Thử nghiệm hiệu quả chủng vi khuẩn lactic có đồng thời hoạt tính probiotic và giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm nghiên cứu khoa học

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

 Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh- Trường Đại học Mở TPHCM

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào nhóm vi khuẩn lactic acid bacteria (LAB) được phân lập và sàng lọc khả năng giảm cholesterol từ hệ vi sinh vật đa dạng, bao gồm mẫu sữa mẹ, phân su trẻ sơ sinh và thực phẩm lên men.

2.2.2 Các chủng vi khuẩn thử nghiệm

Các chủng vi khuẩn đƣợc cung cấp từ Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Trường Đại học Mở Tp.HCM

Trong nghiên cứu, 39 chủng vi khuẩn đã được phân lập và sàng lọc khả năng giảm cholesterol từ hệ vi sinh vật đa dạng Các chủng vi khuẩn bao gồm E12.1, E15.1, E8.1, E16.1, E16.2, E3.1, S21.2, S1.12, S3.2, S29.2, S17.1, S23.2, S15.1, S3.1, SC2.1, S28.1, NT1.5, CM3.6.1, DC3.3, BT1, NH2, BT2, CM2.6, DC1.2, NT1.7.2, MC1.3, KC2.1, DC3.6.1, CM3.5.2, VK1, VN2.2, CM1.2, NT1.7.1, YK1.1, CM1.3, CM2.7, CM3.3, NH1, và MC1.5.

Mã khác: Thực phẩm lên men

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 23

 Môi trường BHI (Brain heart infusion)

 Môi trường TSA ( Tryptone soy agar)

 Môi trường NA (Nutrient agar)

 Môi trường MHB (Mueller Hinton broth)

 Môi trường HHD (Homofermentative-heterofermentative differential medium)

 Môi trường thủy phân arginine

 Môi trường lên men carbonhydrate

 Cồn tuyệt đối, cồn 96 0 , cồn 70 0 , H 2 O 2 , NaCl, H 2 SO 4 , NaOH, ethanol 100%

 Thang 1 kb (Fermentas, Đức), Ladder, # SM0311/2/3

 Agarose, loading dye, TAE buffer, ethium bromide, nước cất 2 lần

 Thuốc nhuộm Crystal violet, lugol, saranin O

 Bộ kit tách chiết DNA EZ – 10 Spin Column Genomic DNA Minipreps (BIOLINE)

 Bộ kit PCR MyFi TM Mix (BIO BASIC CANADA INC

 Nước cất, nước muối sinh lý 0,85 %, H 2 O 2 , NaCl, H 2 SO 4 , NaOH, ethanol 100%

 Dung dịch đệm Natri Phosphate 0,1M, pH 7

 Dung dịch đệm Natri Phosphate 0,1M, pH 6

 Dung dịch đệm Citrate 0,5M, pH 5,5

 Thuốc thử tricloroacetic acid (TCA)

 Hóa chất: cồn, NaCl, NaOH, HCl…

Micropipet và đầu tip tương ứng, que cấy, đèn cồn, tăm bông vô trùng Đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm, eppendorf, becher, que cấy trang,…

 Máy đo mật độ quang

SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM

Sơ đồ thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu của đề tài được thực hiện theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm

Chúng tôi tiến hành tái phân lập và định danh sơ bộ bằng phương pháp nhuộm gram

Tiến hành làm thuần các chủng thử nghiệm bằng phương pháp cấy ria trên môi trường MRSA

2.3.2 Sàng lọc các chủng có khả năng hấp thu cholesterol của tế bào vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy (Rudel’.L L., Morris M.D.,1973)

Cholesterol tự do và cholesterol từ phản ứng xà phòng hóa được chiết xuất bằng n-hexan và sau đó phân tán trong acid glacial acetic Khi tiếp xúc với tác nhân oxy hóa o-phthalaldehyde ở nồng độ 0,5 mg/mL, cholesterol chuyển hóa thành dẫn xuất oxycholesterol Dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc, dẫn xuất này mất nước, tạo ra sản phẩm có nhiều nối đôi liên hợp và mang màu hồng tím.

Dung dịch cholesterol được nhũ tương hóa trong cồn tuyệt đối có nồng độ 0,1g/

10 mL Sau đú pha loóng cholesterol cú nồng độ 100 àg/ mL

Bảng 2.1 Xây dựng đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ cholesterol và giá trị OD 550 Ống 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

MRS (mL) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Nồng độ cuối (àg/ àl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

 Môi trường MRS bổ sung 0,3% muối mật

 Dung dịch cholesterol đƣợc khử trùng (0,1g/10mL trong ethanol) đƣợc thêm vào môi trường trên để đạt nồng độ cuối cùng là 100 μg/mL

 Cho 1% dịch khuẩn đã đƣợc hoạt hóa trong 24h ở 37 o C, 5% CO 2 vào môi trường

 Ly tâm loại sinh khối trong 10.000 vòng /phút trong 10 phút ở 4 o C

Để định lượng cholesterol theo phương pháp của L.L Rudel và M.D Moris, đầu tiên, mỗi mL dịch còn lại được thêm vào 1mL KOH (33%) và 2mL ethanol 95%, sau đó trộn đều trong 1 phút và đặt vào bể ổn nhiệt ở 60°C trong 15 phút Sau khi làm nguội, bổ sung 3mL hexane và trộn đều Tiếp theo, thêm 2mL nước cất, trộn trong 1 phút và để yên trong 15 phút Hút 1mL lớp hexane vào ống nghiệm và làm bay hơi bằng áp suất thấp Phần còn lại được hòa tan trong 2mL o-phthalaldehyde (0,5mg/mL) hòa tan trong acid glacial acetic, trộn và để yên 10 phút, sau đó thêm 0,5mL H2SO4 và trộn trong 1 phút Cuối cùng, đo độ hấp thu ở bước sóng 550nm sau 10-90 phút.

