VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Trường Đại học Mở
Thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3), 68 Lê Thị Trung, Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương.
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.1 Chủng vi khuẩn thử nghiệm
Chủng vi khuẩn Bacillus sp T3 là một loại vi khuẩn nội sinh, được phân lập từ mẫu lá cây cao su tại huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương Mẫu vi khuẩn này được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh thuộc Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3).
Chủng nấm Corynespora cassiicola, gây bệnh trên cây cao su, đã được phân lập tại Thị xã Đồng Xoài, tỉnh Bình Phước Nguồn cung cấp thông tin này đến từ phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh thuộc Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.
THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - MÔI TRƯỜNG
Máy cô quay chân không
Pipet (thủy tinh và pipetman)
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 18
2.3.3 Môi trường – hóa chất – thuốc nhuộm
Nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA)
Cồn 96 o , cồn 70 o , NaCl, HCl, NaOH
Thuốc nhuộm crystal violet, lugol, safanin O, lactophenol
Nguồn nitơ: amoni nitrat (NH 4 NO 3 )
Nguồn muối khoáng: K 2 HPO 4 3H 2 O, MgSO 4 7H 2 O
Nước cất, nước muối sinh lý 0,85%
Các dung môi hữu cơ: acetone, n-hexan, dichloromethane, n-butanol, ethanol, methanol, diethyl ether.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dựa vào mục tiêu đề tài chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ 2.1:
Sơ đồ 2.1 Quy trình toàn bộ thí nghiệm
Tái phân lập Lên men chủng Bacillus sp T3
Tách chiết hợp chất kháng nấm Khảo sát khả năng kháng nấm của dịch chiết
Khảo sát khả năng kháng C cassiicola
Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chất kháng nấm
Phân tích tế bào xâm nhiễm
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 19
2.4.2 Tái phân lập chủng vi sinh vật thử nghiệm
Chủng Bacillus sp T3 được cấy ria trên đĩa môi trường NA và ủ ở 30°C trong 24 giờ để quan sát hình thái đại thể Sau đó, tiến hành thử nghiệm catalase và nhuộm Gram để kiểm tra hình thái vi thể của vi khuẩn.
Sự khác biệt giữa vách tế bào Gram dương và Gram âm ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ thuốc nhuộm, dẫn đến việc phân loại vi khuẩn thành hai nhóm khác nhau (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2003)
Thao tác nhuộm Gram gồm các bước sau:
− Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khô
− Phủ hoàn toàn vết bôi với crystal violet Để yên 1 – 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm dư bằng nước
− Nhỏ dung dịch lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước
− Tẩy cồn 96 o từ 15 – 30 giây, sau đó rửa nước Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin O và để yên trong 1 phút Rửa với nước
− Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100 Đọc kết quả
− Tế bào vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím
− Tế bào vi khuẩn Gram (–) bắt màu hồng
− Vi khuẩn có bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu
Các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy nghi, ngoại trừ Streptococcus spp., đều sở hữu enzym catalase, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do các dẫn xuất độc tính cao của oxy Enzym này đóng vai trò quan trọng trong việc biến đổi năng lượng, khi oxy được sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử, dẫn đến sự hình thành H2O2 Catalase sẽ phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) và oxy (O2).
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 20 ngăn chặn sự tích tụ của các phân tử có độc tính cao này trong tế bào (Trần Linh Thước, 2010)
Nhỏ một giọt H 2 O 2 3% vào phiến kính có sinh khối của vi khuẩn thử nghiệm
Thử nghiệm: (+) có bọt khí do O 2 tạo ra
(–) không có sủi bọt khí
Thử nghiệm đối chứng: (+) Staphylococcus aureus
Hoạt hóa giống: sinh khối Bacillus sp T3 từ ống giữ chủng 20 glycerol đƣợc cấy vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường NB Ủ 37 o C trong 18 giờ
Để nhân giống vi khuẩn, cần bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn sau khi hoạt hóa vào 100ml môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng vi khuẩn, bao gồm các thành phần: glucose (19,49 g/L), NH4NO3 (6,35 g/L), MgSO4 (0,76 g/L) và K2HPO4 (6,33 g/L) (Nguyễn Văn Minh và cs., 2014) Quá trình nuôi cấy được thực hiện bằng cách lắc ở tốc độ 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 30°C trong thời gian 54 giờ.
