Tổng quan tài liệu
Tình hình nghiên cứu
1.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Methanotrophs là vi khuẩn tự nhiên có khả năng sử dụng methane Năm 1906, Sohngen đã phân lập thành công loại vi khuẩn này từ nước ao và thực vật thủy sinh, đánh dấu bước đầu trong nghiên cứu về chúng.
Vào năm 1970, Whittenbury và cộng sự đã phân lập hơn 100 chủng vi sinh vật oxi hóa methane hiếu khí từ đất, đánh dấu sự khởi đầu của một kỷ nguyên mới trong nghiên cứu đặc tính sinh hóa Đến nay, các vi sinh vật này đã được phát hiện trong nhiều môi trường khác nhau, bao gồm nước biển (Holmes và cs., 1995), trầm tích (Smith và cs., 1997), nước ngầm (Fliermans và cs., 1988), bãi chôn lấp (Wise và cs., 1999) và mỏ than bùn (Dedysh và cs.).
2000), … cho thấy quá trình oxi hóa methane diễn ra ở nhiều nơi
Hầu hết các vi khuẩn oxi hóa metan (MOB) phát triển tốt trong môi trường có pH từ 6 đến 7 và nhiệt độ trung bình khoảng 25ºC, theo nghiên cứu của Hanson (1996) Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây đã phát hiện nhiều chủng MOB như Methylococcus capsulatus và Methylococcus thermophilus có khả năng chịu đựng môi trường khắc nghiệt, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực này.
Methylococcus ucrainicus, Methylocaldum szegediense và Methylocaldum tepidum có khả năng phát triển ở nhiệt độ 50ºC (Malashenko và cộng sự, 1975) Các chủng vi khuẩn psychrophilic được phân lập từ lãnh nguyên Siberian và vùng Nam Cực có thể chịu đựng nhiệt độ thấp nhất khoảng 3.5ºC (Omelchenko và cộng sự, 1993; Bowman và cộng sự, 1997).
Skrede và cs (1998) đã ứng dụng sinh khối MOB, bao gồm các chủng Methylococcus capsulatus, Bacillus brevis, và Bacillus firmus, để sản xuất thức ăn trong chăn nuôi Sản phẩm này có thành phần hóa học và chất dinh dưỡng tương tự như bột cám và đậu nành.
Kalyuzhnaya và cs (2015) đã nghiên cứu việc sản xuất methanol, một chất lỏng có giá trị, được sử dụng làm nhiên liệu trực tiếp hoặc chuyển đổi thành các sản phẩm khác như olefin và xăng dầu thông qua quá trình chuyển hóa, tiêu thụ CH4 của MOB.
Dayéri Dianou và cs (1997) đã phân lập được 20 chủng MOB từ bùn lúa có khả năng oxi hóa methane cao nhất là 96% và thấp nhất là 23%
Zofia Stępniewska và cs (2017) đã phân lập được các chủng vi khuẩn
Methylomonas sp từ bộ cây cói có khả năng oxi hóa CH4 từ 0.463 ± 0.067 đến 5.928 ± 0.169 μmol/L CH4/ml/ngày, tương đương giảm 70% CH4 sau 6 ngày nuôi ủ
1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước:
Hiện nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào về vi khuẩn oxi hóa methane MOB được công bố ở Việt Nam.
Tổng quan về hiệu ứng nhà kính
1.2.1 Hiệu ứng nhà kính
Hiệu ứng nhà kính là hiện tượng xảy ra khi năng lượng bức xạ từ ánh sáng mặt trời đi qua các cửa sổ hoặc mái nhà bằng kính, sau đó được hấp thụ và phân tán lại thành nhiệt lượng, làm ấm toàn bộ không gian bên trong, không chỉ ở những khu vực có ánh sáng chiếu vào (Trịnh Văn Anh và cs, 2011).
Hiệu ứng nhà kính xảy ra khi khí quyển hấp thụ tia cực tím từ mặt trời, giữ lại hơi nóng tại tầng đối lưu Hiện tượng này tạo ra hiệu ứng nhà kính trên bề mặt các hành tinh và vệ tinh, tương tự như một nhà kính thực sự dùng để trồng cây Tuy nhiên, khác với nhà kính thông thường, nhà kính tự nhiên không có cơ cấu riêng biệt để giữ nhiệt, dẫn đến sự gia tăng nhiệt độ trên Trái Đất (Trịnh Văn Anh và cs, 2011).
1.2.2 Nguyên nhân gây hiệu ứng nhà kính
Có nhiều khí gây hiệu ứng nhà kính như CO2, CH4, CFC, SO2 và hơi nước Khi ánh sáng mặt trời chiếu vào Trái Đất, một phần được hấp thu và một phần phản xạ vào không gian Các khí nhà kính giữ lại nhiệt từ mặt trời, ngăn không cho nó thoát ra ngoài Nếu nồng độ khí nhà kính vừa phải, chúng giúp duy trì nhiệt độ Trái Đất ở mức thích hợp Tuy nhiên, nếu quá nhiều khí nhà kính tồn tại trong khí quyển, Trái Đất sẽ bị nóng lên.
Khí nhà kính hình thành từ nhiều nguyên nhân, bao gồm hoạt động của con người như trồng lúa, chăn nuôi, chặt phá rừng, và khai thác Sự phát triển nhanh chóng của các ngành công nghiệp dẫn đến việc xây dựng nhiều nhà máy, thải ra môi trường lượng lớn khí CO2 Ngoài ra, các chất hữu cơ trong bãi rác phân hủy và chất thải từ gia súc, gia cầm cũng tạo ra khí CH4 Quá trình đốt chất thải rắn và nhiên liệu trong công nghiệp cũng như hoạt động sản xuất nông nghiệp phát thải khí N2O (IPPC, 2007).
1.2.3 Hậu quả do hiệu ứng nhà kính
Việc gia tăng nồng độ khí nhà kính đang gây ra hiệu ứng nhà kính, dẫn đến sự nóng lên toàn cầu và thay đổi khí hậu trong các thập kỷ tới Hiệu ứng nhà kính làm cho Trái Đất ấm lên, gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng cho môi trường và cuộc sống của con người (Nguyễn Văn Thắng và cs, 2010).
Chất lượng và số lượng nước uống, nước sinh hoạt, nước tưới tiêu và nước cho nuôi trồng đang bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi sự biến đổi của lượng mưa và sự gia tăng khí bốc hơi Mưa gia tăng có thể dẫn đến tình trạng lũ lụt thường xuyên hơn, trong khi biến đổi khí hậu có thể làm đầy các lòng chảo nối với sông ngòi trên toàn cầu (Trịnh Văn Anh và cs, 2011; Nguyễn Văn Thắng và cs, 2010).
Sự nóng lên toàn cầu đang làm thay đổi điều kiện sống của các sinh vật trên Trái Đất Những loài có khả năng thích nghi với điều kiện mới sẽ phát triển thuận lợi, trong khi nhiều loài khác lại bị thu hẹp diện tích sống hoặc thậm chí bị tiêu diệt.
Sự xuất hiện của nhiều bệnh mới và sự lan tràn của các loại dịch bệnh đang làm suy giảm sức khỏe con người Nhiệt độ cao kéo dài có thể dẫn đến gia tăng số người tử vong, trong khi sự thay đổi về lượng mưa và nhiệt độ có thể làm trầm trọng thêm tình hình các bệnh truyền nhiễm.