 Thí nghiệm đƣợc lặp lại và đƣợc xử lý bằng thống kê ANOVA một yếu tố

2.3.3 Sàng lọc chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme BSH (Tanaka H và cs, 1999; Luis Noriega và cs, 2005)

2.3.3.1 Định tính khả năng sinh emzyme BSH của các chủng Lactic phân lập[22]

 Chủng vi khuẩn đƣợc hoạt hóa 24h, ở 37 0 C, 5% CO 2 Pha loãng đến nồng độ

 Môi trường MRS có bổ sung 0,5% (w/v) muối natri taurocholate.

 Môi trường đối chứng MRS

 Dùng giấy lọc chuyên biệt tẩm vi khuẩn đặt trên các đĩa thạch( hoặc có thể đục lỗ thạch)

Sự hiện diện của acid mật có hiện tƣợng kết tủa xung quanh vòng vi khuẩn

2.3.3.2 Xác định hoạt độ của enzyme BSH của các chủng lactic phân lập

Phương pháp định lượng glycine/taurine bằng phản ứng với ninhydrin[4]

2.3.3.2.1 Phương pháp định lượng glycine/taurine bằng phản ứng ninhydrin (Nguyễn

Dung dịch chứa acid amin và peptide khi được đun nóng với ninhydrin sẽ tạo ra màu xanh hoặc tím Phản ứng này xảy ra khi acid α-amin và peptide bị phân hủy thành amoniac, khí CO2 và aldehyde Trong môi trường có amoniac, ninhydrin ở dạng khử kết hợp với một phân tử ninhydrin khác, tạo ra sản phẩm ngưng kết có màu xanh hoặc tím đặc trưng.

Bản chất của phương pháp là định lượng phần amoniac được hình thành từ acid amin, do đó phản ứng đồng nhất với hấu hết các loại acid amin

Phương pháp này rất nhạy nhưng thiếu tính chọn lọc, dẫn đến kết quả bị nhiễu khi có sự hiện diện của amoniac và protein Tuy nhiên, nhược điểm này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng glycerol làm môi trường phản ứng.

 Dung dịch ninhyrin 1% (w/v) pha trong đệm citrate 0,5M (pH 5,5)

 Dung dịch đệm citrate 0,5 M (pH 5,5)

 Pha thuốc thử ninhydrin: 0,5 mL dung dịch ninhydrin 1% + 1,2 mL glycerol 30% + 0,2 mL đệm citrate Bảo quản ở 2-8 o C

Bảng 2.2 Xây dựng đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ taurine và giá trị OD 570 Ống 0 1 2 3 4 5 6

 Lấy 50 àL mẫu cần định lƣợng, thờm 950 àL thuốc thử ninhydrin Trộn đều Đun trong 14 phút ở 100 o C

 Làm lạnh dưới vòi nước, đo độ hấp thu ở bước sóng 570 nm

2.3.3.2.2 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford (Nguyễn Văn Mùi, 2001)

Dựa trên sự tao thành phức hợp giữa protein và Coomassie Brilliant Blue G-

Thuốc thử này có ba dạng: cation (màu nâu đỏ), trung tính (màu xanh lá), và anion (màu xanh dương) Trong môi trường acid, cation màu nâu đỏ hấp thu cực đại ở bước sóng khoảng 465 nm, và khi liên kết với protein, nó tạo ra phức hợp màu xanh với sự dịch chuyển bước sóng rõ rệt.

Bước sóng tối ưu để đo độ hấp thu phức hợp là 595nm, mặc dù có thể đo ở khoảng 575-615nm Sự chuyển đổi màu của phức hợp liên quan đến sự hiện diện của các acid amin cơ bản như arginine, lysine và histidine trong protein Các liên kết Van de Waals và kỵ nước cũng đóng vai trò quan trọng trong việc liên kết giữa protein và thuốc thử Số lượng cầu nối giữa Coomassie và mỗi phân tử protein phụ thuộc vào số điện tích dương trên protein Các acid amin tự do, peptide và protein có phân tử lượng thấp không tạo màu với Coomassie.

Thuốc thử: dung dịch Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G-250) 0,01%:

100 mg CBB G-250, 50 mL ethanol 95%, 100 mL H 3 PO 4 85% dẫn nước đến 1 lít Bảo quản thuốc thử ở 2-8 o C

Bảng 2.3 Xây dựng đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ

Albumin và giá trị OD 595 Ống 0 1 2 3 4 5

Dung dịch BSA 0,1 mg/ mL (mL) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Nồng độ BSA (àg/mL) 0 10 20 30 40 50

 Hút 0,2 mL mẫu, cho tiếp 1mL thuốc thử Bradford, lắc đều và để ổn định màu trong 5 phút

 Tiến hành song song mẫu đối chứng với nước cất

 Đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595nm

2.3.3.2.3 Xác định hoạt độ của enzyme BSH (Nguyễn Minh Thái và cs., 2012; Liong

M T và cs.,2005; Luis Norriega và cs.,2005)

 Tăng sinh chủng vi khuẩn trong 5 mL môi trường MRS

 Cấy 1% dịch vi khuẩn trên vào 10 mL môi trường MRS Nuôi cấy kị khí trong

 Ly tâm 10000 vòng trong 10 phút ở 4 o C

 Rửa tế bào bằng cách phân tán lại trong NaCl 0,9% Vortex kĩ, ly tâm 10000 vòng trong 10 phút ở 4 o C