Để tối ưu hóa quá trình lên men, cần bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn nhân giống cấp 2 vào môi trường phù hợp với chủng vi khuẩn Quá trình lên men được thực hiện trong nồi lên men Bioflo 110 trong 54 giờ, với tốc độ cánh khuấy 200 vòng/phút, độ hòa tan oxy (DO) đạt 100%, pH duy trì ở mức 7 và nhiệt độ được kiểm soát chặt chẽ.
30 o C) Thể tích lên men: 3L (Shrivastava và cs., 2013)
2.4.4 Xác định hoạt tính chất kháng nấm Bacillus sp T3 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
Khả năng kháng nấm của chủng Bacillus sp T3 được xác định bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Ingroff và cs., 1995; Kumar và cs., 2009)
Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm
Sau quá trình lên men (mục 2.4.3) tiến hành ly tâm dịch khuẩn ở 13 000 vòng/ phút trong 10 phút Tiếp theo, dịch nổi đƣợc lọc qua màng lọc 0,45 μm (Shrivastava và cs., 2013)
Dịch lọc cần đƣợc sử dụng trong vòng 15 phút
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 21
Chuẩn bị nấm Corynespora cassiicola thử nghiệm
Nấm được cấy trên môi trường PDA ủ ở 30 o C trong 72 giờ
Bổ sung một ít nước muối 0,85% có chứa 0,05% Tween 80 vào ống nấm, dùng que cấy cạo nhẹ trên mặt khóm nấm để nhận bào tử
Điều chỉnh mật độ bào tử đạt 1 x 10 6 CFU/ mL bằng cách điều chỉnh OD
Dịch nấm đã chuẩn bị cần đƣợc sử dụng trong vòng 15 phút
Để thực hiện quy trình, bạn cần nhúng que bông vào dịch nấm đã chuẩn bị, sau đó ép que vào thành ống để ráo nước Tiếp theo, trải đều que bông lên mặt thạch và lặp lại quy trình này ba lần, mỗi lần xoay đĩa 60 độ.
Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng
Dịch vi khuẩn đƣợc nhỏ vào trong lỗ khoảng 70 μL
Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch
Ủ 4 – 5 ngày ở 28 o C rồi xem kết quả vòng kháng nấm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp lại Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0
Vi khuẩn có khả năng kháng nấm khi xung quanh lỗ có vòng kháng nấm
Ghi nhận kết quả đạt đƣợc
Hình 2.1 Kết quả kháng nấm của vi khuẩn
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 22
2.4.5 Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến hợp chất kháng nấm
Dựa trên nhiệt độ sôi của các dung môi và nhiệt độ bảo quản chất kháng nấm, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình cô quay đến hoạt tính của chất kháng nấm được sản xuất từ Bacillus sp T3.
Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm
Sau thời gian lên men tiến hành ly tâm ở 13 000 vòng/ phút trong 10 phút thu dịch nổi, lọc qua màng lọc 0,45 μm (Shrivastava và cs., 2013)
Dịch lọc đƣợc chia nhỏ trong các ống nghiệm phục vụ cho các nghiệm thức thí nghiệm
Chuẩn bị nấm Corynespora cassiicola thử nghiệm: (tương tự mục 2.4.4)
D ng que bông vô tr ng nhúng vào dịch nấm đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch
Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng
Dịch vi khuẩn đƣợc đun cách thủy với 6 mức nhiệt độ: 4 o C, 37 o C, 55 o C,
60 o C, 70 o C, 95 o C trong khoảng 2 giờ và 4 giờ
Dịch khuẩn sau khi đung cách thủy đƣợc nhỏ vào trong lỗ khoảng 70 μL
Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch
Ủ 4 – 5 ngày ở 28 o C rồi xem kết quả vòng kháng nấm
Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 5 lần Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0
Dịch vi khuẩn còn có khả năng kháng nấm khi xung quanh lỗ có vòng kháng nấm tức không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và ngược lại
Ghi nhận kết quả đạt đƣợc
2.4.6 Tách chiết hợp chất kháng nấm
Chúng tôi tiến hành tách chiết các hợp chất kháng nấm dựa trên phương pháp của Sihem và cs, 2011
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 23
Môi trường chuẩn bị nuôi cấy vi khuẩn thử nghiệm
Chủng vi khuẩn được cấy vào môi trường tối ưu hóa tương ứng (glucose: 19,49 g/L, NH 4 NO 3 : 6,35 g/L, MgSO 4 : 0,76 g/L, K 2 HPO 4 : 6,33 g/L) Nuôi cấy lắc
Chuẩn bị nấm C cassiicola thử nghiệm
Cấy nấm trên môi trường thạch PDA ủ ở 30 o C trong 72 giờ
Cho vào ống nấm một ít nước muối 0,85% có chứa 0,05% Tween 80, dùng que cấy cạo nhẹ trên mặt khóm nấm để lấy bào tử
Đo OD 530 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng từ 0,08 – 0,12 tương đương với mật độ bào tử là 1 x 10 6 CFU/ mL
Nấm đã chuẩn bị cần đƣợc sử dụng trong vòng 15 phút
Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo sơ đồ:
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 24
Sơ đồ 2.2 Quy trình tách chiết chất kháng nấm
− Dịch khuẩn thử nghiệm đã đƣợc chuẩn bị sau khi lên men tiến hành ly tâm loại bỏ sinh khối (8000 vòng/ 20 phút) và lọc qua màng lọc 0,45 μm
− Dịch nổi sau khi lọc đƣợc bổ sung với dung môi theo tỷ lệ 1:2, V:V,
Đối với một số dung môi như n-hexan, n-butanol, dichloromethane và diethyl ether, cần thực hiện quá trình lóng mẫu để tách nước khỏi dung dịch Dung dịch được lắc đều trong bình lóng và để yên cho đến khi hai pha dung môi và nước đạt trạng thái cân bằng, thu được dung môi cùng với các thành phần kháng nấm có trong đó.
Bổ sung dung môi (tỷ lệ: 1:2; V:V)
Thử nghiệm đối kháng (bổ sung 2ml Methanol)
Acetone Diethyl ether n-butanol Dichloromethane
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 25
− Cô quay chân không phần dung môi thu đƣợc Nhiệt độ cô quay phụ thuộc vào nhiệt độ sôi của dung môi
− Sau khi đuổi hết dung môi bổ sung 2ml methanol vào chất kháng nấm thô thu đƣợc
− D ng que bông vô tr ng nhúng vào dịch nấm đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch
− Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng
− Chất kháng nấm nhỏ vào trong lỗ khoảng 70 μL
− Để yên khoảng 15 phút cho dịch khuếch tán vào lớp thạch
− Ủ 4 – 5 ngày ở 28 o C rồi xem kết quả vòng kháng nấm
− Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 5 lần Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0
Chất kháng tách đƣợc có khả năng kháng nấm khi xung quanh lỗ có vòng kháng nấm và ngƣợc lại
Ghi nhận kết quả đạt đƣợc
Tạo môi trường mô phỏng tự nhiên cho nấm bệnh tương tác trực tiếp với lá cây cao su nhằm khảo sát khả năng gây bệnh của nấm C cassiicola và khả năng kháng bệnh của vi khuẩn Bacillus sp T3.
Để chuẩn bị môi trường ẩm độ trong phòng thí nghiệm, hãy sử dụng hộp nhựa có chứa bông thấm đã được làm ẩm bằng nước cất ở đáy Sau đó, đặt một lớp thanh chữ U lên trên để đảm bảo lá không tiếp xúc trực tiếp với bông ướt.