Nhiệt độ cao hơn tạo điều kiện cho nạn cháy rừng dễ xảy ra hơn (Trịnh Văn Anh và cs, 2011; Nguyễn Văn Thắng và cs, 2010)
1.2.3.5 Năng lượng và vận chuyển
Nhiệt độ ấm hơn dẫn đến tăng nhu cầu làm lạnh và giảm nhu cầu làm nóng Mùa đông sẽ chứng kiến ít sự hư hại do vận chuyển hơn, nhưng vận chuyển đường thủy có thể bị ảnh hưởng bởi số trận lụt gia tăng hoặc sự giảm mực nước sông Hơn nữa, nếu nhiệt độ của quả đất tiếp tục tăng, điều này có thể làm tan nhanh băng tuyết ở Bắc Cực và Nam Cực.
7 mực nước biển sẽ tăng quá cao, có thể dẫn đến nạn hồng thủy (Trịnh Văn Anh và cs, 2011; Nguyễn Văn Thắng và cs, 2010)
Bảng 1.1 Tiềm năng nóng lên toàn cầu của một số khí nhà kính so với khí CO 2
Khí Ký hiệu Tuổi thọ
Tiềm năng nóng lên toàn cầu theo mặt bằng thời gian
Nguồn: Báo cáo đánh giá lần 3 của IPPC, 2001
1.2.4 Tình hình phát thải methane
Methane (CH4) là hydrocacbon đơn giản nhất trong dãy đồng đẳng ankan, tồn tại dưới dạng khí không màu, không vị và dễ cháy Ở điều kiện tiêu chuẩn, methane hóa lỏng ở −162°C và hóa rắn ở −183°C, với khối lượng 1 mét khối khoảng 717g Mặc dù methane chiếm tỷ lệ phát thải thấp hơn CO2, nhưng nó có khả năng giữ nhiệt cao gấp 25 lần so với CO2 và đang gia tăng trong khí quyển với tốc độ 0,6% mỗi năm Methane được hình thành trong quá trình chế biến dầu mỏ và chưng cất khí than đá, và có nhiều ứng dụng quan trọng như nguyên liệu sản xuất hydro, methanol, axit axetic và anhydrit axetic Khi đốt cháy 1 mol methane có mặt oxy, sẽ sinh ra 1 mol CO2 và 2 mol H2O.
Methane là một chất gây ngạt, có khả năng chiếm chỗ oxy trong không khí ở điều kiện bình thường Nguy cơ ngạt hơi xảy ra khi nồng độ oxy giảm xuống dưới 18% Mặc dù methane nguyên chất không có mùi, nhưng trong ngành công nghiệp, nó thường được trộn với một số chất khác để dễ dàng phát hiện.
8 lượng nhỏ các hợp chất lưu huỳnh có mùi mạnh như etyl mecaptan để dễ phát hiện trong trường hợp rò rỉ
Khí metan (CH4) đã được phát hiện trong tầng khí quyển từ những năm 1940 và có khả năng hấp thu mạnh năng lượng của tia hồng ngoại Hiện nay, lượng CH4 trong khí quyển đang gia tăng, với hàm lượng khoảng 1,7 ppm.V ở Bắc bán cầu và 1,6 ppm.V ở Nam bán cầu, tăng trung bình 18 ppb.V/năm (tương đương 1,1%) CH4 là một trong những khí nhà kính đóng góp lớn vào việc mất cân bằng bức xạ và gây ra hiện tượng biến đổi khí hậu toàn cầu Tính đến năm 2000, tổng lượng khí CH4 phát thải ở Việt Nam đạt 316.412.000 tấn, trong đó lượng phát thải từ sản xuất nông nghiệp chiếm 238.375.000 tấn Lượng CH4 trong khí quyển đã tăng từ 0,700 ppmV vào năm 1750 lên 1,774 ppmV vào năm 2005.
Sự gia tăng nồng độ CH4 trong khí quyển chủ yếu do các nguồn thải tăng cao, trong khi khả năng hấp thu và phân hủy CH4 lại có giới hạn (Khalil và Rusmussen, 1985) Thông tin chi tiết về lượng phát thải CH4 từ các nguồn khác được trình bày trong bảng 2.1 (Bouwman, 1990).
Bảng 1.2 Nguồn phát thải CH 4
Nguồn Lượng CH4 (10 12 g CH4/năm) Đồng lúa 60 – 140 Đất ướt 40 – 160
Bãi rác thải 30 – 70 Đại dương, mặt nước khác 15 – 35 Động vật nhai lại 66 – 99
Khai thác khí thiên nhiên 30-40
Khai thác than 35 Đốt sinh khối 55 – 100
Các quá trình phân giải chất hữu cơ trong điều kiện kỵ khí đều dẫn đến hình thành
CO2 và CH4 Tỷ lệ giữa CO2 và CH4 phụ thuộc vào mức độ oxy hóa các chất hữu cơ ban đầu
❖ Sự sản sinh CH 4 từ gia súc
Gia súc là nguồn chính phát thải khí CH4 ở nhiều quốc gia do số lượng lớn và tỷ lệ thải khí cao, đặc biệt nhờ hệ tiêu hóa đặc trưng của động vật nhai lại Khí CH4 được sinh ra từ quá trình phân hủy thức ăn bởi vi sinh vật trong đường ruột Mức độ phát thải CH4 phụ thuộc vào hình thức tiêu hóa, tuổi, trọng lượng của vật nuôi, cũng như số lượng và chất lượng thức ăn.
Các loài nhai lại như trâu, bò là nguồn phát thải CH4 chính, chiếm khoảng 7 Tg CH4 mỗi năm, trong đó bò đóng góp 74% (54 Tg) Hệ thống tiêu hóa của những loài này có dạ cỏ, nơi vi sinh vật tiêu thụ cellulose và tạo ra khí CH4 Ngược lại, các loài không nhai lại như ngựa và lợn phát thải ít khí này do không có dạ cỏ Trâu và cừu cũng góp phần vào tổng lượng phát thải, với trâu 6 Tg và cừu 7 Tg Ước tính toàn cầu cho thấy lượng phế thải CH4 từ động vật nhai lại vào khoảng 2 – 4 Tg CH4 mỗi năm (Crutzen và cs., 1986).
❖ Sinh sản CH 4 từ mối:
Hình 1.1 Sự thải methane từ loài mối
Sơ lược về vi khuẩn oxi hóa methane
1.3.1 Vi khuẩn oxi hóa methane Methanotroph (MOB)
Methylotroph là nhóm vi sinh vật có khả năng sử dụng các hợp chất một carbon như methanol, methane và metylamin Những vi sinh vật thuộc nhóm này có thể sử dụng methane như nguồn năng lượng và carbon duy nhất, được gọi chung là Methanotrophs (MOBs) MOBs thuộc phân lớp α và γ của nhóm Proteobacteria, và được phân loại dựa trên hình thái, đặc tính sinh lý, cấu trúc màng tế bào, các con đường chuyển hóa carbon, khả năng cố định N2, sự hiện diện của nang hoặc túi bào tử, màu sắc khuẩn lạc và khả năng di động Chúng được chia thành 5 chi: Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas, Methylobacter và Methylococcus Với sự phát triển của công cụ phân tử trong phân loại vi khuẩn, các vi sinh vật này được phân thành 2 họ: Methylococcaceae (gồm methanotroph loại I và loại X) và Methylocystaceae (methanotroph loại II).