 Chỉnh OD 600 =1 bằng đệm phosphate 0,1M pH 6.8 (xác định tỉ lệ thích hợp giữa huyền dịch vi khuẩn và dung dịch đệm)

 Thêm tiếp dung dịch DTT 0,1M vào trong mẫu để đạt nồng độ DTT cuối cùng trong mẫu là 10mM, ủ trong đá để mẫu đạt nhiệt độ 0-5 o C

 Tán siêu âm 6 lần duy trì nhiệt độ không đổi, mỗi lần 30 giây Trước các lần tán siêu âm, mẫu phải đạt nhiệt độ 0-5 o C

 Lấy khoảng 10 μL nhuộm đơn và quan sát trên kính hiển vi để theo dõi hiệu quả phá vỡ tế bào

 Mẫu sau khi tán siêu âm có thể giữ ở -20 o C

 Ly tâm 10000 vòng ở 4 o C trong 10 phút Thu nước nổi (dịch phá vỡ tế bào chứa enzym)

 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

Giai đoạn 2: Phản ứng của enzyme xúc tác

 Hỗn hợp phản ứng: 25 àL dịch chứa enzym + 450 àL đệm phosphat 0,1M pH 6 + 25 àL muối mật 0,3% Ủ ở 37 o C trong 30 phỳt

 Ống chứng phộp thử định lượng acid amin: thờm trước 500 àL TCA 20%

 Dừng phản ứng bằng cỏch thờm 500 àL TCA 20% Ly tõm 10000 vũng trong

 Thu dịch nổi định lƣợng acid amin

Thí nghiệm được lặp lại và phân tích bằng phương pháp ANOVA một yếu tố Quá trình phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm được thực hiện theo các giai đoạn, và dịch nổi thu được được định lượng acid amin thông qua phản ứng với thuốc thử ninhydrin.

Lượng protein toàn phần được định lượng bằng phương pháp Bradford

Tính toán hoạt độ chung và hoạt độ riêng theo công thức:

⁄ Trong đó: 40: là thể tích của enzyme phản ứng (mL)

30: thời gian enzyme phản ứng (phút)

2.3.4 Thử khả năng sinh enzym ngoại bào (Nguyễn Lân Dũng, 1983)

Chúng tôi tiến hành thử nghiệm các enzym ngoại bào nhƣ: amylase, caseinase, lipase và gelatinase

Một số vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzym gelatinase ngoại bào, giúp thủy phân gelatin thành polypeptide và acid amin Để xác định khả năng làm tan gelatin của vi khuẩn, ta sử dụng tricloroacetic acid (TCA) 25% để gây tủa protein gelatin trong môi trường nuôi cấy Nếu vi khuẩn tiết ra gelatinase, sẽ xuất hiện vòng trong quanh khóm vi khuẩn (phản ứng dương tính), ngược lại, nếu không có sự phân giải gelatin, khu vực xung quanh sẽ đục (phản ứng âm tính).

Khả năng phân giải gelatin được kiểm tra bằng môi trường NA có bổ sung 1% gelatin và 1% đường glucose Mẫu vi khuẩn được cấy chấm và ủ ở 37°C trong 24 giờ với 5% CO2 Sau đó, mẫu tiếp tục được ủ ở 37°C trong 48 giờ với 5% CO2, và kết quả được đọc sau khi nhỏ TCA 25% vào mẫu.

SVTH: PHẠM THỊ MINH TRANG 32 phút Nếu vi khuẩn tạo vòng trong khuẩn lạc, điều đó cho thấy chúng có khả năng phân giải gelatin Ngược lại, nếu không có vòng, chủng vi khuẩn này không có khả năng phân giải gelatin.

Casein là một loại protein có trong sữa, không thể thẩm thấu qua màng tế bào vi khuẩn Trước khi vi khuẩn có thể sử dụng casein làm nguồn carbon và năng lượng, protein này cần được phân giải thành các amino acid Để thực hiện điều này, vi khuẩn phải tiết ra enzym proteolytic nhằm phân hủy casein thành các amino acid, từ đó cho phép chúng dễ dàng chuyển vào bên trong tế bào.

Khi sữa được trộn vào môi trường thạch dinh dưỡng, casein trong sữa làm cho môi trường trở nên trắng đục Sau quá trình ủ, vi khuẩn tiết ra enzym protease, như caseinase, tạo ra vùng phân giải xung quanh khuẩn lạc trong trường hợp phản ứng dương tính Ngược lại, nếu phản ứng âm tính, môi trường xung quanh khóm vi khuẩn vẫn giữ nguyên độ đục.

Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường NA có bổ sung 5% sữa gầy Vi khuẩn đã được cấy chấm và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 48 giờ với 5% CO2 Sau hai ngày nuôi cấy, khả năng phân giải casein của vi khuẩn được quan sát và đánh giá.

Một số vi khuẩn có khả năng sản sinh enzym lipase, giúp phân giải dầu thực vật và các hợp chất béo khác Trong thí nghiệm về lipase, môi trường nuôi cấy được bổ sung CaCl2 và Tween 80 Nếu vi khuẩn tiết ra enzym lipase, enzym này sẽ thủy phân Tween 80.

Dưới tác động của ion Ca2+, 80 tạo ra các acid béo tự do, dẫn đến sự hình thành tủa calcium oleate Hiện tượng này tạo ra một vùng mờ đục xung quanh và phía dưới khuẩn lạc.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

TÁI PHÂN LẬP

39 chủng sau khi chúng tôi nhuộm gram cấy lên môi trường MRSA khả năng sống sót tốt và thuần cao

Hình 3.1 Vi khuẩn trên môi trường MRSA

SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG GIẢM

3.2.1 Thử nghiệm khả năng giảm cholesterol trong môi trường nuôi cấy

3.2.1.1 Xây dựng đồ thị đường chuẩn

Kết quả định lượng cholesterol trong môi trường MRS cho thấy nồng độ cholesterol tăng dần từ 10 đến 100 µg/mL, thể hiện giá trị tương quan rõ ràng trong các kết quả thu được.

