VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Vật liệu nghiên cứu bao gồm 15 dòng, trong đó:
- 3 dòng mang tính trạng toàn hoa cái (gynoecious)
- 12 dòng mang tính trạng có cả hoa đực và hoa cái (các dòng có tỷ lệ hoa đực/hoa cái ở các mức độ khác nhau)
Các dòng trên được lấy từ Công ty TNHH Hạt giống Tân Lộc Phát và được khảo sát trong điều kiện nhà lưới của công ty
Bảng 3.1 : Những dòng được dùng trong thí nghiệm
STT Kiểu hình giới tính Ghi chú
1 Có cả hoa đực và cái Hoa đực nhiều hơn hoa cái
2 Có cả hoa đực và cái Hoa đực nhiều hơn hoa cái
3 Có cả hoa đực và cái Hoa đực nhiều hơn hoa cái
4 Có cả hoa đực và cái Hoa đực nhiều hơn hoa cái
5 Có cả hoa đực và cái Hoa đực nhiều hơn hoa cái
6 Có cả hoa đực và cái Hoa cái nhiều hơn hoa đực
7 Có cả hoa đực và cái Hoa cái nhiều hơn hoa đực
8 Có cả hoa đực và cái Hoa cái nhiều hơn hoa đực
12 Có cả hoa đực và cái Hoa cái và đực trung bình
13 Có cả hoa đực và cái Hoa cái và đực trung bình
14 Có cả hoa đực và cái Hoa cái và đực trung bình
15 Có cả hoa đực và cái Hoa cái và đực trung bình
Bảng 3.2: Marker phân tử được sử dụng trong nghiên cứu này là:
Marker Trình tự mồi TLTK
-Plant DNAzol Reagent: là một chất phản ứng hữu cơ sẵn sàng để sử dụng cho việc tách DNA chất lượng cao từ nhiều mẫu thực vật
-Dung dịch Chloroform: là chất biến tính protein
-Dung dịch Ethanol 100%: kết tủa DNA, loại bỏ những mảnh DNA gãy -Dung dịch Ethanol 70% : loại bỏ muối và Ethanol 100%
-Nuclease- free water (H2O): hòa tan tủa DNA
-Deoxyribonucleotide triphotphat (dNTP): là nguyên liệu tham gia tạo nên mạch DNA mới, gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP
Dung dịch đệm (Buffer) là thành phần quan trọng trong PCR, bao gồm KCl, MgCl2 và Tris Trong đó, muối KCl đóng vai trò tăng cường hiệu quả của phản ứng.
Hot Taq là enzyme thiết yếu trong phản ứng PCR, giúp tổng hợp đoạn DNA mới khi kết hợp với các thành phần cần thiết trong điều kiện thích hợp.
-Mồi xuôi và mồi ngược đặc hiệu cho từng phản ứng
-Dung dịch TBE 10X (500mL): là chất đệm được sử dụng phổ biến nhất đối với điện di gel polyacrylamide DNA và RNA
-Loading Dye (chất nhuộm huỳnh quang)
-Máy PCR -Bồn điện di -Máy Gel doc -Máy ly tâm -Máy đo OD -Máy Vortex -Cân phân tích -Máy khuấy từ
Các kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp ly trích DNA bộ gene dưa leo
Mục tiêu chính của kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, tránh sự phân hủy do các tác nhân cơ học như nghiền hay lắc mạnh, cũng như các tác nhân hóa học như enzyme nội bào khi tế bào bị phá vỡ Để bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy, quá trình tách chiết thường được thực hiện ở nhiệt độ thấp nhằm ức chế hoạt động của các enzyme ngoại bào như Dnase và Rnase.
Quá trình tách chiết DNA phải trải qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1 của quá trình phá vỡ tế bào bao gồm việc sử dụng các phương pháp vật lý hoặc hóa học Tùy thuộc vào loại tế bào với cấu trúc và màng tế bào khác nhau, cần lựa chọn phương pháp phù hợp Thông thường, tế bào thực vật được nghiền để tiến hành phá vỡ.