Bảng 1.3 Đặc điểm của methanotroph (Hanson, 1996) Đặc tính Methanotroph
Methylosphaera Methylobacter Methylomicrobium Methylomonas Methylosarcina Methylothermus Methylohalobium
Methylosinus Methylocystis Methylocella Methylocapsa Methyloferula
Hình thái tế bào Trực ngắn, trực đôi, cầu Cầu, tụ cầu đôi Trực lưỡi liềm, trực, hình quả lê
Sắp xếp màng trong màng tế bào:
+Xung quanh màng tế bào
Con đường đồng hóa carbon RuMP RuMP Serine
1.3.2 Sự oxi hóa methane Ở Methanotrophs, methane đóng vai trò như nguồn carbon và năng lượng (cho electron) MOBs chuyển hóa methane thành sinh khối tế bào và CO2 với methanol là một chất trung gian MOBs sử dụng enzyme methane monooxygenase (MMO) cho quá trình oxi hoá bước đầu, chuyển methane thành methanol diễn ra ở intracytoplasmic membranes (ICM) Enzyme MMO tồn tại dưới 2 dạng: dạng hạt pMMO và dạng hòa tan sMMO Các enzyme phá vỡ liên kết O-O của phân tử Oxi bằng cách sử đồng thời hai nguyên tử O Một nguyên tử O được chuyển thành H2O, một nguyên tử O khác kết hợp với methane để tạo thành methanol Phản ứng này được cung cấp thêm điện tử bởi quá trình oxy hóa khử diễn ra trong tế bào ở chất mang cytochrome C (đối với pMMO) và NADH (đối với sMMO) (Hanson và Hanson, 1996)
CH4 + O2 + H + + NADH = H2O + CH3OH + NAD +
Methanol tiếp tục được oxi hóa thành formaldehyde nhờ enzyme methanol dehydrogenase (MDH) Formaldehyde đóng vai trò là chất chuyển hóa trung tâm trong con đường đồng hóa và dị hóa của các vi sinh vật oxy hóa methanol (MOBs) Trong con đường dị hóa, formaldehyde được chuyển hóa thành các sản phẩm khác.
14 thành formate và cuối cùng là CO2 với sự tham gia của nhiều hệ enzyme (methnol dehydrogenase, format dehydrogenase)
CH3OH → 2 H + + HCHO → 2 H + + HCOO - H + → CO2 + 2 H +
Các con đường oxi hóa methane và đồng hóa CHOH của MOBs liên quan đến sự tham gia của các electron trong chuỗi truyền điện tử tại màng tế bào Các electron di chuyển qua cofactor pyrroloquinoline quinone đến cytochrome C, NAD và FDH, kích hoạt các bơm proton hoạt động và tạo thành gradient H+ Dòng proton H+ di chuyển theo chiều gradient nồng độ qua kênh ưa nước do ATP-synthase tạo ra, kích hoạt quá trình phosphoryl hóa ADP + PI để tạo ATP, lưu trữ năng lượng trong các phân tử ATP Oxy đóng vai trò là chất nhận electron cuối cùng.
Quá trình đồng hóa formaldehyde (HCHO) diễn ra qua hai con đường chính: con đường ribulose monophosphate (RuMP) cho methanotrophs loại I và con đường serine cho methanotrophs loại II.
Hình 1.3 Con đường RuMP đồng hóa HCHO ở MOB loại I
Hình 1.4 Con đường Serine đồng hóa HCHO ở MOB loại II
Chu trình Serine xảy ra nhờ sự trợ giúp của các enzyme: Serine hydroxyl- methyltransferase (STHM), hydroxyl pyruvatereductase (HPR), malate thiokinase (MTK) và maleyl coenzyme A lyase (MCL)
Tình hình nghiên cứu
1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Methanotrophs là loại vi khuẩn tự nhiên có khả năng sử dụng methane Năm 1906, Sohngen đã phân lập thành công vi khuẩn này từ nước ao và thực vật thủy sinh.
Năm 1970, Whittenbury và cộng sự đã phân lập hơn 100 chủng vi khuẩn oxi hóa methane hiếu khí từ đất, đánh dấu sự khởi đầu của một kỷ nguyên mới trong nghiên cứu đặc tính sinh hóa Từ đó đến nay, các vi sinh vật này đã được phát hiện trong nhiều môi trường khác nhau, bao gồm nước biển (Holmes và cs., 1995), trầm tích (Smith và cs., 1997), nước ngầm (Fliermans và cs., 1988), bãi chôn lấp (Wise và cs., 1999), và mỏ than bùn (Dedysh và cs.).
2000), … cho thấy quá trình oxi hóa methane diễn ra ở nhiều nơi
Hầu hết các vi khuẩn methan oxidizing bacteria (MOB) phát triển tốt trong môi trường có độ pH trung tính (6-7) và nhiệt độ khoảng 25ºC Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây đã phát hiện nhiều chủng MOB, như Methylococcus capsulatus và Methylococcus thermophilus, có khả năng chịu đựng môi trường khắc nghiệt.
Methylococcus ucrainicus, Methylocaldum szegediense và Methylocaldum tepidum có khả năng phát triển ở nhiệt độ 50ºC (Malashenko và cộng sự, 1975) Các chủng vi khuẩn psychrophilic được phân lập từ lãnh nguyên Siberian và vùng Nam Cực có thể chịu đựng nhiệt độ thấp nhất khoảng 3.5ºC (Omelchenko và cộng sự, 1993; Bowman và cộng sự, 1997).
Skrede và cộng sự (1998) đã ứng dụng sinh khối MOB, bao gồm các chủng Methylococcus capsulatus, Bacillus brevis, và Bacillus firmus, để sản xuất thức ăn trong chăn nuôi Sản phẩm này có thành phần hóa học và chất dinh dưỡng tương tự như bột cám và đậu nành.
Kalyuzhnaya và cs (2015) đã nghiên cứu sản xuất methanol, một chất lỏng có giá trị, được sử dụng làm nhiên liệu trực tiếp hoặc chuyển đổi thành các sản phẩm khác như olefin và xăng dầu thông qua quá trình chuyển hóa, nhằm tiêu thụ CH4 của MOB.
Dayéri Dianou và cs (1997) đã phân lập được 20 chủng MOB từ bùn lúa có khả năng oxi hóa methane cao nhất là 96% và thấp nhất là 23%
Zofia Stępniewska và cs (2017) đã phân lập được các chủng vi khuẩn
Methylomonas sp từ bộ cây cói có khả năng oxi hóa CH4 từ 0.463 ± 0.067 đến 5.928 ± 0.169 μmol/L CH4/ml/ngày, tương đương giảm 70% CH4 sau 6 ngày nuôi ủ
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước:
Hiện nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào về vi khuẩn oxi hóa methane MOB được công bố ở Việt Nam
Vật liệu và phương pháp
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2017 đến tháng 4 năm 2018 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh thuộc Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3), số 68.
Lê Thị Trung, TP Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương.
Vật liệu
Đối tượng nghiên cứu: thu nhận 38 mẫu để phân lập vi khuẩn sử dụng khí methane được trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1 Mẫu được thu nhận
Mẫu Số lượng Địa điểm
Nước thải 3 mẫu Khu công nghiệp
1 mẫu Thủ Dầu Một, Bình
Nước ao 5 mẫu Củ Chi
Thải biogas 2 mẫu ấp Tân Định, xã Tân Thông Hội, huyện Củ
Mối Con mối 2 mẫu Thành phố mới, tỉnh
Bình Dương Đất mối 2 mẫu
Trâu 1 mẫu Lò giết mổ gia súc gia cầm, thị xã Bến Cát, tỉnh Bình Dương
Bò 12 mẫu Đất bùn Bùn lúa 3 mẫu Củ Chi
Bùn ao 3 mẫu Cà Mau
Phân bò 2 mẫu Củ Chi
Tổng cộng 38 mẫu
Thiết bị, dụng cụ, môi trường
❖ Tủ cấy vô trùng
❖ Pipet (thủy tinh và pipetman)
❖ Que cấy, que cấy trang
2.3.3 Hóa chất và thuốc nhuộm
• Hóa chất: Nước cất, cồn 96º, cồn 70º, NaCl, HCl 0,1 N, NaOH 0,1 N
• Thuốc nhuộm: thuốc nhuộm tím kết tinh (crystal violet), safranin O, lugol
Nội dung nghiên cứu
Dựa vào mục tiêu đã đề ra chúng tôi bố tí thí nghiệm như sơ đồ 2.1
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Quy trình thu nhận và xử lí mẫu
Lấy mẫu là bước đầu tiên và quan trọng nhất trong quá trình tìm kiếm và phân lập các chủng vi sinh vật Việc lựa chọn mẫu cần đảm bảo có sự hiện diện cao nhất của vi sinh vật Để đạt hiệu quả tối ưu, mẫu nên được lấy và tiến hành ngay quá trình phân lập tuyển chọn (Verma, 2001).
