NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
MẪU NGHIÊN CỨU
Mẫu Rehmannia glutinosa đã được thu hái tại Việt Trì, Phú Thọ vào ngày 6/03/2020 và được giám định bởi TS Nguyễn Thế Cường từ Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Hiện tại, mẫu tiêu bản đang được lưu giữ tại Viện Hoá sinh biển, cũng thuộc Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Kết quả giám định mẫu có thể xem chi tiết trong phần Phụ lục.
NGUYÊN VẬT LIỆU
Bảng 2.1 Trang thiết bị thí nghiệm
TT Tên trang thiết bị
Mô tả vai trò của thiết bị đối với đề tài
1 Máy siêu âm Viện Hóa sinh biển Chiết xuất, phân lập các hợp chất
2 Máy cất quay chân không
Viện Hóa sinh biển Chiết xuất, phân lập các hợp chất
Viện Hóa sinh biển Chiết xuất, phân lập các hợp chất
4 Đèn UV Viện Hóa sinh biển Chiết xuất, phân lập các hợp chất
5 Cột sắc ký Viện Hóa sinh biển Chiết xuất, phân lập các hợp chất
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và RP18 F254s của Merck Việc phát hiện chất được thực hiện bằng cách sử dụng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc bằng cách phun đều dung dịch H2SO4 10% lên bản mỏng, sau đó sấy khô và hơ nóng từ từ cho đến khi xuất hiện màu.
Sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ Silica gel pha thường và pha đảo, với Silica gel pha thường có kích thước hạt từ 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Đối với pha đảo, Silica gel ODS hoặc YMC có kích thước hạt từ 30-50 μm, được cung cấp bởi FuJisilisa Chemical Ltd Ngoài ra, nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 từ Mitsubishi Chemical Industries cũng được sử dụng trong quá trình này.
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thường kết hợp các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại.
2.4.1 Độ quay cực ([] D ) Độ quay cực đƣợc đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
2.4.2 Phổ hối lƣợng ph n giải cao HR-ESI-MS
Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo bằng máy Agilent Accurate mass 6530 QTOF LC MS tại Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4.3 Phổ cộng hưởng từ nh n (NMR)
Phổ NMR đo trên các máy (chất nội chuẩn là TMS):
+ BRUCKER AVANCE 500 MHz, Viện Hoá học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR): HMBC, HSQC, NOESY
Phổ lƣỡng sắc tròn (CD): đƣợc ghi lại bằng máy đo quang phổ Chirascan (Applied Photophysics, Surrey, UK) của Viện Hóa sinh biển, Viện hàn lâm KH
Dung môi được sử dụng trong quá trình này là CD 3 OD Việc lựa chọn dung môi phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, với nguyên tắc quan trọng là dung môi phải hoàn toàn hòa tan mẫu thử.
THỰC NGHIỆM
Để chiết xuất hợp chất từ cây Địa hoàng, phương pháp chiết lỏng rắn được áp dụng với dung môi methanol có độ phân cực trung bình, giúp khảo sát các hợp chất từ ít đến khá phân cực Nhiệt độ được sử dụng trong quá trình chiết nhằm rút ngắn thời gian và tăng hiệu suất Để tách thô các phân đoạn, phương pháp chiết phân bố lỏng lỏng với dung môi không tan vào nhau được thực hiện, với độ phân cực dung môi tăng dần Quá trình làm giàu chất được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng trước khi tiến hành phân tách bằng sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau Đối với hỗn hợp khó tách, sử dụng silice gel ngược pha (YMC) với chiều dài mạch chất hấp phụ khác nhau (RP-8 hoặc RP-18) là cần thiết Cần lưu ý rằng hệ dung môi trên TLC và trên cột phải giống nhau, cùng với việc lựa chọn chiều dài và đường kính cột phù hợp với khối lượng chất cần tách và Rf của từng chất trong hỗn hợp.
Loài Rehmannia glutinosa phơi khô 10kg được chiết xuất bằng methanol (MeOH) qua 3 lần, mỗi lần sử dụng 20 lít, thu được 2,2 kg cặn chiết Cặn chiết này được hòa tan trong 5 lít nước cất và tiến hành chiết phân lớp với dichloromethane và ethyl acetate, thu được cặn dichloromethane (CH2Cl2) là 250 g và cặn ethyl acetate.
Phần tan trong nước (120 g) được cô quay để loại bớt dung môi, sau đó được xử lý qua cột Dianion với gradient dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần (methanol:nước - 25:75 → 100:0, v:v) Quá trình này thu được 4 phân đoạn: RGW1 (80,2 g), RGW2 (7,1 g), RGW3 (10,6 g) và RGW4 (6,3 g).