25 nitơ lỏng để phá vỡ vách tế bào
- Giai đoạn 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu
Trong quá trình tách chiết protein từ mẫu, các tạp chất như lipid và polysaccharide chủ yếu được loại bỏ bằng các dung dịch như phenol, chloroform, hoặc hỗn hợp phenol-chloroform (1:1) và chloroform-isoamyl alcohol (24:1) Những dung dịch này có khả năng làm biến tính protein mà không hòa tan nucleic acid, dẫn đến việc protein sẽ lắng đọng thành một lớp giữa pha nước chứa DNA và pha phenol/chloroform sau khi ly tâm Cuối cùng, pha nước chứa DNA sẽ được thu hồi để sử dụng tiếp.
Giai đoạn 3 trong quy trình chiết xuất DNA là tủa DNA, nhằm thu nhận DNA dưới dạng cô đặc để bảo vệ khỏi sự phân hủy của enzyme và dễ dàng hòa tan trong dung dịch theo nồng độ mong muốn Có nhiều phương pháp tủa DNA như sử dụng ethanol, isopropanol, hoặc butanol, trong đó tủa bằng ethanol và isopropanol là phổ biến nhất Sau khi tủa, DNA sẽ được thu nhận bằng ly tâm, và cặn tủa sẽ được rửa bằng ethanol 70% để loại bỏ muối và dấu vết của isopropanol Cuối cùng, DNA sau khi tách chiết sẽ được bảo quản trong dung dịch khử ion hoặc dung dịch TE 1X.
3.2.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR, do Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và giành giải Nobel Hóa học vào tháng 10 năm 1993, là một kỹ thuật invitro để tổng hợp và khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu Phương pháp này sử dụng 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của DNA đích, kết hợp với enzyme DNA polymerase Nguyên tắc của PCR dựa trên hiện tượng biến tính và hồi tính của DNA, cho phép khuếch đại trình tự DNA qua 30 đến 40 chu kỳ lặp lại, bao gồm ba giai đoạn chính.
Trong giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ phản ứng nhanh chóng tăng lên 95°C và duy trì trong khoảng 30 giây đến 1 phút Ở nhiệt độ này, các liên kết hydro giữa hai mạch đơn của phân tử DNA sợi đôi bị phá vỡ.
Giai đoạn bắt cặp (Anealation) diễn ra ở nhiệt độ khoảng 50-60 độ C trong thời gian từ 15-60 giây Mục tiêu của quá trình này là giúp các mồi tìm kiếm và bắt cặp chính xác với trình tự đích (DNA hoặc cDNA) tại vị trí mong muốn Nhiệt độ bắt cặp được điều chỉnh dựa trên tỷ lệ G và C trong mồi.
Giai đoạn kéo dài (Elongation) diễn ra sau khi mồi tìm kiếm và bắt cặp với trình tự đích, nhiệt độ phản ứng nhanh chóng trở về mức tối ưu cho enzyme DNA polymerase, thường là 72°C Nhiệt độ này được duy trì từ 30 giây đến 2 phút, tùy thuộc vào chiều dài đoạn DNA cần tổng hợp Trong quá trình này, DNA polymerase sẽ lấy nucleotide (A, T, G, C) từ môi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của mồi, theo nguyên tắc bổ sung với trình tự trên phân tử DNA hoặc cDNA đích.
Hình 4: Các giai đoạn của phản ứng PCR
- DNA khuôn (DNA template): được sử dụng làm khuôn cho các mồi PCR gắn vào vị trí bổ sung với nó
- Mồi: là những đoạn oligonucleotide ngắn (kích thước 18-30 base) Mồi có hai vai trò chính : quyết định nên tính đặc hiệu của phản ứng và khởi động
27 enzyme DNA polumerase vì enzyme này chỉ tổng hợp khi nhận dạng được đầu 3’ của trình tự mồi
- Deoxyribonucleotide triphotphat (dNTP): là nguyên liệu tham gia tạo nên mạch DNA mới, gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP
Dung dịch MgCl2 là yếu tố quan trọng cho hoạt động của enzyme DNA polymerase; nồng độ thấp của MgCl2 có thể ức chế enzyme này, trong khi nồng độ quá cao sẽ dẫn đến kết quả PCR không đặc hiệu.