Dựa trên các tài liệu nghiên cứu về vi sinh vật sử dụng methane, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu từ nhiều nguồn khác nhau như nước sông, nước thải từ hầm biogas, phân bò, bùn lúa, con mối và dạ cỏ bò, trâu Các địa điểm lấy mẫu bao gồm huyện Củ Chi, huyện Nhà Bè thuộc thành phố Hồ Chí Minh, huyện Bến Cát tỉnh Bình Dương và tỉnh Cà Mau.
- Mẫu đất được lấy ở ruộng lúa, đất nông nghiệp, kênh mương, sâu xuống dưới và cách mặt đất khoảng 20cm (Mette và cs., 2003)
- Đối với mẫu dạ cỏ, mẫu nước, mẫu mối đựng bằng bao zipper hoặc hủ đựng vô trùng
2.5.1.2 Xử lí mẫu và phân lập
- Đối với mẫu đất bùn, dạ cỏ:
Cân 3g đất bùn và da cỏ vào bình serum 50ml chứa 10ml môi trường NMS, sau đó bịt kín bằng nút cao su silicon (Edward R Leadbetter và cs., 1958) Sử dụng kim tiêm hút khí trong bình ra và bơm CH4 qua màng lọc 0,2µm vào bình, đảm bảo %CH4 trong bình khoảng 30 – 50% Cuối cùng, ủ lắc ở 30ºC trong thời gian từ 3 đến 5 ngày (Dayeri Dianou và cs., 1997).
Mối được rửa bằng ethanol 70%, cắt bỏ đầu và sử dụng kẹp để tách ruột mối Sau đó, mối được rửa lại với ethanol 70% (Trinkerl M và cs., 1990) và chuyển vào bình serum 50ml chứa 10ml môi trường NMS có bổ sung CH4 tương tự mẫu đất bùn, ủ lắc ở 30ºC trong khoảng 3 đến 5 ngày.
Hút 3ml mẫu cho vào bình serum 50ml chứa 10ml môi trường NMS có bổ sung
CH4 tương tự mẫu đất bùn, ủ lắc ở 30ºC từ 3 đến 5 ngày
Sau 3 – 5 ngày, hút 5 – 10ml dịch nuôi chuyển vào bình serum chứa 45ml môi trường NMS với tỉ lệ CH4 trong bình 30 - 50% , khoảng 3 – 5 ngày lặp lại một lần Sau
23 khoảng 25 ngày, pha loãng dịch nuôi với dung dịch NaCl 0,85% với độ pha loãng từ cấp số 1 đến cấp số 5
Trong nghiên cứu này, 100 àL mẫu dịch nuôi được thực hiện trên 3 đụng pha loóng cuối cùng trên môi trường NMS agar, với mỗi nụng độ 2 đĩa và ủ ở 30ºC trong hộp kín bổ sung 30-50% CH4 Các khuẩn lạc mọc trên môi trường được tiếp tục cấy sang môi trường NMS agar nhiều lần cho đến khi các khuẩn lạc trên đường cấy đồng nhất về màu sắc, kích thước và hình dạng, tách rời nhau (Dehysh và cs., 2011).
2.5.1.3 Quan sát hình thái đại thể, vi thể
Quan sát đại thể vi khuẩn có thể thực hiện bằng mắt thường hoặc sử dụng kính lúp cầm tay để nhận xét về kích thước, màu sắc và các đặc điểm khác của khuẩn lạc vi khuẩn.
Để quan sát hình thái vi thể của vi khuẩn, chúng ta thực hiện nhuộm Gram và sử dụng kính hiển vi với độ phóng đại 100X (Roy và cs., 2011).
Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm vi sinh, giúp xác định hình dạng, cách sắp xếp và phân biệt vi khuẩn thuộc loại Gram [+] hay Gram [-].
Trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram [+] giữ lại phức hợp màu tím Gentian-iod không bị tẩy màu bởi alcohol, trong khi vi khuẩn Gram [-] không giữ được phức hợp này Do đó, sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram [+] vẫn có màu tím, trong khi vi khuẩn Gram [-] chuyển sang màu hồng của phẩm màu safranin hoặc fuchsin (TJ Beveridge, 2009).
• Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa
• Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính
Để nhuộm vi khuẩn, nhỏ dung dịch Crystal violet lên giấy lọc cho đến khi ướt hoàn toàn Để yên trong 1-2 phút: nếu vi khuẩn được lấy từ canh lỏng, để 2 phút; nếu lấy từ thạch dinh dưỡng, để 1 phút Sau đó, rửa sạch bằng nước và thấm khô.
• Tẩy cồn 96 o từ 15 – 30 giây (từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ thạch dinh dưỡng tẩy
30 giây) Rửa nước, thấm khô Tẩy cồn bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho cồn
24 chảy từ từ ở mép trên phiến kính Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt cồn vừa mất màu tím
• Đặt miếng giấy lọc lên vết khuẩn, nhỏ dung dịch Fuschin kiềm loãng (hoặc Safranin O), để 1 phút Rửa nước, thấm khô
Việc quan sát vi khuẩn bằng vật kính dầu với độ phóng đại 1.000 lần cho thấy vi khuẩn Gram dương (Gr (+)) sẽ bắt màu tím từ tinh thể violet, trong khi vi khuẩn Gram âm (Gr (–)) sẽ bắt màu hồng fuschin (Safranin O).
• Trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bôi
• Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa nước và thấm khô tiêu bản Đọc kết quả
• Tế bào vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím
• Tế bào vi khuẩn Gram (–) bắt màu hồng
• Vi khuẩn có bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu
Giữ giống vi sinh vật là công việc cực kỳ quan trọng, vì chúng dễ bị thoái hóa nếu không được bảo quản đúng cách Việc này bao gồm thực hiện các bước kỹ thuật cần thiết để đảm bảo tỷ lệ sống sót cao cho vi sinh vật, đồng thời bảo vệ các đặc tính di truyền không bị biến đổi và tránh nhiễm tạp bởi các vi sinh vật lạ.
Sau khi thu thập các chủng thuần, cần bảo quản giống trong môi trường phù hợp Đối với vi khuẩn oxi hóa metan, giống được giữ trong môi trường NMS agar thông qua phương pháp cấy truyền định kỳ và duy trì trong môi trường có 30-50% CH4 Quá trình cấy truyền nên được thực hiện khoảng 3 - 4 tuần một lần và mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ 4ºC (R Whittenbury và cộng sự, 1970).
2.5.2 Phương pháp phân tích khí methane
2.5.2.1 Phương pháp nuôi vi khuẩn oxi hóa methane
Vi khuẩn oxy hóa khí methane được nuôi trong bình serum thủy tinh 500 ml, với nắp cao su và kẹp nhôm, chứa 100 ml NMS và 50-70% CH4 Bình được đậy kín nắp và ủ ở nhiệt độ 30 độ C, lắc với tốc độ 200 vòng/phút.
Kết quả và thảo luận
Kết quả phân lập vi sinh vật
Từ 38 mẫu bao gồm đất, nước, bùn, mối và phân thu thập ở Bình Dương, Củ Chi, Nhà Bè, Bến Cát, chúng tôi đã phân lập được 87 chủng vi khuẩn trên môi trường NMS với CH4 là nguồn carbon duy nhất, trong đó có 45 chủng vi khuẩn Gram âm và 42 chủng vi khuẩn Gram dương Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn Mẫu Số mẫu Số chủng thu được Gram (-) Gram (+)
3.1.1 Kết quả phân lập vi sinh vật từ mẫu nước:
Từ hai mẫu nước thải biogas tại các hộ dân nuôi bò ở huyện Củ Chi, chúng tôi đã phân lập được 8 chủng vi khuẩn, hầu hết đều có hình tròn và bóng ướt Kết quả quan sát đại thể được mô tả trong bảng 3.2 và hình 3.1.
