Mẫu Nồng độ (µg/ml)
1 410.6
2 453.2
3 317.0
Giả thiết rằng sự tác dụng của cao dịch chiết hà thủ ô đỏ đi theo con đường chính thống nhất đã được tìm hiểu từ các nghiên cứu khoa học trước đó là con đường MC1R/MITF/tyrosinase, chúng tơi đã tiến hành PCR với các đoạn mồi đặc hiệu MC1R, MITF và tyrosinase, cuối cùng điện di kiểm tra kết quả, thu được kết quả như trong hình 3.7, hình 3.8, hình 3.9.
Hình 3.7. Mức độ biểu hiện của gene giữ nhà GAPDH của cDNA các mẫu tế bào melanoma.
Chú thích: NC: Mẫu đối chứng.
Giếng 1: Mẫu cDNA tế bào nuôi cấy ở điều kiện thường. Giếng 2: Mẫu cDNA tế bào bổ sung ASP.
Giếng 3: Mẫu cDNA tế bào vừa bổ sung ASP vừa bổ sung HTO
Hình ảnh điện di với cặp mồi GAPDH được trình bày như hình 3.7. Kết quả cho thấy các băng xuất hiện rõ nét, độ sáng tương đương nhau, kích thước khoảng 366bp đúng với kích thước đoạn AND của gen như mong muốn.
Trong sinh học phân tử, gen giữ nhà là cần thiết trong việc duy trì tất cả các chức năng cơ bản của tế bào được thể hiện trong tất cả các tế bào ở điều kiện sinh lý bình thường. Gen GAPDH được thể hiện trên mọi tế bào, không phụ thuộc vào thể loại, trạng thái hoạt động hay nguồn gốc nên được dùng như một gen nội chuẩn để đánh giá mẫu.
Hình ảnh điện di GAPDH cho thấy chất lượng các mẫu tốt, đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng, đồng thời khơng có sự khác biệt về lượng mẫu đã sử dụng trong mỗi phản ứng PCR.
200bp 500bp
Hình 3.8. Mức độ biểu hiện của gene MC1R của cDNA các mẫu tế bào melanoma.
Chú thích: NC: Mẫu đối chứng.
Giếng 1: Mẫu cDNA tế bào nuôi cấy ở điều kiện thường. Giếng 2: Mẫu cDNA tế bào bổ sung ASP.
Giếng 3: Mẫu cDNA tế bào vừa bổ sung ASP vừa bổ sung HTO.
Hình ảnh điện di với cặp mồi MC1R được trình bày trong hình 3.8. Kết quả cho thấy, chỉ xuất hiện 1 băng ở giếng số 1, với kích thước đúng với đoạn gen nhân lên khoảng 133bp. Trong khi đó ở giếng thứ 2 và 3 hầu như không thấy xuất hiện băng. Điều này chứng tỏ ASP đã ức chế sự biểu hiện của MC1R và dịch chiết hà thủ ơ đỏ khơng có khả năng làm tái hoạt MC1R khi nó đã bị ức chế bởi ASP.
200bp 100bp
Hình 3.9. Mức độ biểu hiện của gene MITF (A) và tyrosinase (B) của cDNA các mẫu tế bào melanoma
Chú thích: NC: Mẫu đối chứng.
Giếng 1: Mẫu cDNA tế bào nuôi cấy ở điều kiện thường. Giếng 2: Mẫu cDNA tế bào bổ sung ASP.
Giếng 3: Mẫu cDNA tế bào vừa bổ sung ASP vừa bổ sung HTO.
Hình ảnh điện di với mồi MITF và tyrosinase được trình bày trong hình 3.9. Trong hình 3.9 xuất hiện các băng điện di với mồi MITF, kích thước đúng khoảng 121bp và với mồi tyrosinase, kích thước khoảng 111bp đúng như mong muốn ở giếng số 1 và giếng số 3 mà không xuất hiện ở giếng số 2. Điều này cho thấy rằng ASP làm ức chế sự biểu hiện của MC1R (hình 3.9, giếng số 2) và dẫn tới sự suy giảm biểu hiện của MITF và tyrosinase (hình 3.9, các giếng số 2). Một điều rất thú vị đó là mặc dù dịch chiết hà thủ ơ khơng có khả năng kích hoạt sự biểu hiện của MC1R sau khi đã bị ức chế bởi ASP (hình 3.9, giếng số 3), nhưng nó lại làm cho sự biểu hiện tăng trở lại của MITF và tyrosinase (hình 3.9, các giếng số 3) sau khi nó bị ức chế bởi ASP (hình 3.9, các giếng số 2).
200bp 100bp
Kết luận:
Các kết quả được trình bày trong các hình 3.8 và hình 3.9 chỉ ra rằng cao dịch chiết hà thủ ơ có khả năng làm tăng sinh tổng melanin thông qua khả năng tác động và làm tăng sự biểu hiện của MITF và tyrosinase mà không ảnh hưởng đến thụ thể MC1R.