Dung dịch đệm (Buffer) là thành phần thiết yếu trong phản ứng PCR, bao gồm KCl, MgCl2 và Tris Trong đó, muối KCl đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả của phản ứng PCR.
Enzyme DNA polymerase là một yếu tố thiết yếu trong phản ứng PCR, nơi nó hoạt động để tổng hợp các đoạn DNA mới khi có đủ điều kiện và các thành phần cần thiết khác.
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR
Bảng 3.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian (s) Chu kỳ
Biến tính ban đầu mạch đôi DNA 98 30 1
Biến tính mạch đôi DNA 98 5
Mồi bắt cặp với mạch đơn DNA Khảo sát 5 30
Kéo dài mạch DNA lần cuối 72 60 1
Khi các phân tử mang điện tích được đặt trong một điện trường, chúng sẽ di chuyển về phía cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy thuộc vào loại điện tích của từng phân tử.
Các nucleic acid mang điện tích âm do có gốc phosphate (PO43-) trong cấu trúc, vì vậy chúng sẽ di chuyển về phía cực dương trong điện trường.
Điện di gel agarose là phương pháp phổ biến để tách các đoạn acid nucleic có kích thước từ 200bp đến 50kb Quá trình điện di diễn ra trên một giá thể nằm ngang, nơi các phân tử nucleic acid với khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong một điện trường thích hợp Kỹ thuật này không chỉ đơn giản và nhanh chóng mà còn cho phép xác định vị trí của DNA trong gel thông qua việc nhuộm bằng ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ thấp, giúp phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (UV).
- Điện di gel polyacrylamide (PAGE – Polyacrylamide Gel
Kỹ thuật điện di gel polyacrylamide (electrophoresis) là phương pháp sử dụng các phân tử acrylamide để thực hiện phản ứng polymer hóa, tạo ra một mạng lưới phân tách hiệu quả Gel polyacrylamide thường được áp dụng để tách biệt các thành phần trong mẫu, giúp nâng cao độ chính xác trong nghiên cứu và phân tích sinh học.
Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA từ lá non
Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng hóa chất Plant DNAzol Reagent (DNAzol) để tách chiết DNA từ lá non, nhằm rút ngắn và đơn giản hóa quy trình so với các đề tài trước đã sử dụng CTAB để phá vỡ màng tế bào.
Quy trình tách chiết bằng Plant DNAzol Reagent nhà phân phối đã
30 chỉ ra toàn bộ quy trình có thể được hoàn thành trong khoảng 60 phút, với trình tự thực hiện và nồng độ các chất như sau:
- Nghiền mô thực vật trong nitơ lỏng cùng với 0,3ml Plant DNAzol Reagent cho 0,1 g mô thực vật
- Trộn dung dịch kỹ lưỡng bằng cách đảo nhẹ và ủ 25 o C trong 5 phút
- Cho 0,3 ml chlorofrom, trộn đều và ủ 25 o C trong 5 phút
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút và chuyển dịch nổi sang epppendorf mới
- Cho vào epppendorf mới với 0,225 ml Ethanol 100%, trộn mẫu bằng cách đảo ngược 6-8 lần và để bảo nhiệt độ phòng trong 5 phút
- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 4 phút, bỏ dịch nổi
- Cho vào eppendoft 0,3mL DNAzol + Ethanol 100% wash (tỷ lệ 1: 0,75), vortex, giữ mẫu trong 5 phút và ly tâm 5000 vòng/phút trong
- Loại bỏ DNAzol + Ethanol 100% wash và thêm 0.3mL Ethanol 75% trộn đều, ly tâm 5000 vòng/phút trong 4 phút
- Loại bỏ Ethanol, phơi khô nhiệt độ phòng, hòa tan DNA trong 70 àL TE(pH 8.0)
Do kinh phí hạn chế, chúng tôi đã điều chỉnh quy trình tách chiết gần giống với phương pháp của nhà phân phối, giảm khối lượng mẫu xuống một nửa và lượng hóa chất sử dụng (DNAzol và chloroform) cũng được giảm Tuy nhiên, chất lượng DNA vẫn được đảm bảo cho phản ứng PCR tiếp theo Quy trình tách chiết đã được tối ưu hóa với việc giảm khối lượng mẫu và hóa chất.