Phân đoạn RGW2 (7,1 g) được tách trên cột silica gel pha đảo với dung môi methanol và nước theo tỷ lệ 1:2, thu được 4 phân đoạn: RGW2A (1,5 g), RGW2B (1,45 g), RGW2C (1,47 g) và RGW2D (0,8 g) Tiếp theo, phân đoạn RGW2A (1,5 g) được tách trên cột silica gel pha thường với dung môi dichloromethane và methanol theo tỷ lệ 3:1, dẫn đến việc thu được hợp chất RG5.
Phân đoạn RGW2B (1,45 g) được tách trên cột silica gel với dung môi ethyl acetate : methanol (8:1, v:v), thu được hợp chất RG3 (18,0 mg) Tiếp theo, sử dụng sắc ký cột silica gel với dung môi dichloromethane : acetone (1:1, v:v) từ phân đoạn RGW2D (0,8 g) để thu được hợp chất RG4 (11,0 mg).
Phân đoạn RGW3 (10,6 g) được tách trên cột silica gel pha đảo với dung môi acetone : nước (1:1, v:v), tạo ra 4 phân đoạn: RGW3A (1,2 g), RGW3B (1,5 g), RGW3C (3,2 g) và RGW3D (2,2 g) Phân đoạn RGW3A (1,2 g) được xử lý bằng sắc ký cột silica gel pha thường với dung môi dichloromethane : methanol (4:1, v:v), thu được RG2 (5,0 mg) Tiếp theo, RGW3B (1,5 g) được phân tách qua sắc ký cột silica gel pha đảo với dung môi acetone : nước (2:1, v:v), cho sản phẩm RG1 (45 mg).
Sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo và sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi phù hợp đã giúp phân lập thành công 05 hợp chất từ phân đoạn nước của cây Địa hoàng.
Sơ đồ phân lập loài Rehmannia glutinosa
THÔNG SỐ VẬT LÍ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT
2.6.1 Hợp chất RG1 (hợp chất mới)
HR-ESI-MS m/z: 783.3414 [M + Na] + (Tính toán lý thuyết cho [C36H56O17Na] + , 783.3410)
Dữ liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD và 13 C-NMR: xem Bảng 3.1 trang 24)
2.6.2 Hợp chất RG2 (hợp chất mới)
HR-ESI-MS m/z: 767.3459 [M + Na] + (Tính toán lý thuyết cho [C36H56O16Na] + , 767.3461)
Dữ liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD và 13 C-NMR: xem Bảng 3.2 trang 28)
Chất bột màu trắng, vô định hình
Công thức phân tử: C29H36O15; Khối lƣợng phân tử: 624
Dữ liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD và 13 C-NMR: xem Bảng 3.3 trang 35)
Chất bột màu trắng, vô định hình
Công thức phân tử: C31H40O15; Khối lƣợng phân tử: 652
Dữ liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD, 13 C-NMR: xem Bảng 3.4 trang 41)
Chất bột màu trắng, vô định hình;
Công thức phân tử: C37H50O20; Khối lƣợng phân tử: 814
Dữ liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD, 13 C-NMR: xem Bảng 3.5 trang 46)
2.7 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM α- GLUCOSIDASE
Hóa chất: enzym Yeast α-glucosidase; p-nitrophenyl-α-D glucopyranoside (pNPG), 4-Nitrophenol (Sigma) [23], [24]
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu đƣợc thực hiện theo phương pháp của Telagari M và cộng sự (2015) [25] Cụ thể như sau:
Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong dung dịch phosphate buffer 10mM (pH 6.8) Sau đó, 50 µl dung dịch này được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để đạt được nồng độ phù hợp.
Mỗi giếng được bổ sung 20 µl α-glucosidase (0,5 U/ml) và 130 µl phosphate buffer 100mM (pH 6.8), sau đó trộn đều và ủ ở 37°C trong 15 phút Kết quả là nồng độ mẫu thử cuối cùng trong giếng đạt 500-1000.
Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) đƣợc đƣa tiếp vào từng giếng thí nghiệm rồi ủ tiếp ở 37 o C trong 60 phút
Đĩa thí nghiệm bao gồm mẫu thử, phosphate buffer và pNPG làm đối chứng trắng, trong khi giếng thí nghiệm chứa DMSO 10%, phosphate buffer, enzyme và pNPG làm đối chứng Để đảm bảo tính chính xác, thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Dừng thớ nghiệm bằng cỏch thờm vào 80 àl Na 2 CO3 0,2M và đo OD ở bước sóng 405nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Biotek)
Khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của mẫu thử đƣợc xác định theo công thức sau:
% ức chế = 100% - (A mẫu thử /A đối chứng *100)
Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD blank
Amẫu thử = ODmẫu thử - ODblank mẫu thử
Giá trị IC 50 (nồng độ ức chế 50%) sẽ đƣợc các định nhờ phần mềm máy tính TableCurve2Dv4.