Từ 11 mẫu nước thải, sông, ao, mương tại Nhà Bè và Củ Chi, chúng tôi đã phân lập được 24 chủng vi khuẩn Hầu hết các khuẩn lạc đều ẩm ướt và có nhiều màu sắc khác nhau, trong đó chủ yếu là các khuẩn lạc màu trắng Kết quả được mô tả chi tiết trong bảng 3.3 và hình 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc từ mẫu nước thải biogas STT MÃ CHỦNG HÌNH DẠNG MÀU SẮC BỀ MẶT
1 B11 Tròn, biên đều Trắng ngã cam Bóng ướt, dẹp
2 B12 Tròn nhỏ, biên đều Nâu nhạt Bóng ướt, lồi
3 B13a Tròn, biên đều Trắng ngã cam Bóng ướt, lồi
4 B16 Tròn, biên răng cưa Trắng ngà Bóng ướt, lõm, dẹp
5 B16b Tròn, biên đều Trắng đục Bóng lồi
6 B211 Tròn nhỏ, biên đều Vàng Bóng ướt
7 B212 Tròn nhỏ, biên đều Trắng đục Bóng ướt
8 B27 Tròn nhỏ, biên đều Trắng ngã cam Bóng ướt, lồi
Hình 3.1 trình bày khuẩn lạc của một số chủng phân lập từ mẫu nước biogas trên NMS, trong khi Bảng 3.3 tóm tắt kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc từ mẫu nước sông và ao Các thông tin này bao gồm mã chủng, hình thái và màu sắc bề mặt của các khuẩn lạc.
1 N2 Tròn, biên đều Trong suốt Bóng ướt
2 N6 Tròn, biên răng cưa Trắng đục Bóng ướt
3 N8 Tròn, biên đều Trắng đục Bóng lồi
4 NS1 Mọc lan, biên không đều Trắng đục Bóng ướt, dẹp
5 NS2 Tròn, biên đều, tâm nhô Trắng ngã nâu Bóng ướt, lồi
6 NS3 Tròn nhỏ, biên đều Vàng nhạt Bóng ướt, lồi
7 S1 Tròn to, biên đều Hồng nhạt, trong suốt Bóng ướt, lồi
8 S112a Tròn nhỏ, biên đều Trắng đục Bóng lồi
9 S112b Tròn, biên đêu Trắng ngã vàng Bóng ướt
10 S113 Tròn, biên răng cưa Trắng đục Bóng ướt
11 S116 Tròn nhỏ Cam nhạt, trong suốt Bóng ướt, dẹp
12 S117 Tròn, biên đều Trắng ngã hồng Bóng ướt
13 S117a Tròn nhỏ, biên răng cưa Trắng đục Bóng ướt, lồi
14 S117b Tròn, biên đều Trắng trong Bóng ướt
15 S11a Tròn nhỏ, biên đều Vàng nhạt Bóng ướt
16 S11b Mọc lan nhỏ, biên không đều
Trắng ngã hồng, hơi trong
17 S122 Tròn, biên đều Trắng ngã nâu Bóng ướt, lồi
18 S124 Tròn to, biên đều Trong suốt Bóng ướt
19 S15b Tròn, biên đều Trong suốt Bóng ướt
20 T41 Tròn, biên đều Trắng đục Bóng ướt
21 T44 Tròn, biên đều Trong suốt Bóng lồi ướt
22 T45 Tròn, biên răng cưa Trắng đục Bóng lồi, ướt
23 T46 Tròn, biên đều Trắng ngà, hơi trong Bóng lồi
24 NĐ3-41 Tròn, biên đều Trong suốt Bóng ướt
Hình 3.2 Khuẩn lạc một số chủng phân lập từ mẫu nước sông, ao trên môi trường NMS
Sau khi thực hiện quan sát đại thể, chúng tôi tiến hành phân lập và quan sát vi thể các chủng vi khuẩn từ mẫu nước thải biogas và mẫu nước sông, ao bằng phương pháp nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi Kết quả quan sát được trình bày chi tiết trong bảng 3.4, bảng 3.5, hình 3.3 và hình 3.4.
Bảng 3.4 Đặc điểm vi thể vi sinh vật từ mẫu nước thải biogas
STT MÃ CHỦNG CÁCH BẮT
MÀU HÌNH DẠNG CÁCH SẮP
1 B11 Hồng, Gram (-) Trực mảnh Đơn
2 B12 Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Đơn
3 B13a Hồng, Gram (-) Trực khuẩn Đôi
4 B16 Hồng, Gram (-) Cầu khuẩn Tụ
5 B16b Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
6 B19 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
7 B211 Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Tụ
8 B212 Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Tụ
9 B21a Tím, Gram (+) Trực ngắn Chuỗi
10 B27 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Chuỗi
Hình 3.3 trình bày kết quả nhuộm Gram của một số chủng vi khuẩn được phân lập từ mẫu nước thải biogas Bảng 3.5 cung cấp các đặc điểm vi thể của vi sinh vật từ nước sông và ao.
STT MÃ CHỦNG CÁCH BẮT
MÀU HÌNH DẠNG CÁCH SẮP
1 N2 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
2 N6 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
3 N8 Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Tụ
4 NS1 Tím, Gram (+) Trực mảnh, ngắn Đơn
5 NS2 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Chuỗi
6 NS3 Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Tụ
7 S1 Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Tụ
8 S112a Hồng, Gram (-) Cầu khuẩn Đôi
9 S112b Tím, Gram (+) Trực khuẩn, bào tử Đơn
10 S113 Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Đơn
11 S116 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
12 S117 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
13 S117a Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
14 S117b Tím, Gram (+) Trực mảnh, dài Đơn
15 S11a Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
16 S11b Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
17 S122 Hồng, Gram (-) Trực mảnh Đơn
18 S124 Tím, Gram (+) Trực mảnh Đơn
19 S15b Hồng, Gram (-) Cầu khuẩn Đôi
20 T41 Hồng, Gram (-) Tụ cầu Đôi
21 T44 Hồng, Gram (-) Trực dài Đơn
22 T45 Tím, Gram (+) Trực khuẩn Đơn
23 T46 Hồng, Gram (-) Trực mảnh Đơn
24 NĐ3-41 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
Kết quả nhuộm Gram cho thấy sự hiện diện của một số chủng vi khuẩn được phân lập từ mẫu nước sông và ao Ngoài ra, kết quả phân lập vi sinh vật từ con mối cũng đã được thực hiện, cung cấp thông tin quan trọng về sự đa dạng sinh học trong môi trường này.
Từ 4 mẫu mối tại thành phố mới Bình Dương, chúng tôi tiến hành phân lập được
4 chủng vi khuẩn Hầu hết các chủng vi khuẩn đều có màu trắng đục Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 và hình 3.5
Bảng 3.6 Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc từ con mối
STT MÃ CHỦNG HÌNH THÁI MÀU SẮC BỀ MẶT
1 MO1 Mọc lan, biên không đều Trắng đục Bóng ướt
2 MO12 Tròn to, biên đều Trắng trong Bóng lồi, ướt
3 MO13 Tròn, biên đều Trắng đục Bóng ướt
4 MO2 Tròn, biên đều Trắng đục Bóng ướt
Hình 3.5 Khuẩn lạc một số chủng phân lập từ ruột mối trên môi trường NMS
Sau khi tiến hành quan sát đại thể, chúng tôi đã thực hiện quan sát vi thể các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu mối bằng phương pháp nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi Kết quả của quá trình này được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.6.