OD 550 đƣợc trình bày ở bảng 3.1 và đồ thị 3.1:

Bảng 3.1.Tương quan giữa nồng độ cholesterol (àg/mL)và giỏ trị OD 550 Ống 0 1 2 3 4 5

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 46 Đồ thị 3.1 Sự tương quan tuyến tớnh giữa nồng độ cholesterol (àg/mL) và giỏ trị

OD 550 Đồ thị có phương trình đường chuẩn là: yT4,1x + 0,683 Và đồ thị có hệ số tương quan R 2 =0,994

3.2.1.2 Khả năng giảm cholesterol trong môi trường MRS

Sau khi khảo sát khả năng chịu mật của các chủng thử nghiệm chúng tôi tiến hành thử khả năng giảm cholesterol của 39 chủng trên

Dựa vào phương trình đường chuẩn yT4,1x + 0,683, chúng ta có thể xác định lượng cholesterol còn lại trong môi trường Từ đó, khả năng giảm cholesterol của từng chủng được tính toán một cách chính xác.

Kết quả đƣợc thể hiện qua bảng 3.2

Bảng 3.2 Khả năng giảm cholesterol sau 24 giờ và 48 giờ

STT Tên chủng Mật độ ban đầu (OD 625 )

Dựa trên phương trình đường chuẩn y = 544,12x + 0,6832, chúng ta có thể xác định khả năng giảm cholesterol của từng chủng vi khuẩn Kết quả được trình bày chi tiết qua bảng và đồ thị đi kèm.

SVTH: Phạm Thị Minh Trang, 51 Đồ thị 3.2 và 3.3 thể hiện khả năng giảm cholesterol trong môi trường của các chủng thử nghiệm.

Nồn g đ ô ch olest er ol (% )

Khảo sát ở 24 giờ Khảo sát ở 48 giờ

Nồn g đ ộ ch olest er ol (% )

Khảo sát ở 24 giờ Khảo sát ở 48 giờ

Chúng tôi đã quyết định bổ sung muối mật với nồng độ 0,3% để tối ưu hóa khả năng giảm cholesterol trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật Muối mật, với vai trò là chất nhũ hóa tự nhiên, giúp cholesterol phân tán hiệu quả hơn, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn hấp thu tốt hơn.

Từ 39 chủng tái phân lập tiến hành sàng lọc khả năng giảm cholesterol trong phòng thí nghiệm Kết quả cho thấy tất cả 39 chủng đều có khả năng giảm cholesterol trong môi trường nuôi cấy thông thường MRS bổ sung cholesterol Khi khảo sát ở 24 giờ có:

 24 chủng có khả năng giảm cholesterol trên 50%

 13 chủng có khả năng giảm cholesterol từ 20 – 50%

 2 chủng có khả năng giảm cholesterol từ thấp hơn 20%

Khả năng giảm cholesterol của các chủng vi khuẩn được khảo sát cho thấy hiệu quả cao hơn ở thời gian 24 giờ so với 48 giờ Thời gian nuôi cấy dài hơn dẫn đến sự gia tăng acid, làm giảm pH môi trường, từ đó ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic Kết quả cho thấy rằng khả năng giảm cholesterol tối ưu đạt được ở 24 giờ So với nghiên cứu của M.T Liong và N.P Shah (2005), trong đó các chủng giảm cholesterol từ 3.76 đến 34.69 µg/mL sau 20 giờ, các chủng trong nghiên cứu này cho kết quả giảm cholesterol từ 44.182 đến 79.548 µg/mL sau 24 giờ, chứng tỏ rằng các chủng khảo sát có hoạt tính giảm cholesterol vượt trội hơn.

Khi nuôi các chủng trong 48 giờ, lượng cholesterol giảm cho thấy rằng việc nuôi dài hạn dẫn đến sự gia tăng acid, từ đó ức chế chính bản thân các chủng này.

3.2.2 Định tính khả năng sinh enzyme BSH

Sau khi khảo sát sự nhạy cảm của 39 chủng vi sinh vật trong môi trường có muối mật liên hợp, chúng tôi đã tiến hành định tính khả năng sinh enzyme BSH của các chủng này Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme BSH của cca1 chủng vi khuẩn

STT Tên chủng Định tính enzyme BSH STT Tên chủng Định tính enzyme BSH

Theo bảng cho thấy từ 39 chủng tiến hành định tính khả năng sinh enzyme BSH cho thấy có 25 chủng cho kết quả tạo vòng xung quanh khuẩn lạc

Thí nghiệm của M du Toit cùng cộng sự (1998) khảo sát định tính enzyme BSH bằng cách sử dụng môi trường MRS bổ sung muối taurodeoxycholic acid

(TDCA) và 0,37 g/l CaCl2 Kết quả trong số 297 chủng Lactobacillus spp có 191 chủng cho kết quả dương tính, với lượng kết tủa khác nhau về kích thước Trong đó có

3 chủng BFE 1058, BFE 1059 và BFE 1061 hiển thị vùng kết tủa lớn nhất đƣợc lựa chọn

Thí nghiệm của Luis Noriega và cộng sự (2005) khảo sát hoạt động thủy phân muối mật của các chủng Bifidobacteria Thu đƣợc kết quả tất cả các chủng

Bifidobacteria tăng trưởng tốt trong môi trường bổ sung muối mật liên hợp 0,5%, nhƣng không có chủng nào trong số chúng cho thấy khử liên hợp muối GC

Muối mật TDC (taurodeoxycholate) và GDC (glycodeoxycholate) cho kết quả định tính BSH dương tính với hầu hết các chủng vi khuẩn, ngoại trừ chủng B animalis IPLA 658, không phát triển trong bất kỳ loại muối mật nào Vì vậy, TDC và GDC đã được chọn để thử nghiệm nhằm xác định hoạt tính enzyme BSH.