Như vậy có thể giả thiết rằng dịch chiết hà thủ ơ tác động một cách trực tiếp lên sự biểu hiện của MITF và tyrosinase hoặc gián tiếp qua các phân tử tín hiệu khác với cơ chế chưa rõ. Vì vậy, chúng tơi tiếp tục tiến hành đề tài này bằng việc thực hiện đánh giá cơ chế phân tử tác dụng của cao dịch chiết HTO đỏ trong methanol thông qua con đường thứ hai đã được nhắc đến ở trên, con đường RAS /RAF /MEK /ERK /MITF /Tyrosinase. Thực hiện phản ứng PCR với các đoạn mồi đặc hiệu là Nras và ERK, sau đó tiến hành kiểm tra bằng phương pháp điện di thu được kết quả như hình 3.10, hình 3.11.
Hình 3.10. Mức độ biểu hiện của gene Nras (120bp) của cDNA các mẫu tế bào melanoma
Chú thích: NC: Mẫu đối chứng.
Giếng 1: Mẫu cDNA tế bào nuôi cấy ở điều kiện thường. Giếng 2: Mẫu cDNA tế bào bổ sung ASP.
Giếng 3: Mẫu cDNA tế bào vừa bổ sung ASP vừa bổ sung HTO
200bp
Hình ảnh điện di với mồi Nras được trình bày trên hình 3.10. Hình 3.10 xuất hiện 3 băng với kích thước khoảng 120bp, đúng với kích thước gene quan tâm.
Hình 3.11. Mức độ biểu hiện của gene ERK của cDNA các mẫu tế bào melanoma
Chú thích: NC: Mẫu đối chứng.
Giếng 1: Mẫu cDNA tế bào nuôi cấy ở điều kiện thường. Giếng 2: Mẫu cDNA tế bào bổ sung ASP.
Giếng 3: Mẫu cDNA tế bào vừa bổ sung ASP vừa bổ sung HTO.
Hình 3.11 thể hiện hình ảnh điện di với mồi ERK. Trên hình xuất hiện 3 băng với kích thước đúng với mong muốn khoảng 186bp.
Các hình 3.10 và 3.11 là kết quả điện di với các cặp mồi lần lượt là Nras và ERK. Kết quả thu được cho thấy, các băng điện di xuất hiện ở tất cả các giếng 1, 2 và 3, tuy nhiên cường độ tín hiệu ở các giếng số 1 và 3 là mạnh hơn so với cường độ tín hiệu ở giếng số 2, đặc biệt là trong trường hợp của gen Nras. Điều này chỉ ra rằng, ASP ngồi khả năng ức chế MC1R thì nó cũng có khả năng làm ức chế biểu hiện của Nras. Điều này cũng dễ hiển bởi vì giữa các thụ thể màng tế bào MC1R và Nras có mối liên hệ thông qua sự hoạt động của các G-protein như đã trình bày trong hình 1.4. Tuy nhiên, một điều rất đáng được quan tâm ở đây là mặc dù cao dịch chiết HTO đỏ khơng có khả năng làm tái hoạt hóa hay tăng biểu hiện của MC1R sau khi đã bi ức chế bởi ASP (đã thảo luận ở trên) nhưng nó lại có khả năng
200bp
ức chế phần nào bởi ASP (giếng số 2, hình 3.10). Và từ sự tái hoạt của Nras này là nguyên nhân dẫn tới sự tăng biểu hiện của ERK (giếng số 3, hình 3.11).
Ras và ERK là các phân tử chịu trách nhiệm khởi đầu trong con đường sinh tổng hợp melain Ras/ERK. Khi 2 phân tử này được kích hoạt sẽ dẫn đến sự phiên mã của yếu tố phiên mã MITF và cuối cùng làm tyrosinase hoạt động, chi phối sự tổng hợp melanin.
Kết luận:
Con đường Nras/ERK có thể là một trong những con đường tham gia vào quá trình điều hịa sinh tổng hợp melanin và được kích hoạt bởi cao dịch chiết hà thủ ô đỏ.
3.3. Kết quả in vivo
3.3.1. Thử độc tính của methanol lên sự phát triển của phơi cá ngựa vằn
Ở thí nghiệm này chúng tơi sử dụng dung mơi methanol để thử độc tính lên phơi cá ngựa vằn. Ngun nhân chính là do trong cao dịch chiết hà thủ ô tách chiết từ methanol có chứa nhiều hợp chất có tính phân cực cao, dễ dàng được hòa tan, vận chuyển và từ đó có thể tác động vào cơ thể sinh vật. Bên cạnh đó, methanol có khả năng tan hồn tồn trong nước hay là trong mơi trường ni phôi cá ngựa vằn, trong khi ethyl acetate tan hạn chế và n-hexane không tan trong nước. Hơn nữa, từ kết quả thu được khi tách chiết hà thủ ô, cao dịch chiết trong methanol có khối lượng lớn nhất, vì vậy mà thuận lợi hơn cho việc thí nghiệm.
Để xác định nồng độ methanol gây dị dạng và gây chết ở cá ngựa vằn, trước hết chúng tơi thực hiện các thí nghiệm thu hẹp dải nồng độ methanol mà ở đó cá ngựa vằn sinh trưởng hồn tồn bình thường tại nồng độ thấp nhất và chết 100% tại nồng độ cao nhất. Dải nồng độ cuối cùng chúng tôi dùng để đánh giá tỷ lệ dị dạng và tỷ lệ chết được cho dưới bảng 3.3.