Bảng 3.7 Đặc điểm vi thể vi sinh vật phân lập từ con mối
STT MÃ CHỦNG CÁCH BẮT
MÀU HÌNH DẠNG CÁCH SẮP
1 MO1 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
2 MO12 Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Tụ
3 MO13 Hồng, Gram (-) Trực khuẩn Đơn
4 MO2 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
Hình 3.6 Kết quả nhuộm Gram một số chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu mối 3.1.3 Kết quả phân lập vi sinh vật từ mẫu bùn
Từ 9 mẫu bùn lúa và kênh mương tại Củ Chi và Cà Mau, chúng tôi đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn Hầu hết các chủng này đều có hình dạng bóng ướt với nhiều màu sắc khác nhau Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.8 và hình 3.7.
Bảng 3.8 Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc từ mẫu bùn
STT MÃ CHỦNG HÌNH THÁI MÀU SẮC BỀ MẶT
1 BĐ41 Tròn nhỏ, biên đều Cam Bóng ướt, lồi
2 ĐS3 Tròn nhỏ, biên đều Trắng ngã nâu Bóng ướt, dẹp
3 ĐS33 Tròn, biên đều Trắng đục Bóng ướt
4 ĐS4 Mọc lan, biên không đều Trắng đục Bóng ướt
5 L21 Tròn, biên đều Trắng ngã nâu Bóng ướt, dẹp
6 L23 Tròn, biên răng cưa Trắng đục Bóng ướt
7 L26 Tròn, biên đều Trắng ngà Bóng ướt, dẹp
Hình 3.7 Khuẩn lạc một số chủng phân lập từ mẫu bùn trên môi trường NMS
Sau khi tiến hành quan sát đại thể, chúng tôi đã thực hiện việc quan sát vi thể các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu bùn bằng phương pháp nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi Kết quả của nghiên cứu này được trình bày chi tiết trong bảng 3.9 và hình 3.8.
Bảng 3.9 Đặc điểm vi thể vi sinh vật phân lập từ mẫu bùn
STT MÃ CHỦNG CÁCH BẮT
MÀU HÌNH DẠNG CÁCH SẮP
1 BĐ41 Hồng, Gram (-) Trực khuẩn Đơn
2 ĐS3 Tím, Gram (+) Trực khuẩn Đơn
3 ĐS33 Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
4 ĐS4 Tím, Gram (+) Trực ngắn đơn
5 L21 Hồng, Gram (-) Trực khuẩn Đơn
6 L23 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đôi
7 L26 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
Hình 3.8 Kết quả nhuộm gram một số chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu bùn 3.1.4 Kết quả phân lập vi sinh vật từ mẫu dạ cỏ
Từ 13 mẫu dạ cỏ tại lò giết mổ gia súc gia cầm thị xã Bến Cát, tỉnh Bình Dương, chúng tôi đã phân lập được 44 chủng vi khuẩn Hầu hết các khuẩn lạc đều có hình dạng bóng ướt với các màu sắc như trắng đục, vàng hoặc trong suốt khác nhau Kết quả được trình bày qua bảng 3.10 và hình 3.9.
Bảng 3.10 Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc từ mẫu dạ cỏ
STT MÃ CHỦNG HÌNH THÁI MÀU SẮC BỀ MẶT
1 D72 Tròn nhỏ, biên răng cưa Vàng Bóng ướt, lồi
2 DC1 Tròn, biên đều Trắng đục Bóng ướt, lồi
3 DC2 Tròn nhỏ, biên đều Vàng nhạt Bóng ướt
4 DC23 Tròn nhỏ, biên đều Trắng đục Bóng ướt, lồi
5 DC3 Tròn, biên răng cưa Trắng đục Bóng ướt, lồi
6 DC3a Tròn to, biên đều Trắng trong Bóng ướt
7 DC32a Tròn, biên đều Trắng đục Bóng ướt, lồi
8 DC32b Tròn, biên đều Trắng ngà Bóng ướt
9 DC33 Tròn, biên đều Trắng ngà Bóng ướt, lồi
10 DC23a Tròn, biên đều Trắng đục Bóng lồi
11 DC41b Mọc lan, không đều Trắng đục Bóng ướt
12 DC41a Tròn nhỏ, biên đều Trắng đục Bóng ướt
13 DC42 Mọc lan, biên không đều Trắng đục Bóng ướt
14 DC43 Tròn, biên đều Trong suốt Bóng ướt
15 DC43a Mọc lan, biên không đều
Trắng ngã vàng Bóng ướt, dẹp
16 DC44 Tròn, biên đều Trắng đục Bóng lồi
17 DC5 Tròn, biên răng cưa Trắng đục Bóng ướt
18 DC50b Mọc lan, biên không đều
Trắng ngà, hơi trong Bóng ướt, de
19 DC511 Mọc lan, biên răng cưa Trắng đục Bóng ướt, dẹp
20 DC58 Tròn nhỏ Trắng đục Bóng ướt
21 DC59a Tròn, biên đều Trắng đục Bóng lồi
22 DC59b Mọc lan, không đều Trắng đục Bóng ướt
23 DC63 Tròn nhỏ, biên răng cưa Trắng hơi đục Bóng ướt
24 DC67 Tròn, biên đèu Trắng đục Bóng lồi
25 DC64 Tròn, biên không đều Trắng đục Bóng ướt
26 DC610 Mọc lan, biên không đều Trắng hơi ngà Bóng ướt, dẹp
27 DT16a Mọc lan, biên không đều
Hồng nhạt, trong suốt Bóng ướt
28 DT16b Tròn, biên đều Trong suốt Bóng lồi
29 DC613 Mọc lan, biên không đều Trắng hơi ngà Bóng ướt, dẹp
30 DC84 Tròn, biên đều Trắng hơi ngã vàng Bóng ướt
31 DC86 Tròn nhỏ Vàng Bóng ướt, lồi
32 DC87 Tròn, biên răng cưa Trắng đục Bóng ướt
33 DC88 Tròn, bờ răng cưa Vàng nhạt Bóng ướt, lồi
34 DT12 Tròn nhỏ, biên đều Vàng Bóng ướt, lồi
35 DT17 Tròn nhỏ Trong suốt Bóng lồi
36 DT18 Tròn, biên đều Vàng chanh Bóng ướt, lồi
37 DT18c Tròn, biên đều Vàng nhạt, trong suốt Bóng lồi
38 MK3 Tròn, biên răng cưa Trắng đục Bóng ướt
39 MK2 Tròn, biên răng cưa Trắng ngà Bóng ướt, dẹp
40 RB1 Tròn, biên đều Trắng ngà Bóng ướt
41 RB11 Tròn, biên đều Trắng đục Bóng lồi
42 RB26 Tròn nhỏ, biên đều Vàng nhạt Bóng ướt
43 RB28 Tròn, biên răng cưa Trắng ngã nâu nhạt Bóng ướt, dẹp
44 RB23 Tròn nhỏ, biên đều Trắng đục Bóng ướt
Hình 3.9 Khuẩn lạc một số chủng phân lập từ mẫu dạ cỏ trên NMS
Sau khi tiến hành quan sát đại thể, chúng tôi đã thực hiện quan sát vi thể các chuẩn vi khuẩn phân lập từ mẫu bùn bằng phương pháp nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi Kết quả của nghiên cứu được trình bày chi tiết trong bảng 3.11 và hình 3.10.