Một số hình ảnh của thí nghiệm

Hình 3.2 Khả năng sinh enzyme BSH 3.2.3 Xác định hoạt tính enzyme BSH

3.2.3.1 Xây dựng đồ thị chuẩn Định lƣợng acid amin bằng thuốc thử ninhydrin

Kết quả định lượng taurine bằng thuốc thử ninhydrin cho thấy nồng độ taurine tăng dần từ 0,02 đến 0,12 mM, với giá trị tương quan thể hiện qua kết quả OD 570, như được trình bày trong bảng 3.4.

Bảng 3.4 Giá trị tương quan giữa nồng độ taurine (mM) và giá trị OD 570 Ống 1 2 3 4 5 6

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 56 Đồ thị 3.4 Đường tương quan tuyến tính giữa nồng độ taurine (mM) và giá trị

OD 570 Đồ thị có phương trình đường chuẩn là: y=0,144x + 0,017 Và phương trình có hệ số tương quan R 2 =0,994

3.2.3.2 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford cho thấy nồng độ protein tăng dần từ 10 đến 50 µg/mL, với giá trị tương quan rõ ràng thể hiện qua các kết quả thu được.

OD 595 đƣợc trình bày ở bảng 3.5 và biểu đồ 3.4:

Bảng 3.5.Mối quan hệ giữa nồng độ BSA (àg/0,2mL) và giỏ trị OD 595 Ống 0 1 2 3 4 5

Nồng độ BSA (àg/mL) 0 10 20 30 40 50

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 57 Đồ thị 3.5 Đường tương quan tuyến tớnh giữa nồng độ BSA (àg/0,2mL) và giỏ trị

OD 595 Đồ thị có phương trình đường chuẩn là: y= 332.3x – 0.811 và phương trình có hệ số tương quan là R2=0,993

3.2.4 Kết quả xác định hoạt độ chung và hoạt độ riêng enzyme BSH của các chủng khảo sát

Kết quả thí nghiệm về định lượng taurine và protein, cũng như hoạt độ chung và riêng của enzyme BSH ở các chủng khảo sát, được trình bày chi tiết trong bảng 3.6.

Bảng 3.6 Kết quả hoạt đô chung (U/mL) và hoạt độ riêng (U/mg) của các chủng vi khuẩn

STT Tên chủng Nồng độ acid amin (mM)

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 61 Đồ thị 3.6 Biểu diễn hoạt độ chung (U/mL) và hoạt độ riêng (U/mg) của các chủng vi khuẩn

Từ 25 chủng có khả năng sinh enzyme BSH chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ chung và hoạt độ riêng của enzyme BSH đối với từng chủng Kết quả hoạt độ chung của các chủng dao động trong khoảng 0,042 – 0,092 U/mL Hoạt độ riêng cho kết quả khá cao dao động khoảng 1,324 – 5,061 U/mL

Nghiên cứu của Liong và cộng sự (2005) cho thấy hoạt tính chung của enzyme dao động từ 0,031 đến 0,062 U/mL, trong khi hoạt tính riêng nằm trong khoảng 1,05-1,93 U/mg Các chủng vi khuẩn khác nhau thể hiện mức độ hoạt động enzyme BSH khác nhau khi sử dụng muối natri glycocholate và natri taurocholate, với L acidophylus có hoạt tính chung cao hơn so với L casei Đặc biệt, hầu hết các chủng cho thấy hoạt tính mạnh hơn với muối natri glycocholate, ngoại trừ L acidophilus ATCC 4356 Khi sử dụng hỗn hợp muối mật glycocholic, glycochenodeoxycholic, taurocholic, taurochenodeoxycholic và taurodeoxycholic acid, tất cả các chủng đều biểu hiện hoạt động BSH cao nhất, đạt từ 1,6 đến 1,99 U/mL.

Nghiên cứu của Nguyễn Minh Thái và cộng sự (2012) cho kết quả hoạt độ chung (0,028-0,106 U/mL) hoạt độ riêng trong khoảng 0,086-0,738 U/mg

N T1.5 N T1.7.2 NH2 C M2 6 C M3 5.2 K C 2.1 V N 2.2 VK1 B T2 Y K 1.1 MC1 5 MC1 3 NH1 SC 2.1 D C 3.6.1 S3.2 S1 5.1 S21.2 S28.1 S29.2 E3.1 E8.1 E12.1 E16.1 E16.2

Hoạt độ chung Hoat độ riêng

Từ 39 chủng sàng lọc khả năng giảm cholesterol trong phòng thí nghiệm

SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC CAO

3.3.1 Khả năng sinh enzyme ngoại bào

Khả năng sinh enzym ngoại bào là một yếu tố quan trọng trong quy trình tuyển chọn probiotic Do đó, chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng này trên tất cả các chủng (Mai Đàm Linh và cs, 2008; Christine M K & cs, 2009).

