NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU
Bảng 2.1 Trang thiết bị thí nghiệm
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien
Sử dụng bản mỏng 60 F254 (Merck 1,05715) và RP18 F254s (Merck) để phát hiện chất bằng cách chiếu đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm Ngoài ra, có thể sử dụng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, phun đều lên bề mặt bản mỏng, sau đó sấy khô và hơ nóng từ từ cho đến khi xuất hiện màu sắc.
Sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ là Silica gel, bao gồm Silica gel pha thường với kích thước hạt từ 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) và Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC với kích thước 30-50 μm, sản phẩm từ FuJisilisa Chemical Ltd Ngoài ra, nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 cũng được sử dụng, sản xuất bởi Mitsubishi Chem Ind Co., Ltd.
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thường kết hợp các thông số vật lý với các kỹ thuật phổ hiện đại.
2.4.1 Độ quay cực ([] D ) Độ quay cực đƣợc đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
2.4.2 Phổ hối lƣợng ph n giải cao HR-ESI-MS
Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được thực hiện trên máy Agilent Accurate mass 6530 QTOF LC MS tại Viện Hóa sinh biển, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4.3 Phổ cộng hưởng từ nh n (NMR)
Phổ NMR đo trên các máy (chất nội chuẩn là TMS):
+ BRUCKER AVANCE 500 MHz, Viện Hoá học - Viện Hàn lâm
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR): HMBC, HSQC,
Phổ lƣỡng sắc tròn (CD): đƣợc ghi lại bằng máy đo quang phổ Chirascan
(Applied Photophysics, Surrey, UK) của Viện Hóa sinh biển, Viện hàn lâm
Dung môi được sử dụng trong nghiên cứu là CD3OD, và việc lựa chọn dung môi phù hợp phụ thuộc vào tính chất của từng mẫu Nguyên tắc chính là dung môi phải có khả năng hòa tan hoàn toàn mẫu thử để đảm bảo kết quả chính xác.
THỰC NGHIỆM
Để chiết xuất hợp chất từ cây Địa hoàng, phương pháp chiết lỏng-rắn được áp dụng với dung môi methanol có độ phân cực trung bình, giúp khảo sát các hợp chất từ ít đến khá phân cực Nhiệt độ được sử dụng để rút ngắn thời gian chiết và nâng cao hiệu suất Để tách thô các phân đoạn, phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng với dung môi không tan vào nhau được thực hiện, với độ phân cực tăng dần Quá trình làm giàu chất được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng trước khi tiến hành phân tách bằng sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau Đối với hỗn hợp khó tách, silice gel ngược pha (YMC) với chiều dài mạch khác nhau (RP-8 hoặc RP-18) được sử dụng để cải thiện khả năng tách Lưu ý rằng hệ dung môi trên TLC và cột cần phải giống nhau, đồng thời lựa chọn chiều dài và đường kính cột phù hợp với khối lượng chất cần tách và Rf của từng chất trong hỗn hợp.
Loài Rehmannia glutinosa phơi khô (10kg) được chiết xuất bằng methanol (MeOH) qua ba lần, mỗi lần 20 lít, thu được 2,2 kg cặn chiết MeOH Cặn chiết này sau đó được phân bố đều trong 5 lít nước cất và tiến hành chiết phân lớp lần lượt với dichloromethane và ethyl acetate, thu được cặn CH2Cl2 (250 g) và cặn EtOAc.
Phần tan trong nước của mẫu (120 g) được cô quay để loại bớt dung môi, sau đó được xử lý qua cột Dianion với hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần (methanol:nước - 25:75 → 100:0, v:v) Quá trình này thu được 4 phân đoạn: RGW1 (80,2 g), RGW2 (7,1 g), RGW3 (10,6 g) và RGW4 (6,3 g).
Phân đoạn RGW2 nặng 7,1 g đã được tách ra trên cột silica gel pha đảo bằng hệ dung môi methanol và nước theo tỷ lệ 1:2, thu được bốn phân đoạn: RGW2A (1,5 g), RGW2B (1,45 g), RGW2C (1,47 g) và RGW2D (0,8 g) Tiếp theo, phân đoạn RGW2A (1,5 g) được phân tách trên cột silica gel pha thường với dung môi dichloromethane và methanol theo tỷ lệ 3:1, dẫn đến việc thu được hợp chất RG5.