Bảng 3.11 Đặc điểm vi thể vi sinh vật phân lậ từ mẫu dạ cỏ
STT MÃ CHỦNG CÁCH BẮT
MÀU HÌNH DẠNG CÁCH
1 D72 Tím, Gram (+) Trực khuẩn Đôi
2 DC1 Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
3 DC2 Hồng, Gram (-) Trực khuẩn Đơn
4 DC23 Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Tụ
5 DC23a Tím, Gram (+) Trực khuẩn Đơn
6 DC3 Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
7 DC32a Tím, Gram (+) Trực khuẩn Đơn
8 DC32b Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
9 DC33 Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
10 DC3a Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
11 DC41b Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
12 DC41a Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Đơn
13 DC42 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
14 DC43 Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
15 DC43a Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
16 DC44 Hồng, Gram (-) Cầu khuẩn Chuỗi
17 DC5 Tím, Gram (+) Trực khuẩn Đơn
18 DC50b Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
19 DC511 Hồng, Gram (-) Trực khuẩn Đơn
20 DC58 Hông, Gram (-) Trực ngắn Đơn
21 DC59a Hồng, Gram (-) Cầu khuẩn Tụ
22 DC59b Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
23 DC63 Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Tụ
24 DC64 Tím, Gram (+) Trực khuẩn Đơn
25 DC67 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
26 DC610 Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
27 DC613 Hồng, Gram (-) Trực khuẩn Đơn
28 DC50b Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
29 DC86 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
30 DC87 Hồng, Gram (-) Tụ cầu Đôi
31 DC88 Hồng, Gram (-) Trực khuẩn Đơn
32 DT12 Hồng, Gram (-) Cầu khuẩn Đôi
33 DT16a Tím, Gram (+) Trực mảnh, dài Đơn
34 DT16b Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
35 DT17 Tím, Gram (+) Oval Đơn
36 DT18 Tím, Gram (+) Trực ngắn Đơn
37 DT18c Hồng, Gram (-) Trực khuẩn Đơn
38 MK2 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
39 MK3 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
40 RB1 Hồng, Gram (-) Trực ngắn Đơn
41 RB11 Hồng, Gram (-) Cầu khuẩn Đơn
42 RB23 Tím, Gram (+) Trực khuẩn Đơn
43 RB26 Tím, Gram (+) Cầu khuẩn Tụ
44 RB28 Tím, Gram (+) Trực, bào tử Đơn
Kết quả định lượng khả năng oxi hóa methane của các chủng vi khuẩn thử nghiệm
Từ 87 chủng vi khuẩn phân lập được từ môi trường NMS với CH4 là nguồn cacbon duy nhất, chúng tôi đã tiến hành định lượng xác định phần trăm oxi hóa methane của một số chủng vi khuẩn Kết quả được trình bày trong bảng 3.12.
Bảng 3.12 So sánh phần trăm oxi hóa methane của các chủng thử nghiệm lần 1
STT CHỦNG PHẦN TRĂM OXI HÓA
Trong cùng một cột, các trị số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Duncan
Biểu đồ 3.1 So sánh phần trăm oxi hóa methane của các chủng thử nghiệm lần 1
Theo kết quả bảng số liệu 3.12 và biểu đồ 3.1 so sánh khả năng oxi hóa methane của các chủng vi khuẩn thử nghiệm trên cho thấy:
Hầu hết các chủng thử nghiệm lần 1 đều có khả năng oxy hóa methane, với tỷ lệ từ 34,30 ± 11,54% đến 53,20 ± 3,34% Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các chủng S15b, MO2, DC3 so với BĐ41 Tất cả các chủng đều có sự khác biệt so với mẫu đối chứng (ĐC) giảm.
Chủng S15b có khả năng oxi hóa methane cao nhất (53,20 ± 3,34%) và thấp nhất là chủng BĐ41(34,30 ± 11,54%)
Nghiên cứu của Dayeri Dianou và cộng sự (1997) đã xác định được 20 chủng vi khuẩn oxy hóa methane (MOB), trong đó chủng có khả năng oxy hóa methane cao nhất đạt 96%, trong khi chủng thấp nhất chỉ đạt 23% Kết quả này cho thấy hiệu suất oxy hóa methane của các chủng MOB trong nghiên cứu của họ cao hơn so với các nghiên cứu trước đó, với tỷ lệ oxy hóa chỉ từ 43% đến 55%.
Bảng 3.13 So sánh phần trăm oxi hóa methane của các chủng thử nghiệm lần 2
STT CHỦNG PHẦN TRĂM OXI HÓA
Phần trăm oxi hóa methane (%)
Dựa vào kết quả qua thống kê với mức ý nghĩa p = 0,65 > p = 0,05, nên kết quả giữa các nghiệm thức và đối chứng không có ý nghĩa qua thống kê
Kết quả thí nghiệm cho thấy các chủng vi sinh vật thử nghiệm có khả năng giảm khí methane không đáng kể, không tạo ra sự khác biệt so với nghiệm thức đối chứng khi phân tích thống kê.
Kết luận và kiến nghị
Kết luận
Từ 38 mẫu được phân lập trong môi trường NMS sử dụng CH4 làm nguồn carbon duy nhất, chúng tôi đã thu được 86 chủng vi khuẩn có khả năng giảm CH4 Trong số đó, có 45 chủng Gram (-) và 42 chủng Gram (+).
Nghiên cứu đã tiến hành định lượng khả năng oxy hóa methane của một số chủng vi khuẩn tiềm năng, trong đó chủng vi khuẩn S15b cho thấy khả năng giảm methane cao nhất, đạt 53,20 ± 3,34% (theo bảng 3.12).
Kiến nghị
Để đề tài hoàn thiện hơn và có khả năng ứng dụng cao, chúng tôi có một số kiến nghị như sau :
- Tiếp tục thu nhận mẫu và phân lập để tìm được chủng vi sinh vật có khả năng làm giảm methane cao hơn
- Định lượng khả năng làm giảm CH4 của những chủng vi khuẩn tiềm năng còn lại
- Thử nghiệm khả năng sử dụng và làm giảm CH4 của vi khuẩn tiềm năng trên mô hình thực nghiệm
- Định danh vi khuẩn tìm năng theo phương pháp truyền thống và sinh học phân tử
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1 Đặng Như Tại, Trần Quốc Sơn (1999), Hóa học hữu cơ, trang 84
2 Hoàng Anh Lê, Đặng Thị Xuân Hoa, Đinh Mạnh Cường, (2017) “Kiểm kê khí thải NH3, N2O, và CH4 từ hoạt động chăn nuôi gia súc, gia cầm: Áp dụng trên địa bàn xã Thọ Vinh, huyện Kim Động, tỉnh Hưng Yên” Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất và Môi trường, tập 33, số 4, trang 117-126
3 Mai Văn Trịnh , Trần Văn Thể, Bùi Thị Phương Loan, (2013) “Tiềm năng giảm thiểu phát thải khí nhà kính của ngành sản xuất lúa nước Việt Nam”, Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, tr 1859-4581
4 Nguyễn Hữu Thành, Nguyên Đức Hùng, Trần Thị, Lệ Hà, Nguyễn Thọ Hoàng,
Nghiên cứu năm 2012 về tình hình phát thải khí Metan (CH4) từ hoạt động canh tác lúa nước ở khu vực đồng bằng sông Hồng đã được công bố trong Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 10, số 1, trang 165 – 172 Bài viết chỉ ra rằng canh tác lúa nước là một nguồn phát thải khí Metan đáng kể, ảnh hưởng đến môi trường và khí hậu Các yếu tố như phương pháp canh tác, quản lý nước và phân bón đều có tác động đến mức độ phát thải khí này Nghiên cứu nhấn mạnh sự cần thiết phải áp dụng các biện pháp quản lý bền vững để giảm thiểu lượng khí Metan phát thải từ nông nghiệp.