Khả năng sinh enzym ngoại bào đƣợc trình bày ở bảng 3.7

Bảng 3.7 Khả năng sinh enzym ngoại bào

Các thử nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần Kết quả đƣợc trình bày:

Từ 39 chủng thử nghiệm chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào cho thấy hầu hết các chủng không có khả năng sinh enzyme ngoại bào, có 1 chủng sinh 3 enzym (S1.12), 1 chủng sinh 2 enzym (S29.2) và các chủng còn lại sinh 1 enzym hoặc không sinh enzym nào Tất cả các chủng thử nghiệm đều không có khả năng sinh enzym lipase và amylase

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy kết quả tương tự như Dương Nhật Linh và cộng sự (2009), với 53 chủng thử nghiệm, hầu hết ít khả năng sinh enzym ngoại bào; chỉ có 3 chủng sinh ra 4 enzym, 2 chủng sinh 3 enzym, 17 chủng sinh 2 enzym, và số còn lại chỉ sinh 1 hoặc không sinh enzym nào Đồng thời, nghiên cứu của Mai Đàm Linh và cộng sự (2008) chỉ ra rằng tất cả 10 chủng vi khuẩn thử nghiệm đều có khả năng sinh ra 2 enzym caseinase và gelatinase.

Hình 3.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào

Trong các tiêu chí tuyển chọn các chủng làm probiotic, một trong những hoạt tính tiêu biểu của probiotic là khả năng kháng khuẩn

Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn với tác nhân bệnh là bước quan trọng trong quá trình tuyển chọn probiotic Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật có khả năng kháng khuẩn cao là tiêu chí cần thiết để đảm bảo ứng dụng hiệu quả của probiotic (Christine M K & cs, 2009).

Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh đƣợc trình bày ở bảng 3.8

Bảng 3.8 Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh (mm)

Ký hiệu chủng Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh (mm)

S au re u s B c ere u s S trepβ grou p A P ae ru gin osa S parat yph i A S alm on ell a typhi L.mon oc ytoge n es

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 67 Để có thể ứng dụng tốt, chúng tôi chọn tiêu chí theo hai trường hợp như sau:

 Đối kháng tối thiểu 3 vi khuẩn gây bệnh trở lên

Nghiên cứu này yêu cầu khả năng đối kháng tối thiểu với hai loại vi khuẩn gây bệnh và sinh ra ít nhất hai trong bốn enzym Các thử nghiệm được thực hiện ba lần và được phân tích thống kê bằng phương pháp Anova một yếu tố thông qua phần mềm Excel Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình (mm) ± phương sai.

Từ 39 chủng vi khuẩn lactic chúng tôi tiến hành thử nghiệm sinh enzyme ngoại bào và hoạt tính kháng khuẩn

Với tiêu chí trên chúng tôi chọn lọc đƣợc 10 chủng (gồm các chủng:

NT1.5,CM1.2,BT1,YK1.1,KC2.1,BT2,S21.2,E12.1,E16.2, S29.2) để tiến hành những sàng lọc tiếp theo.

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đối với 7 loại vi khuẩn chỉ thị thường gặp trong hệ tiêu hóa và liên quan đến các bệnh ngộ độc thực phẩm, bao gồm S aureus, B cereus và Strepβ.

Group A, P aeruginosa, S.paratyphi A, Salmonella typhi, L.monocytogenes

Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng đối kháng với 8 vi khuẩn chủng chỉ thị thường có trong hệ tiêu hóa và liên quan đến các bệnh ngộ độc thực phẩm.

Trong 39 chủng thử nghiệm có 4 chủng NT1.5, E12.1, BT1, BT2 có khả năng ức chế hoặc kìm hãm 4/8 chủng vi khuẩn gây bệnh, 4 chủng S21.2, KC2.1, CM1.2, E16.2, YK1.1 có khả năng kháng lại 3 vi khuẩn gây bệnh Đa số các chủng (87,17%) có khả năng kháng lại L monocytogenes Đối với S aureus và Streptococcus tiêu huyết β đa số các chủng không có khả năng kháng Chỉ có 1 chủng KC2.1 kháng với S eureus (8,5 mm), 3 chủng NT1.5, CM1.2, S15.1 có khả năng kháng với Streptococcus tiêu huyết β

4 chủng ức chế B cereus (8 – 10,83 mm), 8 chủng ức chế P aeruginosa (9,33- 13,67 mm), 12 chủng ức chế S paratyphi A (9,33 – 10,67 mm), 6 chủng kháng S typhi A (9 – 11 mm)

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với một số nghiên cứu trước đó, chẳng hạn như mức độ kháng với S typhi (11mm) được ghi nhận bởi Hoàng Quốc Khánh và Phạm Thị Lan Thanh (2011), trong khi phần lớn các chủng không thể hiện khả năng kháng.

Streptococcus faecalis và đa số các chủng thử nghiệm ức chế L monocytogenes của

Một số nghiên cứu cho thấy rằng LAB có khả năng ức chế Streptococcus faecalis, nhưng mức độ hiệu quả vẫn còn hạn chế Cụ thể, nghiên cứu của Coolborn A F (2005) ghi nhận sự đối kháng yếu (0-2 mm) với Streptococcus faecalis, tương tự như các nghiên cứu của Trần Vân Khánh (2007) và Sieladie D V cùng cộng sự (2011) Điều này chỉ ra rằng khả năng kháng của LAB đối với nhóm vi khuẩn Streptococcus này không cao.

Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn S.typhi, L monocytogenes 3.3.3 Khả năng chịu muối mật

Trong hệ tiêu hóa, vi khuẩn tiếp xúc với acid và muối mật, điều này ảnh hưởng đến khả năng probiotic của chúng Chúng tôi đã chọn 10 chủng vi khuẩn NT1.5, CM1.2, BT1, YK1.1, KC2.1, BT2, S21.2, E12.1, E16.2, S29.2 để thử nghiệm khả năng chịu muối mật ở nồng độ 0,3% Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.9.

