car càng bị giảm nhiều hơn. Cụ thể mẫu 1: pH thủy phân là pH=5,5 thì mức độ thủy phân Car là 47,90 % giảm 3,43% so với mẫu pH=6,5; mẫu 2: pH thủy phân là pH=6,0 thì mức độ thủy phân Car là 49,80 % giảm 1,53% so với mẫu pH=6,5; mẫu 4: pH thủy phân là pH=7,0 thì mức độ thủy phân Car là 50,19 % giảm 1,14% so với mẫu pH=6,5; mẫu 5: pH thủy phân là pH=7,5 thì mức độ thủy phân Car là 48,66 % giảm 2,76% so với mẫu pH=6,5.
Như vậy, từ kết quả trên cho thấy, chọn thủy phân Car với pH=6,5 là hợp lý. Vì nếu chúng ta tăng hay giảm pH thủy phân thì mức độ thủy phân Car đều giảm.
So sánh với các nghiên cứu của GS.TS Trần Thị Luyến và các cộng sự về pH thích hợp cho thủy phân chitin của một số enzyme như cellulase (pH=5,2);
Hemicellulase thương mại (pH=5,5); enzyme papain (pH=5,5). Kết quả cho thấy pH thích hợp cho q trình thủy phân Car bằng Te cao hơn so với với pH của các enzyme cellulase, hemicellulase, papain.
pH trên gần tương tự với pH thích hợp cho enzyme amylase từ nấm mốc
Asp.oryzae. Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hĩa và
đường hĩa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6÷6,2. Cịn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hĩa của nĩ là 6,0÷7,0. Chứng tỏ các enzyme α-amylase nĩi chung hoạt động thủy phân tốt ở vùng acid yếu.
3.4.4. Kết quả xác định nồng độ Car thủy phân
Trong phản ứng thủy phân Car, cĩ sự hình thành phức chất trung gian giữa enzyme và cơ chất (ES), tiếp đĩ mới cĩ sự chuyển hĩa trong phức chất để tạo ra sản phẩm và giải phĩng enzyme ở dạng tự do. Tốc độ phản ứng thủy phân tỷ lệ với nồng độ của phức chất trung gian, vì vậy nồng độ cơ chất cĩ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ của phản ứng cĩ enzyme xúc tác. Để xác định ảnh hưởng của nồng độ Car đến mức độ thủy phân Car, tiến hành 6 mẫu thí nghiệm với các nồng độ dung dịch Car thủy phân khác nhau 0,25÷1,5%. Trong đĩ mẫu 1: ứng với [Car]=0,25%; mẫu 2: ứng với [Car]=0,5%; mẫu 3: [Car]=0,75%; mẫu 4: [Car]=1,0%; mẫu 5:
[Car]=1,25%; mẫu 6: [Car]=1,50%. Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện nhiệt độ thủy phân Car là 800C và cĩ bổ sung thêm 40ppm Ca2+; nồng độ Te=0,2%; pH dung dịch Car thủy phân là 6,5. Tại thời điểm ban đầu và thời điểm sau thời gian 2 giờ, lấy mẫu đi xác định độ nhớt trên máy Fann với tốc độ quay 600v/p tại nhiệt độ 300C. Kết quả trình bày trong bảng 3.23 phụ lục 1 và hình 3.8.
55 50 45 47.64 51.33 49.45 40.99 40 35 30 25 20 15 10 5 27.01 11.89 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 Nồng độ Car (%)
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ Car đến mức độ thủy phân Car
Từ kết quả các thí nghiệm cho thấy, khi nồng độ Car 0,25%÷0,5% thì mức độ thủy phân tăng. Với nồng độ Car là 0,5% thì cho mức độ thủy phân Car là cao nhất, và khi nồng độ Car lớn hơn 0,75% thì mức độ thủy phân Car giảm mạnh. Cụ thể với mẫu 1: [Car]=0,25%, thì mức độ thủy phân Car là 47,64 % thấp hơn 3,69% so với mẫu Car 0,5%; mẫu 3: [Car]=0,75%, thì mức độ thủy phân Car là 49,45 % giảm 1,88% so với mẫu Car 0,5%; mẫu 4: [Car]=1,00 %, thì mức độ thủy phân Car là 40,99 % giảm 10,34% so với mẫu Car 0,5%, mẫu 5: [Car]=1,25%; thì mức độ thủy phân Car là 27,01 % giảm 24,32% so với mẫu Car 0,5%; mẫu 6: [Car] = 1,50%, thì mức độ thủy phân Car là 11,89 % giảm 39,44% so với mẫu Car 0,5% .
Như vậy từ kết quả trên, chọn nồng độ dung dịch Car 0,75% là hợp lý. Vì mặc dù với nồng độ Car 0,5% thì mức độ thủy phân là cao nhất nhưng vì nồng độ này thấp hơn 0,25% so với mẫu Car 0,75% nhưng chỉ cho mức độ thủy phân cao hơn 1,88%. Do đĩ, chọn Car 0,75% cho hiệu quả kinh tế hơn.
3.4.5. Kết quả xác định thời gian thủy phân
Te là một α-amylase, do đĩ quá trình thủy phân bởi Te là quá trình đa giai đoạn nên thời gian thủy phân cĩ ảnh hưởng lớn đến dạng sản phẩm tạo thành là dextrin phân tử thấp; oligo hay monosaccharide. Cụ thể, trong phản ứng thủy phân Car, thời gian thủy phân ảnh hưởng nhiều đến mức độ thủy phân Car. Để xác định ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân Car, tiến hành 9 mẫu thí nghiệm với các thời gian thủy phân khác nhau: 1÷9 giờ. Trong đĩ mẫu 1: ứng với thời gian=1 giờ; mẫu 2: ứng với thời gian=2 giờ; mẫu 3: ứng với thời gian =3 giờ; mẫu 4: ứng với thời gian=4 giờ; mẫu 5: ứng với thời gian=5 giờ; mẫu 6: ứng với thời gian=6 giờ; mẫu 7: ứng với thời gian=7 giờ; mẫu 8: ứng với thời gian=8 giờ; mẫu 9: ứng với thời gian=9 giờ. Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện nhiệt độ thủy phân Car là 800C và cĩ