3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.4. Phương pháp ELISA kháng thể (Ab-ELISA)ở lợn
Các bước thực hiện Ab-ELISA phát hiện kháng thể ựặc hiệu (kháng kháng nguyên pili F4 Ẹcoli) ở huyết thanh lợn có trình tự như sau:
Thu thập mẫu huyết thanh: đối tượng mẫu bao gồm: (i) Lợn ở thời ựiểm từ sau cai sữa mắc và không mắc tiêu chảy cùng ựàn; (ii) lợn trước cai sữa (21 ngày tuổi); (iii) lợn choai 3 -5 tháng tuổi cùng ựàn lấy mẫu; và (iv) lợn náị
Lập sơ ựồ mẫu theo thiết kế thắ nghiệm: Trên ựĩa ELISA 96 giếng, hai cột 1 và 2 ựược bố trắ các mẫu ựối chứng như sau: A1, A2: đối chứng cơ chất (SC); B1, 2: đối chứng Conjugate (CC); C1, C2 và D1, D2: ựối chứng huyết
thanh dương chuẩn (2 mẫu lặp đC +1 và đC +2); E1, E2 ựến H1, H2: ựối chứng huyết thanh âm chuẩn (8 mẫu). Dãy các giếng từ cột 3 ựến 12 dùng cho 40 mẫu (2 giếng/mẫu) huyết thanh cần xét nghiệm (bảng 03.04).
Bảng 03.04. Sơ ựồ ELISA phát hiện kháng thể F4 ở huyết thanh lợn Các ựối chứng Mẫu huyết thanh xét nghiệm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CC CC B CC CC C đC+1 đC+1 D đC+2 đC+2 E đC -1 đC -5 F đC -2 đC -6 G đC -3 đC -7 H đC -4 đC -8
SC: đối chứng cơ chất; CC: đối chứng conjugate
- Pha huyết thanh1/200: Chuẩn bị ựủ số mẫu huyết thanh pha loãng tại nồng ựộ 1/200 (5 ộl huyết thanh trong 995 ộl PBS-2% skim milk và sắp xếp theo ựúng sơ ựồ mẫu trên khay mẫu 1. Chuẩn bị 2 mẫu huyết thanh ựối chứng dương, và 8 ựối chứng âm ở ựộ pha loãng 1/200 theo cách tương tự.
- Tiến hành phản ứng Ab-ELISA: Tuần tự tiến hành phản ứng theo trình tự các bước tóm tắt ở bảng 03.05.
Bảng 03.05. Thành phần và các bước thực hiện Ab-ELISA
Bước Thành phần Nồng ựộ ộl/giếng ToC T(phút) Lần rửa 1. Phủ ựĩa Kháng nguyên F4 2 ộg/ml 100 37oC 120* 5
2. Bão hoà Sữa tách bơ 6% 200 37oC 60 5
3. Huyết thanh HT chẩn ựoán 1/200 100 37oC 30 5 4. Conjugate Phù hợp Phù hợp 100 37oC 30 5 5. Cơ chất OPD: nước cất: H2O2 1:6000:3 100 Phòng 15 Tối 6. Dừng P. ứng
đọc kết quả
H2SO4
490/630 nm 2M 50
* 120 phút ở 37OC hoặc qua ựêm ở 4 OC.
- đọc kết quả: đọc kết quả trên máy ELx800 ở bước sóng 490/630 nm. Tắnh giá trị ngưỡng (Cut off value) dựa trên trị giá OD của 8 mẫu huyết thanh chuẩn ựối chứng âm theo chương trình phần mềm (ựộ tin cậy 99,9%).
Công thức giá trị ngưỡng: Cut off =
ừ ừ + n SD t Mean 3 α
Trong ựó: Mean: Giá trị OD trung bình của 8 ựối chứng âm, SD: độ lệnh chuẩn tắnh theo quy luật phân phối chuẩn,
n: Bậc tự do (số mẫu ựối chứng âm),
tα: Giá trị trong bảng phân phối Student ở mức ý nghĩa α, n-1 bậc tự dọ Ngưỡng chuẩn là giá trị OD tắnh toán, tại ựó nếu giá trị OD của mẫu bằng hoặc cao hơn ngưỡng ựược coi là dương tắnh huyết thanh học. Ngược lại, mẫu ựược coi là âm tắnh huyết thanh học.