9 Rất yếu (sinh trưởng còi cọc; lá chuyển màu vàng)
4.5 BẢO TỒN IN VITRO 1 Nguyên lý bảo tồn In vitro
4.5.1 Nguyên lý bảo tồn In vitro
Mặc dù bảo tồn ngân hàng gen hạt, ngân hàng gen đồng ruộng trong bảo tồn Ex-situ đang áp dụng rộng rãi nhưng chúng cũng có những hạn chế nhất là đối với các loại cây hạt không chịu với quá trình làm khô, những loài sinh sản sinh dưỡng. Ngân hàng gen đồng ruộng thuận tiện cho đánh giá, sử dụng nhưng thường gặp rủi ro do sâu bệnh, thời tiết bất thuận. Do vậy bảo tồn In vitro là phương pháp bổ sung và thay thế để khắc phục những hạn chế trên. Kỹ thuật In vitro còn có những tiến bộ như có thể kiểm tra sạch bệnh trước khi bảo tồn, có thể bảo tồn số lượng lớn
Một số kỹ thuật In vitro đã được phát triển để bảo tồn các loài cây sinh sản sinh dưỡng và loài cây có hạt kém chịu đựng khi làm khô. Nhìn chung, In vitro áp dụng dưới hai phương thức
- Phương thức làm chậm sinh trưởng, mẫu nguồn gen được giữ dưới dạng mô thực vật vô trùng hoặc cây con trên môi trường dinh dưỡng. Sinh trưởng chậm có thể bảo tồn ngắn, trung hạn và dài hạn
- Đông lạnh, mẫu nuôi cấy được giữ trong ni tơ lỏng, phương thức này ứng dụng cho bảo tồn dài hạn
Theo Lyndsey A. Withers, 1991 mô tả các thành phần của hệ thống bảo tồn In vitro như sau:
Hình 4-14: In vitro trong hệ thống bảo tồn nguồn gen Ex situ
(Nguồn : Lyndsey A. Withers, 1991) 4.5.2 Phân loại bảo tồn In vitro
- Bảo tồn dài hạn:
Bảo tồn dài hạn là bảo tồn trong ni tơ lỏng (-196oC), trên cơ sở ở nhiệt độ này ngừng tất cả các quá trình trao đổi chất và phân chia tế bào. Bảo tồn dài hạn bằng đông lạnh được Latta sử dụng bảo tồn tế bào cà rốt năm 1971 đến nay kỹ thuật đã phát triển với 2 kỹ thuật chủ yếu là (1) Kỹ thuật truyền thống sử dụng 2 bước đông lạnh chậm cộng thêm chất đông lạnh; (2) kỹ thuật đông lạnh mới với đặc điểm là đông lạnh nhanh khoảng 1000oC/phút bằng nhúng trực tiếp vào ni tơ lỏng
Bảo tồn dài hạn là ngân hàng gen In vitro cơ bản. Kỹ thuật chi tiết của phương pháp đã được trình bày trong phần 3.4.
Bảng 4-8 : Kỹ thuật bảo tồn đông lạnh trong ni tơ lỏng -196°C
Các bước Các kỹ thuật
truyền thống Kỹ thuật mới
Làm khô Đông kết đá Bọc /khử nước
Bọc + Xử lý trước đường Sucrose +/- + (+ABA) + Chất đông kết + ++++ Làm khô + +
Đông lạnh chậm + 0°C đến -40°C (0.3 đến 1°C/phút) Đông lạnh nhanh -40°C đến -196°C (200°C/phút) +25°C 196°C đến - (720°C/phút) +25°C đến -196°C (400 đén 1100°C/phút) +25°C đến -196°C (720°C/phút) Làm tan đông lạnh 500°C/phút 120°C/phút 120°C/phút 120°C/Phút
Nguồn : Uragami (1993), Malaurie et al. (1998a).
- Bảo tồn trung hạn
Các điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn chỉ có thể sử dụng bảo tồn trung hạn của các loài sinh trưởng chậm. Điều kiện môi trường và môi trường nuôi cấy có thể giảm sinh trưởng của thực vật khi nuôi cấy mô hoặc tế bào. Điều kiện môi trường áp dụng chung là giảm nhiệt độ đến từ 0 - 5oC và giảm ánh sáng, ngay cả không có ánh sáng sẽ có tác dụng làm chậm sinh trưởng. Cải tiến môi trường nuôi cấy cũng có tác dụng làm chậm sinh trưởng của vật liệu bảo tồn
Bảo tồn trung hạn có thể coi là một ngân hàng gen, gọi là ngân hàng gen In vitro hoạt động. Bảo tồn trung hạn nuôi cấy In vitro dưới điều kiện chậm sinh trưởng và một số kỹ thuật tác động như:
(1) Tác động làm chậm các giai đoạn sinh lý;
(2) Bổ sung thêm tác nhân chậm sinh trưởng vào môi trường; (3) Nhiệt độ thấp;
(4) Nồng độ đường sucrose và vi lượng thấp; (5) Áp suất ô xy thấp;
(6)Bọc trong chất gôm(alginate) có công thức hóa học như là(C6H8O6)n - Bảo tồn ngắn hạn
Bảo tồn ngắn hạn: nuôi cấy In vitro dưới điều kiện sinh trưởng bình thường phù hợp với bảo quản ngắn hạn và phân phối nguồn gen