- Tiến hành thu hái mẫu: là các lá non thứ hai tính từ ngọn
- Cân lá với khối lượng m = 0.04-0.06 g bỏ vào trong eppendorf
- Phỏ vỡ màng tế bào bằng 250 àL DNAzol/ 1 mẫu nghiền mẫu
- Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 2 phút
- Chuyển dịch qua eppendorf mới (150 àL)
- Thờm vào eppendorf 250 àL chloroform, trộn đều bằng cỏch đảo ngược ống 5-10 lần, ủ 5phút ở nhiệt độ phòng
- Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút
- Sau khi ly tõm, thu nhận 150 àL phần dịch nổi phớa trờn chuyển sang eppendorf mới
- Thờm vào eppendorf 225 àL ethanol 100%, trộn đều bằng cỏch đảo ngược ống 5-10 lần, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng
- Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, 4 o C bỏ dịch nổi
- Thờm vào eppendorf 300 àL DNAzol + Ethanol 100% wash (tỷ lệ 1: 0,75) , ủ
- Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, 4 oC
- Từ từ loại bỏ phần dịch nổi, thu nhận tủa DNA ở đáy ống
- Rửa DNA bằng cỏch cho vào mỗi ống 300 àL Ethanol 70%,
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút
- Thu tủa DNA và để khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút để loại hết ethanol
- Hoà tan DNA trong 150 àL H2O và bảo quản ở -22 o C
Bảng 4.1: Kết quả đo OD khi pha loãng 2 lần (d=2):
Mẫu Kiểu hình giới tính A260 N o A260/A280
1.1 Hoa đực nhiều hơn hoa cái 1,183 59,147 1,6673
2.1 Hoa đực nhiều hơn hoa cái 1,17 58,72 1,517
3.1 Hoa đực nhiều hơn hoa cái 1,29 64,49 1,74
4.1 Hoa đực nhiều hơn hoa cái 0,941 47,03 1,696
5.1 Hoa đực nhiều hơn hoa cái 1,247 62,34 1,368
6.1 Hoa cái nhiều hơn hoa đực 0,625 31,23 1,646
7.1 Hoa cái nhiều hơn hoa đực 0,956 47,8 1,76
8.1 Hoa cái nhiều hơn hoa đực 0,97 48,7 1,8
12.1 Hoa cái và đực trung bình 2,63 131,77 1,35
13.1 Hoa cái và đực trung bình 2,8 140,13 1,72
14.1 Hoa cái và đực trung bình 2,69 134,84 1,74
15.1 Hoa cái và đực trung bình 2,25 112,65 1,74
Dựa vào bảng đo OD (bảng 4.1) cho thấy DNA có nồng độ thấp khi giảm hóa chất xuống một nửa nhưng vẫn thực hiện được PCR.
Tối ưu hóa phản ứng PCR sử dụng marker BCAT trên 15 dòng dưa leo 32 4.3 Giải trình tự đoạn gene BCAT
Theo nghiên cứu của Khin Thanda Win và cộng sự, marker Cs-BCAT được xác định trên nhiễm sắc thể số 6, liên quan đến gene F Do đó, nghiên cứu này sẽ tiến hành kiểm tra marker BCAT trên một số dòng dưa leo của Công ty TNHH Hạt giống Tân Lộc Phát, những dòng đã được biết kiểu hình giới tính.