Phân đoạn RGW2B (1,45 g) được tách trên cột silica gel pha thường bằng hệ dung môi ethyl acetate : methanol (8:1, v:v), thu được hợp chất RG3 (18,0 mg) Tiếp theo, sử dụng sắc ký cột silica gel pha thường với dung môi dichloromethane : acetone (1:1, v:v) từ phân đoạn RGW2D (0,8 g), đã thu được hợp chất RG4 (11,0 mg).
Phân đoạn RGW3 (10,6 g) được tách trên cột silica gel pha đảo với hệ dung môi acetone : nước – 1:1, thu được 4 phân đoạn RGW3A (1,2 g), RGW3B (1,5 g), RGW3C (3,2 g) và RGW3D (2,2 g) Phân đoạn RGW3A (1,2 g) được xử lý bằng sắc kí cột silica gel pha thường với dung môi dichloromethane : methanol – 4:1, thu được RG2 (5,0 mg) Tiếp theo, RGW3B (1,5 g) được phân tách bằng sắc kí cột silica gel pha đảo với dung môi acetone : nước – 2:1, tạo ra RG1 (45 mg).
Sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký như cột silica gel pha thường, pha đảo và sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi thích hợp đã giúp phân lập thành công 05 hợp chất từ phân đoạn nước của cây Địa hoàng.
Sơ đồ phân lập loài Rehmannia glutinosa
THÔNG SỐ VẬT LÍ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT
2.6.1 Hợp chất RG1 (hợp chất mới)
HR-ESI-MS m/z: 783.3414 [M + Na] + (Tính toán lý thuyết cho
Dữ liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD và 13 C-NMR: xem Bảng 3.1 trang 24).
2.6.2 Hợp chất RG2 (hợp chất mới)
HR-ESI-MS m/z: 767.3459 [M + Na] + (Tính toán lý thuyết cho
Dữ liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD và 13 C-NMR: xem Bảng 3.2 trang 28).
Chất bột màu trắng, vô định hình.
Công thức phân tử: C 29 H 36 O 15 ; Khối lƣợng phân tử: 624
Dữ liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD và 13 C-NMR: xem Bảng 3.3 trang 35).
Chất bột màu trắng, vô định hình.
Công thức phân tử: C31H40O15; Khối lƣợng phân tử: 652
Dữ liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD, 13 C-NMR: xem Bảng 3.4 trang 41).
Chất bột màu trắng, vô định hình;
Công thức phân tử: C37H50O20; Khối lƣợng phân tử: 814
Dữ liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD, 13 C-NMR: xem Bảng 3.5 trang 46)
2.7 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM α-
Hóa chất: enzym Yeast α-glucosidase; glucopyranoside (pNPG), 4-Nitrophenol (Sigma) [23], [24] p-nitrophenyl-α-D
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu đƣợc thực hiện theo phương pháp của Telagari M và cộng sự (2015) [25] Cụ thể như sau:
Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong dung dịch phosphate buffer 10mM (pH 6.8) Sau đó, 50 µl dung dịch này được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để đạt được nồng độ mong muốn.
20 àl α-glucosidase (0,5 U/ml) và 130àl phosphate buffer 100mM (pH
6.8) đƣợc thêm vào mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37 o C trong 15 phút Nhƣ vậy, nồng độ mẫu thử đạt đƣợc cuối cùng trong giếng là 500-100- 20-4 àg/mL
Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) đƣợc đƣa tiếp vào từng giếng thí nghiệm rồi ủ tiếp ở 37 o C trong 60 phút.
Đĩa thí nghiệm bao gồm mẫu thử, phosphate buffer và pNPG được sử dụng làm đối chứng trắng, trong khi giếng thí nghiệm chỉ chứa DMSO 10%, phosphate buffer, enzyme và pNPG làm đối chứng Thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo độ chính xác.
Dừng thớ nghiệm bằng cỏch thờm vào 80 àl Na2CO3 0,2M và đo OD ở bước sóng 405nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Biotek).
Khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của mẫu thử đƣợc xác định theo công thức sau:
% ức chế = 100% - (A mẫu thử /A đối chứng *100)
Trong đó: A đối chứng = ODđối chứng - ODblank
Giá trị IC 50 (nồng độ ức chế 50%) sẽ đƣợc các định nhờ phần mềm máy tính TableCurve2Dv4.