Chuẩn bị dịch kháng nấm và nấm thử nghiệm
− Dịch kháng nấm sau khi tách chiết bằng dung môi đƣợc chỉnh pH = 7
Để thu thập bào tử từ khóm lấm, cho vào ống nấm một ít nước muối 0,85% có chứa 0,05% Tween 80 Sử dụng que cấy để cạo nhẹ và lấy bào tử, sau đó đo độ hấp thụ quang tại 530 nm (OD 530 nm) và điều chỉnh sao cho đạt khoảng 0,08 – 0,12, tương đương với mật độ tế bào 1 x 10^6 CFU/mL.
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 26
Chuẩn bị lá cao su thử nghiệm
− Giống cao su đƣợc sử dụng là giống Lai hoa 90952 và IAN 873, chọn lá 10 – 15 ngày tuổi, không bị nhiễm bệnh
− Lau sạch bằng bông và bông thấm cồn 70 o
Sau khi rửa sạch, ngâm lá trong dung dịch sodium benzoate để chống mốc trong 30 giây, sau đó rửa lại ba lần bằng nước cất Tiếp theo, thấm khô lá và xếp chúng vào hộp nhựa đã chuẩn bị sẵn.
− 20 μL dịch bào tử nấm đƣợc nhỏ lên hai bên gân chính của lá, mỗi bên 2 giọt
− Theo dõi mẫu lá ở nhiệt độ phòng
Sau 6 ngày gây nhiễm, chúng tôi đã phun 200 μL dịch kháng nấm được chiết xuất bằng dung môi hiệu quả nhất và tiến hành quan sát vào ngày thứ 7 và thứ 9 Để làm đối chứng âm, mẫu lá được phun 200 μL nước muối 0,85% có chứa 0,05% Tween 80.
− Đánh giá cấp bệnh theo phương pháp đã được mô tả ở bảng 2.1 và hình 2.2 (Nguyễn Anh Nghĩa và cs, 2008)
− Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 10 lần lặp lại Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0
Bảng 2.1 Cấp độ bệnh trên lá gây nhiễm tách rời Cấp bệnh Hiện tƣợng quan sát đƣợc
Cấp 1 Vết bệnh nhỏ màu sẫm xuất hiện ngay dưới vết bệnh
Cấp 2 Vết bệnh có màu nâu, có viền màu vàng hoặc nâu, vết nhỏ to ra nhƣng chƣa lan đến gân lá
Cấp 3 Vết bệnh lớn, nhìn thấy rõ và lan đến gân lá làm chuyển gân lá thành những đường gân màu nâu hoặc đen
Cấp 4 Vết bệnh lớn hơn, vết bệnh nhìn thấy to rõ và xuất hiện sợi nấm xung quanh vết chủng
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 27
Hình 2.2 Cấp độ bệnh trên lá gây nhiễm tách rời
− Nấm bệnh phát triển trên lá tách rời, xác định cấp độ bệnh
− Dịch kháng tách chiết có khả năng tiêu diệt nấm bệnh Ghi nhân kết quả
2.4.8 Phân tích tế bào xâm nhiễm bởi nấm Corynespora cassiicola
Các mẫu lá sau khi gây nhiễm đƣợc thực hiện phân tích tế bào xâm nhiễm theo phương pháp của Purwantara và cs, 1987
− Mẫu lá sau khi gây nhiễm nấm bệnh đƣợc cắt thành lát nhỏ khoảng 0,5-1,0 cm ở các khoảng thời gian: sau 2 ngày, 4 ngày và 7 ngày gây nhiễm
− Sử dụng hỗn hợp acid lactic/phenol/glycerol/nước cất/ethanol theo tỷ lệ 1:1:1:1:8
Hỗn hợp này sẽ làm mất màu diệp lục của lá, sau đó đun cho đến khi lá chuyển sang màu trắng và tiếp tục đưa qua nước cất Mẫu lá được chuẩn bị sẽ được quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 10X và 40X để đánh giá mức độ xâm nhiễm.
Ghi nhận kết quả xâm nhiễm dựa trên hình ảnh quan sát đƣợc
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 28
2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu trong bài báo cáo đƣợc thống kê bởi phần mềm Microsoft Excel
SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƯƠNG 29