Bảng 4.2: Nhiệt độ nóng chảy và kích thước khuếch đại của marker BCAT
Marker Trình tự mồi Nhiệt độ nóng chảy ( o C)
Sau khi tách chiết DNA từ lá non, phản ứng PCR được thực hiện với các nhiệt độ bắt cặp khác nhau trong chu trình nhiệt Nghiên cứu đã khảo sát các nhiệt độ bắt cặp 47oC, 50oC, 52oC và 54oC nhằm xác định nhiệt độ tối ưu cho cặp mồi BCAT.
Hình 4.1: Dòng 1, 2, 3, 6 ở nhiệt độ 47oC
Bảng 4.3: Chạy thử 2 mẫu trên 1số dòng đã biết kiểu hình giới tính:
Mẫu Kiểu hình giới tính Mẫu Kiểu hình giới tính 1.1 Hoa đực nhiều hơn hoa cái 3.1 Hoa đực nhiều hơn hoa cái
1.2 Hoa đực nhiều hơn hoa cái 3.2 Hoa đực nhiều hơn hoa cái
2.1 Hoa đực nhiều hơn hoa cái 6.1 Hoa cái nhiều hơn hoa đực
2.2 Hoa đực nhiều hơn hoa cái 6.2 Hoa cái nhiều hơn hoa đực
Nhiệt độ 47 oC cho ra hai sản phẩm với kích thước 160bp (gynoecious) và 216bp (monoecious), tuy nhiên, các vạch sản phẩm này mờ và có vạch ký sinh phía trên đậm hơn Do đó, chúng tôi quyết định không chọn nhiệt độ 47 oC.
Hình 4.2: Dòng 1 với nhiệt độ 50oC
Khảo sát mẫu 1.1 ở nhiệt độ 50 oC cho thấy vạch 160bp tương tự như ở 47 oC, nhưng với vạch sản phẩm rõ nét và đậm hơn Mặc dù vẫn có vạch ký sinh ở phía trên, nhưng độ mờ của nó đã giảm, cho thấy sự cải thiện trong độ mạnh của sản phẩm ở nhiệt độ cao hơn.
Hình 4.3: Dòng 1 với nhiệt độ 52oC
Khảo sát mẫu 1.1 tại nhiệt độ 52 o C cho thấy vạch 160bp tương đồng với các kết quả ở nhiệt độ 47 o C và 50 o C Tuy nhiên, vẫn còn xuất hiện vạch ký sinh ở phía trên, do đó chúng tôi quyết định tiếp tục khảo sát ở nhiệt độ 54 o C.
Hình 4.4: Chạy dòng 1 ở nhiệt độ 54 oC
Kết quả khảo sát cho thấy nhiệt độ tối ưu cho phản ứng PCR với marker BCAT là 54°C, khi không có sự xuất hiện của băng ký sinh và sản phẩm được vạch ra rõ ràng.
4.3 Giải trình tự đoạn gene BCAT
Chúng tôi đã tiến hành giải trình tự khoảng 1kb vùng gene BCAT nhằm khảo sát đặc điểm của nó Đầu tiên, chúng tôi thiết kế mồi đặc hiệu cho vùng gene BCAT như trình bày trong bảng 4.5 Sau đó, tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR theo bảng 4.4 để khuếch đại vùng gene này Cuối cùng, phản ứng PCR sẽ được giải trình tự để xác định các đặc điểm của vùng gene BCAT.
4.3.1 Tối ưu hóa phản ứng PCR để giải trình tự
Bảng 4.4: Đặt chu trình nhiệt phản ứng PCR với mồi Cs-BCAT-S:
Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian (s) Chu kỳ
Biến tính ban đầu mạch đôi DNA 98 30 1
Biến tính mạch đôi DNA 98 5
Mồi bắt cặp với mạch đơn DNA 47 5 30
Kéo dài mạch DNA lần cuối 72 60 1
Bảng 4.5: Nhiệt độ nóng chảy và kích thước khuếch đại của marker Cs-BCAT-S
Marker Trình tự mồi Nhiệt độ nóng chảy
Hình 4.5 trình bày kết quả của phản ứng PCR với mồi sequence BCAT ở nhiệt độ 47°C trên một số dòng dưa leo, trong đó dòng 1, 2, 3, 4, và 6 cho ra băng có kích thước khoảng 900bp Tuy nhiên, một số dòng dưa leo lại không cho ra sản phẩm và có nhiều sản phẩm ký sinh xuất hiện.
