- Chiều dài đoạn mồi: độ dài tối ưu của một đoạn mồi PCR là 18 – 22 nu. Độ dài này đủ dài để đoạn mồi có tính chuyên biệt cao, đủ ngắn để mồi có thể bám vào khuôn mẫu DNA một cách dễ dàng ở nhiệt độ hồi tính
- Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm): là nhiệt độ mà tại đó một nửa DNA mạch kép bị biến tính và tách ra thành 2 mạch đơn. Đoạn mồi với nhiệt độ từ 52 – 58°C là tối ưu. Nếu nhiệt độ nóng chảy quá cao trên 65C thì mồi sẽ có xu hướng hồi tính thứ cấp. Phần trăm GC của trình tự mồi quyết định Tm của đoạn mồi. Nhiệt độ nóng chảy của cả 2 mồi xuôi và ngược không được chênh lệch quá 5°C.
- Nhiệt độ hồi tính (Ta): nhiệt độ nóng chảy quyết định đến tính ổn định của mạch ghép DNA-DNA và cũng là cơ sở để xác định nhiệt độ hồi tính. Nếu nhiệt độ hồi tính quá cao sẽ làm giảm hiệu suất của sản phẩm khuôn DNA-đoạn mồi. Nếu nhiệt độ quá thấp thì sản phẩm sẽ không chuyên biệt gây ra bởi hiện tượng bắt cặp sai.
Công thức tính nhiệt độ hồi tính:
Ta = 0,3 x Tm(mồi) + 0,7 Tm (sản phẩm) – 14,9 - Phần trăm GC: phần trăm GC thường trong khoảng 40-60%
- Dấu GC: sự có mặt của G và C ở vị trí 5 nucleotide cuối đầu 3’ của mồi giúp hỗ trợ cho việc bám dính chuyên biệt ở đầu 3’ do liên kết mạnh của G và C. Nên tránh nhiều hơn 3 nucleotide G hoặc C ở 5 vị trí cuối ở đầu 3’ của mồi
- Cấu trúc bậc 2 của mồi: sự xuất hiện của cấu trúc bậc 2 do các tương tác nội và ngoại phân tử có thể dẫn đễn hiệu suất PCR giảm. Chúng ảnh hưởng đến việc gắn mồi vào khuôn mẫu và vì vậy cản trở việc khuyếch đại DNA.
+ Cấu trúc hairpin: Được tạo thành bằng tương tác nội phân tử trong đoạn mồi.
+ Tự bắt cặp 2 đoạn mồi (Seft Dimer): được tạo thành bằng tương tác ngoại phân tử giữa 2 đoạn mồi ở vị trí tương đồng của 2 đoạn mồi cùng loại. Thực tế, lượng mồi dùng trong PCR nhiều hơn so với lượng DNA.
+ Bắt cặp chéo (Cross Dimer): tạo thành bởi tương tác ngoại phân tử của 2 đoạn mồi khác loại.
- Lặp đoạn: đoạn lặp là 1 bộ gồm 2 nucleotide xuất hiện nhiều lần trong trình tự, nên tránh các đoạn lặp trong trình tự của đoạn mồi. Ví dụ: ATATATAT… Số lần lặp tối đa có thể chấp nhận được là 2 lần lặp
- Lặp nucleotide: các đoạn mồi với một đoạn dài chỉ chứa một nucleotide nên bị hạn chế vì nó sẽ dẫn đến sự bắt cặp sai của đoạn mồi. Tối đa chỉ khoảng 4 nucleotide
được lặp liên tiếp (https://dnacore.mgh.harvard.edu/cgi-bin/sequencing
/PCR_Primer_Design_Guidelines.htm, ngày 14/06/2014).