Bảng 3.9 Kết quả thử khả năng chịu muối mật 0,3%

STT Mã chủng thử nghiệm

Môi trường nuôi cấy Môi trường MRS Môi trường MRS

OD 625 sau 8 giờ pH OD 625 sau 8 giờ pH

Đồ thị 3.7 minh họa khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn Ở thời điểm 0 giờ, pH của môi trường MRS là 6,69, trong khi pH của môi trường MRS có 0,3% muối mật là 6,73 Các giá trị E16.2 được ghi nhận là 0,799±0,002 và 0,665±0,022, tương ứng với các chỉ số 5,04 và 5,15.

Kết quả xử lý thống kê ANOVA một yếu tố về khả năng chịu muối mật của các chủng thử nghiệm

Các nghiên cứu sơ bộ đã xác định mức độ chịu mật của một số dòng

Lactobacillus và mật bò thường được áp dụng trong môi trường chọn lọc vi khuẩn đường ruột ở người do hiệu quả tương tự như muối mật tự nhiên của con người, với nồng độ trung bình khoảng 0,3% (Matijašić B.B., Rogelj I., 2000).

Nghiên cứu của A A Al-Saleh, A A M Metwalli, Abu-Tarboush (2006) và M.T Liong, N.P Shah (2005) đã khảo sát khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn bằng cách thử nghiệm sự phát triển trong môi trường MRS và môi trường MRS có bổ sung 0,3% muối mật Khả năng chịu muối mật được xác định thông qua việc đo mật độ quang, và nếu giá trị mật độ quang tăng lên 0,3 đơn vị, chủng vi khuẩn được ghi nhận là có khả năng chịu muối mật Kết quả cho thấy tất cả các chủng đều có khả năng chịu muối mật.

Nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh (2011) đã chỉ ra rằng tất cả 15 chủng Lactobacillus được thử nghiệm đều có khả năng sinh trưởng ở nồng độ mật 0,3%, cho thấy tiềm năng probiotic từ con người Bên cạnh đó, nghiên cứu của Nguyễn Thị Diễm Hương và Đỗ Thị Bích Thủy (2012) cũng đã thu được các chủng Lactobacillus có giá trị tương tự.

Lactobacillus fermentum DC1 phân lập từ sản phẩm dƣa cải huế có khả năng phát chịu đƣợc mật bò ở nồng độ 0,3%

TÓM TẮT KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỒNG THỜI HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ KHẢ NĂNG GIẢM CHOLESTEROL CỦA 39 CHỦNG THỬ NGHIỆM

Kết quả sàng lọc đồng thời hoạt tính probiotic và khả năng giảm cholesterol của

10 chủng đƣợc trình bày nhƣ bảng sau:

Bảng 3.1 Bảng tóm tắt kết quả sàng lọc đồng thời hoạt tính probiotic và khả năng giảm cholesterol của 10 chủng vi khuẩn

Tiêu chí Probiotic Sàng lọc khả năng giảm cholesterol

Chịu pH dạ dày pH 2 sau 2 giờ

Khả năng giảm cholesterol trong môi trường (%) Định tính khả năng sinh enzym BSH

Theo bảng 3.1, ba chủng NT1.5, YK1.1 và E16.2 không chỉ đáp ứng tiêu chí probiotic cao mà còn có khả năng giảm cholesterol trong môi trường vượt quá 50%, đồng thời thể hiện hoạt độ chung và hoạt độ riêng cao nhất Chúng tôi đã tiến hành định danh cho ba chủng này.

ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

3.5.1 Tách chiết, PCR và tinh sạch sản phẩm 16S rDNA

Các chủng vi khuẩn được tách chiết DNA bằng kit EZ – 10 Spin Column Genomic DNA Minipreps Sau đó, PCR được thực hiện để khuếch đại đoạn 16S rDNA bằng MyFi TM Mix, và kết quả được phân tích qua điện di trên gel agarose như thể hiện trong hình 3.5.

Hình 3.7 Kết quả điện di sau phản ứng PCR

4, 5, 10, 11: NT1.5, E16.2, YK1.1 có kích thước >1000bp

Hình 3.5 minh họa rằng cả 4 chủng được tách chiết và thực hiện phản ứng PCR đều cho sản phẩm có kích thước tương đương (trên 1000Kb) Sản phẩm khuếch đại 16S rDNA đã được gửi đến công ty Việt Á để tinh sạch trước khi tiến hành giải trình tự.

3.5.2 Kết quả giải trình tự và dựng cây phát sinh loài:

 Trình tự các mẫu sau hiệu chỉnh

Hình 3.8 Trình tự của chủng NT1.5 sau khi hiệu ch nh

Hình 3.9 Trình tự của chủng E16.2 sau khi hiệu ch nh

Hình 3.10 Trình tự của chủng YK1.1 sau khi hiệu ch nh

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 83 Đoạn 16S rDNA sau hiệu chỉnh và được so sánh trên GenBank

Bảng 3.13 Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA đã hiệu ch nh với các trình tự trên GenBank

Loài tương đồng nhất trên Genbank

 Cây phả hệ phân tử

Hình 3.11 Cây phả hệ phân tử của 3 chủng định danh

Chúng tôi thực hiện phân tích kết quả thông qua việc kết hợp phả hệ phân tử, truy vấn trình tự tương đồng trên GenBank, và tham khảo kết quả định danh sơ bộ bằng phương pháp sinh hóa cho các mẫu phân tích.