Vì vậy, tiến hành tăng nhiệt độ bắt cặp mồi của phản ứng PCR Kết quả hình 4.6
Khi nhiệt độ được tăng lên 54 o C trong quá trình bắt cặp mẫu để nâng cao tính đặc hiệu của phản ứng PCR, chúng tôi đã thu được sản phẩm có kích thước khoảng 900bp mà không có sản phẩm ký sinh Điều này cho thấy rằng phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự mục tiêu đã được tối ưu hóa thành công.
Chúng tôi đã áp dụng điều kiện phản ứng PCR để giải trình tự 3 dòng dưa leo toàn hoa cái và 2 dòng dưa leo có tỷ lệ hoa cái cao hơn hoa đực Sản phẩm PCR từ các dòng dưa leo này đã được gửi đến dịch vụ giải trình tự Thông tin chi tiết về các mẫu được cung cấp như sau:
- Mẫu 4.6: hoa đực nhiều hơn hoa cái (ff)
- Mẫu 14.6: hoa đực và hoa cái trung bình (ff)
- Mẫu 9.6, 10.6, 11.6: toàn hoa cái (FF)
4.3.2 Kết quả giải trình tự đoạn gene BCAT
Kết quả giải trình tự đoạn gene BCAT mục tiêu cho thấy rằng cả 3 mẫu Gynoecious (toàn hoa cái) đều có đột biến điểm và đột biến mất đoạn khi so sánh với các mẫu hoa đực Cụ thể, các đột biến bao gồm 5 đột biến thay thế nucleotide (C thành G, C thành A, T thành C, G thành C, G thành T) và 1 đột biến mất nucleotide T, cùng với 1 đột biến mất đoạn 56bp.
Kết quả giải trình tự cho thấy kích thước phản ứng PCR với marker BCAT giữa dòng dưa leo toàn hoa cái và dưa leo có nhiều hoa đực là 56bp Điều này đồng thời chỉ ra rằng một số đột biến điểm có thể đóng vai trò là dấu chứng tiềm năng trong việc chọn lọc dòng dưa leo toàn hoa cái.
Hình 4.7 trình bày kết quả giải trình tự của ba dòng dưa leo toàn hoa cái và ba dòng dưa leo có tỷ lệ hoa đực cao hơn hoa cái Các vùng gene có trình tự tương đồng giữa các dòng dưa leo được đánh dấu bằng dấu sao (*); vùng gene bị mất đoạn được tô màu vàng; trong khi đó, các vùng gene có đột biến điểm không được đánh dấu.
Thử nghiệm qui trình trên một số dòng thuần
Chúng tôi đã phát triển qui trình xác định dưa leo toàn hoa cái bằng marker phân tử BCAT Qui trình này được áp dụng để xác định kiểu gene của 15 dòng dưa leo thuần từ công ty TNHH Hạt giống Tân Lộc Phát, với một số kết quả được trình bày trong hình 4.7.
Hình 4.8: Dòng 3 (hoa đực nhiều hơn hoa cái- 216bp); dòng 11(toàn hoa cái - 160bp); dòng 12 (hoa cái và hoa đực trung bình- 160bp)
Kết quả nghiên cứu cho thấy sự tương thích giữa việc sử dụng marker BCAT và kiểu hình của các dòng dưa leo Cụ thể, dòng có số lượng hoa dực nhiều hơn hoa cái cho sản phẩm 216bp, trong khi dòng hoa cái cho vạch 160bp.
Mặc dù một số dòng dưa leo cho thấy sự tương thích giữa kiểu hình và marker, nhưng vẫn còn một số dòng chưa đạt được sự tương thích này khi sử dụng marker BCAT Do đó, chúng tôi đang tiến hành thử nghiệm với các marker khác nhằm tìm ra bộ marker có độ chính xác cao hơn trong việc sàng lọc dòng dưa leo toàn hoa cái.