5 Nguyễn Văn Thắng, Nguyễn Trọng Hiệu, Trần Thục, Nguyễn Thị Lan,(2010)
Biến đổi khí hậu và tác động ở Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật
6 Phạm Quang Hà, Vũ Thắng, Nguyễn Thị Khánh (2015).”Đánh giá mức độ phát thhải CH4 từ đất phù sa, sông Hồng và đất xám bạc màu trồng lúa ở miền Bắc Việt Nam”
7 Trần Linh Thước (2006), Phương pháp phân tích vi snh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, Nhà xuất bản Giáo Dục Việt Nam
8 Trịnh Văn Anh, Phạm Xuân Hậu (2011) “Hiệu ứng nhà kính và những giải pháp hạn chế hậu quả của việc tăng hiệu ứng nhà kính của Trái Đất đối với đời sống kinh tế Việt Nam” Tạp chí Khoa học Đại học sư phạm TPHCM 26
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
1 Bingemer H.G, Crutzen P.J (1987) “The production of methane from solid wastes” Journal of Geophysical Research 92 (D2), pp 2181 - 2187
2 Bouwman A.F (1990) Soils and the Greenhouse Effect, John Wiley & Sons Inc
3 Bowman J.P., McCammon S.A., Skerratt J.H (1997), “Methylosphaera hansonii gen nov., sp nov., a psychrophilic, group I methanotroph from antartic marine- salinity, meromictic lakes”, Microbiology 143, pp 1451-1459
4 Bowman J.P., Sly L.I., Nichols P.D., Hayward A.C (1993), “Revised taxonomy of the methanotrophs: description of Methylobacter gen nov., emendation of Methylococcus, validation of Methylosinus and Methylocystis species, and a proposal that the family Methylococcaceae includes only the group I methanotrophs”, International Journal of Systematic and Evolutionary
5 Conrad R., Erkel C., Liesack W (2006), “Rice Cluster I methanogens, an important group of Archaea producing greenhouse gas in soil”, Current Opinion in Biotechnology, 17, pp 262–267
6 Crutzen D.J and Seiler W (1986) “Methane production by domestic animals, wild ruminants, other herbivorous fauna and humans”, Tellus 388, pp 271-284
7 Crutzen P.J., Heidt L.E., Krasnec J.P, Pollock W.H., Seiler W (1979), “Biomass burning as a source of atmospheric gases CO, H2, N2O, NO, CH3Cl, and COS”,
8 Dedysh S.N., Dunfield P.F., (2010), “Facultative and obligate methanotrophs: how to identify and differentiate them” Methods in Enzymology, pp 31-43
9 Dedysh S.N., Liesack W., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A., Semrau J.D., Bares A.M., Panikov N.S., Tiedje J.M (2000), “Methylocella palustris gen.nov., sp.nov., a new methane-oxidizing acidophilic bacterium from peat bogs, representing a novel subtype of serine-pathway methanotrophs”, Int J Syst Evol
10 Dianou D., Espiritu B.M., Adachi.K, Senboku.T (1997), “Isolation and some properties of methane-oxidizing bacteria from a subtropical paddy field”, Soil Sci Plant Nutr., 43, pp 735-740
11 Edward, Leadbetter R., Foster J.W (1958), “Studies on some methane – utilizing bacteria”, Archiv fur Mikrobiologie 30, pp 91-118
12 Fliermans C.B., Phelps T.J., Ringelberg D., Mikell A.T., White D.C (1988),
“Mineralization of trichloroethylene by heterotrophic enrichment cultures”,
Mineralization of trichloroethylene by heterotrophic enrichment cultures Applied and Environmental Microbiology 54, pp 1709 – 1714
13 Hanson R.S., Hanson T.E (1996), “Methanotrophic bacteria” Microbiol Rev 60, pp 439-471
14 Holmes A.J., Owens N.J.P., Murrell J.C (1995), “Detection of novel marine methanotrophs using phylogenetic and functional gene probes after methane enrichment”, Microbiology 141, pp 1947-1955
15 Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) (2013), Climate change 2013: The Physical Science Basis
16 Intergovernmental Panel on Climate Change (IPPC) (2001), Climate change 2001: Synthesis Report
17 Inubushi K, Hori K, Matsumoto S (1989), “Methane emission from the flood rice soil to the atmosphere through rice plant” Japanese Journal of Soil Science and Plant Nutrition 60, pp 318 – 324 (in Japanese with English summary)
18 Kalyuzhnaya M.G., Puri A.W., Lidstrom M.E., (2015), “Metabolic engineering in Methanotrophic bacteria”, Metab, Eng 29, pp 142–152
19 Khalil M.A.K., Rasmussen R.A (1985), “Causes of increasing atmospheric methane: depletion of hydroxyl radicals and the rise of emissions”, Atmos Environ 19, pp 397-407
20 Khalil M.A.K., Rasmussen R.A (1987), “Atmospheric methane: Trends over the last 10,000 years”, Atmospheric Environment 21, pp 2445-2452
21 López J C., Quijano G., Souza T S O., Estrada J M., Lebrero R., Muủoz R
(2013), “Biotechnologies for greenhouse gases (CH4, N2O, and CO2) abatement: state of the art and challenges”, Appl Microbiol Biotechnol 97, pp
22 Macfaddin J F (2000), “Biochemical test for identification of medical bacteria”
Lippincott Williams and Wilkins, pp 150 – 376
23 Madigan, M.T., Martinko, J.M., and Parker J., (2003) Brock Biology of Microorganisms, Upper Saddle River, NJ: Pearson Education
“Thermophilic and thermotolerant bacteria that assimilate methane”,
25 Melse R W., Van der Werf A W (2005), “Biofiltration for mitigation of methane emission from animal husbandry”, Environ Sci Technol 39, pp 5460–
26 Mette M Svenning, Wartiainen I., Hestnes A.G., Svend J Binnerup (2003),
“Isolation of methane oxidising bacteria from soil by use of a soil substrate membrane system”, FEMS Microbiology Ecology 44, pp 347 – 354
27 Omelchenko M.V., Vasilyeva L.V., Zavarzin G.A (1993), “Psychrophilic methanotroph from tundra soil”, Curr Microbiol 27, pp 255-259
28 Reuss J., Rachel R., Kọmpfer P., Rabenstein A., Kỹver J., Drửge S., Kửnig H
(2015), “Isolation of methanotrophic bacteria from termite gut”, Microbiological
29 Roy S., Banerjee D (2010), “Isolation of antimiroial compound endophytic bacteria from vinca rosea”, International Journal of Current Research, 5, pp 47 – 51
30 Skrede A., Berge G.M., Storebakken T., Herstad O., Aarstad K.G., Sundstứl F
(1998), “Digestibility of bacterial protein grown on natural gas in mink, pigs, chicken and Atlantic salmon”, Anim Feed Sci Tech 76, pp 103–116
31 Smith K.S., Costello A.M., Lidstrom M.E., (1997) “Methane and trichloroethylene oxidation by an estuarine methanotroph”, Methylobacter sp Strain BB5.1 Appl Environ Microbiol 63, pp 4617 - 4620
32 Stępniewska Z., Goraj W., Kuźniar A., Łopacka N., Małysza M (2017),
“Enrichment culture and identification of endophytic methanotrophs isolated from peatland plants”, Folia Microbiol, vol 62, pp 381–391
33 Trinkerl M., Breunig A., Schauder R., Kửnig H (1990), “Desulfovibrio termitidis, sp nov., a carbohydrate-degrading sulfate-reducing bacterium from the hindgut of a termite”, Syst Appl Microbiol 13, pp 372 – 377
34 Whittenbury R., Philips K C., Wilkinson J F (1970), “Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria”, J Gen Microbiol 61, pp 205-218
35 Wise M.G., McArthur J.V., Shimkets LJ (1999), “Methanotroph diversity in landfill soil: isolation of novel types I and type II methanotrophs whose presence was suggested by culture-independent 16S ribosomal DNA analysis”, Appl Environm Microbiol 65, pp 4887 - 4897
PHỤ LỤC 1 Môi trường
Trace element solution (recipe below) 1.0 ml