Mẫu NT1.5 và E16.2 đã được phân nhóm dựa trên trình tự tham khảo của Lactobacillus plantarum KLDS (FJ861114.1) cho NT1.5 và Lactobacillus plantarum KDLLL1-1 (KC755090.1) cho E16.2 Kết quả phân nhóm của NT1.5 được xác lập qua cây Maximum Likelihood, cho thấy sự phân thành đơn nhóm rõ rệt với Lactobacillus plantarum KLDS (FJ861114.1) với bootstrap đạt 100% Đối với E16.2, cây phả hệ phân tử cũng cho thấy sự phân thành đơn nhóm với Lactobacillus plantarum.

WCFS1(NR_075041.1), Lactobacillus plantarum K-46 (KC430920.1) bootstrap đạt

SVTH: PHẠM THỊ MINH TRANG cho thấy mẫu NT1.5 và E16.2 có độ tương đồng lớn hơn 90% với GenBank trên NCBI, cụ thể là với loài Lactobacillus plantarum Điều này chứng tỏ rằng hai mẫu này rất gần gũi hoặc có thể chính xác là Lactobacillus plantarum.

Mẫu YK1.1 được phân nhóm dựa trên trình tự tham khảo của L paracasei 37171 (KC755091.1) và L casei (KC456366.1) Kết quả phân nhóm cho thấy YK1.1 có sự liên kết chặt chẽ với L paracasei, được xác lập thông qua cây Maximum Likelihood.

IR65 (KC108659.1), Lactobacillus paracasei 3C (DQ523484.1) và L Casei ATCC

Mẫu 334 (NR_075032.1) thể hiện rõ ràng với bootstrap đạt 100% Theo nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh và cộng sự (2011), cây phả hệ phân tử cho thấy mẫu B5 và B17 phân thành đơn nhánh với L casei và L paracasei, từ đó tác giả kết luận rằng hai mẫu này thuộc về L paracasei/casei.

Theo nghiên cứu của Theo “The Prokaryotes” (2006), L casei và L paracasei thuộc cùng một nhóm và có trình tự gen tương đồng cao Do đó, chúng tôi kết luận rằng YK1.1 có thể là L paracasei hoặc L casei.

KẾT QUẢ XÂY DỰNG MÔ HÌNH TĂNG CHOLESTEROL TRÊN CHUỘT

Bảng 3.14 Kết quả khả năng tăng cholesterol giữa các nghiệm thức

Ch số cholesterol trung bình (mmol/L)

Lô 1 (Nước muối sinh lý

Lô 4 ( Chế độ ăn theo thành phần)

Lô 5( Chế độ ăn 10%kem giàu cholesterol)

Trong nghiên cứu, các trị số trong cùng một cột không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan Ở lô đối chứng âm, chỉ số cholesterol của chuột sau 14 ngày thí nghiệm không tăng và vẫn ổn định Ngược lại, lô 3 với liều tiêm 600mg/kg cho thấy khả năng tăng cholesterol gấp 6 lần so với lô đối chứng, với sự khác biệt có ý nghĩa Lô 2 tiêm 250mg/kg và lô 5 cho ăn chế độ bổ sung 10% kem đều có khả năng tăng cholesterol gấp 4 lần so với lô đối chứng, nhưng không có sự khác biệt giữa hai lô này Lô 4 với chế độ ăn có khả năng tăng cholesterol so với lô đối chứng cũng cho kết quả khác biệt có ý nghĩa, nhưng mức tăng thấp nhất trong các lô thí nghiệm.

Theo nghiên cứu của Luiz Carlos Bertges và cộng sự (2011), việc sử dụng tyloxabol với liều 250mg/kg đã ghi nhận khả năng làm tăng chỉ số cholesterol trên chuột trong vòng 72 giờ Ngoài ra, nghiên cứu của Huỳnh Ngọc Trinh và cộng sự (2008) cho thấy chế độ ăn chứa 1% cholesterol, 0.2% taurocholate và 5% mỡ có hiệu quả làm tăng 60% mức cholesterol tổng thể ở chuột thí nghiệm.

Bốn lô thí nghiệm đều cho thấy khả năng gây tăng cholesterol thành công trên chuột Tuy nhiên, trong bối cảnh xã hội hiện nay, khi con người thường xuyên lười vận động và chế độ dinh dưỡng không hợp lý là nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng tăng cholesterol, chúng tôi đã quyết định áp dụng phương pháp sử dụng probiotic Các chủng vi khuẩn này sẽ tồn tại trong ruột và giúp giảm cholesterol thừa từ thực phẩm Do đó, chúng tôi lựa chọn mô hình gây tăng cholesterol thông qua chế độ ăn giàu cholesterol để tiến hành thử nghiệm hiệu quả giảm cholesterol tiếp theo.

So sánh hai nghiệm thức với chế độ ăn khác nhau cho thấy nghiệm thức ở lô 5 mang lại hiệu quả tăng cholesterol tốt hơn lô 4, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Do đó, chúng tôi quyết định chọn nghiệm thức ở lô 5 làm mô hình phù hợp cho thí nghiệm tiếp theo.

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tiêu đề	Thử Nghiệm Hiệu Quả Chủng Vi Khuẩn Lactic Có Đồng Thời Hoạt Tính Probiotic Và Giảm Cholesterol Trên Mô Hình Chuột Thí Nghiệm
Tác giả	Phạm Thị Minh Trang, Nguyễn Thị Linh Giang, Lê Thị Anh Thiện, Phạm Trần Phương Dung
Người hướng dẫn	ThS. Dương Nhật Linh
Trường học	Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học
Năm xuất bản	2013
Thành phố	TP. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	123
Dung lượng	3,86 MB