NDMA NDPA
Một yếu tố khác có ảnh hưởng đến hình dạng pic sắc ký là hệ dung mơi pha chuẩn. Theo kết quả phân tích, khi sử dụng dung dịch chuẩn được pha trong ACN, nhận thấy pic của các nitrosamin bị tách ở phần đầu píc (hình 3.3B). Qua các tài liệu tham khảo [23], khi pha chuẩn trong ACN:DCM (1:1), pic của các nitrosamin nhọn, sắc nét, khơng bị chẻ pic (hình 3.3A). Vì vậy chúng tơi lựa chọn ACN:DCM (1:1/v:v) là dung môi pha chuẩn. Mẫu được xử lý theo phương pháp QuEChERS với dung môi ACN sẽ được bổ sung lượng DCM để tạo tỷ lệ ACN:DCM (1:1) trước khi phân tích bằng GC-MS/MS.
(A: Dung môi pha chuẩn: ACN:DCN 1:1)
(B: Dung mơi pha chuẩn: ACN)
Hình 3.3. Sắc ký đồ các nitrosamintrong dung môi ACN và ACN:DCM (1:1/v:v)
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu
3.1.2.1. Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu
Với nhiều ưu điểm, phương pháp QuEChERS được lựa chọn để chiết nitrosamin [23]. Quy trình xử lý mẫu ban đầu được tóm tắt ở hình 3.4.
NDMA
NDMA
NDPA NDPhA
NDPhA NDPA
Hình 3.4. Tóm tắt quy trình xử lý mẫu dự kiến
Từ quy trình dự kiến ở trên, chúng tôi thấy cần phải khảo sát muối chiết, phương pháp chiết, thời gian chiết, loại và lượng bột làm sạch trong bước d-SPE để thu được hiệu suất chiết tối ưu. Cố định nồng độ thêm chuẩn là 100 ng/g để thực hiện các bước khảo sát (50 µL dung dịch chuẩn 10 µg/mL).
Cân ~ 5 g mẫu/ống ly tâm 50 mL
+50 µL dung dịch IS 10 µg/mL, để 15 phút + 10 mL acetonitril : nước (1:1), lắc 1 phút
+ 5,5 g muối chiết
Lắc ngang/siêu âm 30 phút, ly tâm 6000 rpm/5 phút
Hút 2 mL/ chiết d-SPE (MgSO4+ C18/PSA)
Lắc và ly tâm ở 6000 rpm/5 phút +2 ml n-hexan Hút 0,5 mL lớp ACN +Bỏ lớp n-hexan Bơm 1 µL vào GC-MS/MS +0,5 mL DCM
3.1.2.2. Khảo sát muối chiết
Một số muối chiết thông thường sử dụng cho phương pháp QuEChERS được tiến hành khảo sát: MgSO4 + NaCl, (NH4)2CO3, NH4Cl. Cố định các bước chiết theo quy trình trên, sử dụng mẫu thịt nướng đã được xác định là không có nitrosamin. Sau khi cân mẫu, thêm nội chuẩn và chất chuẩn, để yên 15 phút, thêm 10 mL ACN:H2O (1:1) và tiến hành chiết mẫu với 3 loại hỗn hợp muối chiết khác nhau (A) 4g MgSO4 + 1,5 g NaCl; (B) 5,5 g (NH4)2CO3; (C) 5,5 g NH4Cl, tiến hành các bước tiếp theo như quy trình trên. Kết quả thu được thể hiện trong hình 3.5.
Nhận xét: Sử dụng muối chiết là MgSO4 cho hiệu suất cao với NDMA tuy
nhiên với NDPA và NDPhA lại cho hiệu suất thấp . Sử dụng NH4Cl cho hiệu suất cao nhất đối với NDPA, NDPhA và hiệu suất chấp nhận được với NDMA. Do vậy NH4Cl được sử dụng là muối chiết cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
4 x10 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3
Counts vs. Acquisition Time (min)
9.3 9.35 9.4 9.45 9.5 9.55 9.6 9.65 NDPA + TIC MRM (** -> **) NH4Cl-31010 + TIC MRM (** -> **)MgSO4-21525 + TIC MRM (** -> **)(NH4)2CO3-29245 4 x10 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 + TIC MRM NH4Cl-72889 NDMA + TIC MRM MgSO4l-75914 + TIC MRM NH4)2CO3-81614
Counts vs. Acquisition Time (scans)