TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ CHI LUMNITZERA
Chi Lumnitzera là một chi sống trong rừng ngập mặn Theo tác giả Phạm Hoàng
Hộ [2] , ở Việt Nam chi Lumnitzera gồm hai loài là Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và Cóc trắng (Lumnitzera racemosa)
- Loài: Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và Cóc trắng (Lumnitzera racemosa)
Hai cây Cóc đỏ (Luminitzera littorea) và cây Cóc trắng (Lumnitzera racemosa) có đặc điểm giống nhau, chỉ khác ở màu cánh hoa
Cây thân gỗ cao từ 10 đến 20 mét, với vỏ màu nâu thẫm có vết nứt Mặt trong vỏ có màu nâu đỏ, phần giác màu vàng và lõi màu nâu thẫm Cành nhánh của cây có hình khúc khuỷu, vuông, khi còn non có màu đỏ nhạt và nhiều mặt do những vết sẹo của lá rụng để lại.
Lá mọc cách và tập trung ở đầu cành, có phiến lá hình trứng ngược với kích thước dài từ 2 đến 8 cm và rộng từ 1 đến 2,5 cm Mặt trên của lá bóng, đỉnh lá tròn có khía tai bèo và gốc hình nêm, ít gân Cuống lá dài từ 0,5 đến 1 cm và lá tích trữ nhiều muối.
Rễ cây có khả năng thâm nhập sâu vào lớp mùn dày, trong khi rễ khí không hình thành hệ rễ trên mặt đất như các loại cây khác Tuy nhiên, trong điều kiện ẩm ướt, rễ khí có thể phát triển thành hệ rễ vòng trên mặt đất, tạo thành những mẫu rễ nhỏ.
Cụm hoa hình chum ở đầu cành dài từ 1,5 đến 3 cm, với cuống hoa ngắn và đài hoa dài 1,5 – 2 mm Đài hoa hình ống tạo thành đĩa chứa mật, trong khi tràng hoa có 5 thùy, hình bầu dục thuôn, dài 5 – 6 mm, màu đỏ và rụng Một cặp bao hoa dạng vảy gắn vào ống đài, với nhị dài 5 – 10 cm, gấp đôi cánh hoa và nhụy hơi nhô ra khi hoa nở Vòi nhụy và đài có màu ền, bầu lô gồm 5 lá noãn hợp với noãn nhỏ dài từ 3 – 5 cm, đính noãn treo Hoa được thụ phấn chủ yếu nhờ chim, đặc biệt là chim hút mật và các loài ăn mật, cùng với sự tham gia của ong mật và ong vò vẽ.
Quả hạch có hình dạng trứng dài từ 3 đến 4 cm, với vỏ quả cứng và nhiều sự cương mô phân bố rải rác Quả non có màu nâu đỏ và khi chín sẽ rụng, thường xuất hiện vào mùa hoa vào tháng.
6 đến tháng 8, mùa quả chín vào tháng 8 đến tháng 10
Cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và cây Cóc trắng (Lumnitzera racemosa) là hai loài cây ngập mặn phân bố chủ yếu ở khu vực Châu Á và Châu Úc thuộc vùng nhiệt đới Tại Việt Nam, hai loài này thường xuất hiện ở các rừng ngập mặn ven biển, đặc biệt là ở những nơi có mức ngập triều cao hoặc ít ngập mặn như Cần Giờ, Cà Mau và Phú Quốc.
Trước năm 2001, cây Cóc đỏ đã bị khai thác quá mức bởi nhiều người dân Do thân cây Cóc đỏ khi già thường bị rỗng hoặc bị mối ăn, nên trước khi chặt cây, người dân thường kiểm tra tình trạng của nó.
Việc đục lỗ trên thân cây Cóc đỏ để kiểm tra có thể dẫn đến cái chết của cây nếu vết đục quá sâu, mặc dù nhiều cây Cóc đỏ già vẫn không bị chặt Kể từ khi Vườn Quốc Gia Phú Quốc được thành lập vào năm 2011, công tác bảo vệ rừng đã được cải thiện, giúp ngăn chặn tình trạng khai thác cây Cóc đỏ tại đây Hiện tại, Phú Quốc đang triển khai một số dự án ươm và trồng cây Cóc đỏ nhằm nhân giống và phát triển loài cây này, vì điều kiện thiên nhiên tại Phú Quốc rất phù hợp cho sự phát triển của cây Cóc đỏ.
Các quần thể loài cây như Lumnitzera littorea đang bị đe dọa do tác động của yếu tố tự nhiên và con người, dẫn đến sự thay đổi, phân mảnh và hủy diệt ngày càng gia tăng Tại Trung Quốc, loài này đã được trồng lại ở một vùng nhỏ trên đảo Hainan Ở Việt Nam, Lumnitzera littorea nằm trong sách đỏ với cấp độ bảo tồn V, và hiện đã được phát hiện tại Cần Giờ - thành phố Hồ Chí Minh, Phú Quốc, Rạch Giá – Kiên Giang, và Côn Đảo, tuy nhiên số lượng cây vẫn còn rất hạn chế.
Màu cánh hoa đẹp có tiềm năng lớn trong nghệ thuật và trang trí Gỗ của loài cây này có độ bền cao, có khả năng chịu nước và ngập mặn lâu dài, thích hợp để làm cột và cừ Ngoài ra, người dân địa phương còn sử dụng gỗ này để chế tạo công cụ lao động như cán cuốc Khi được đưa vào hầm than, gỗ cũng tạo ra nhiệt lượng cao và chứa ít NaCl, giúp bảo vệ máy móc khỏi hư hỏng.
Chiết xuất từ lá ùng có tác dụng hiệu quả trong việc chữa nấm vòm họng ở trẻ em Ngoài ra, lá ùng còn được sử dụng như một phương thuốc tự nhiên để điều trị bệnh tiêu chảy ở vùng nhiệt đới, viêm ruột và loét miệng.
Hình 1.1: Hoa của Cóc đỏ Hình 1.2: Hoa của Cóc trắng
Hình 1.4: Hoa của Cóc đỏ Hình 1.3: Hoa của Cóc trắng
Hình 1.6: Hoa của hai loài Hình 1.5: Quả của hai loài
1.1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
1.1.5.1 ây óc đỏ (Lumnitzera littorea)
In 2017, Nguyễn Thị Lệ Thủy and colleagues isolated four flavonoid compounds from Lumnitzera littore, including quercetin, quercitrin, myricetin, and myricitrin, which demonstrated the ability to inhibit the enzyme α-glucosidase.
Năm 2011, Shah u in S và cộng sự đã chứng minh rằng chiết xuất n-hexane từ lá cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) có khả năng kháng khuẩn, với khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn ở nồng độ 0.04 mg/ml.
1.1.5.2 Cây Cóc trắng ( Lumnitzera racemosa )
Năm 2013, Trần Mỹ Linh và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh hoạt tính ức chế nấm và vi khuẩn gây bệnh của ba loại thực vật ngập mặn: Aegiceras corniculatum, Avicennia marina và Lumnitzera racemosa tại vườn quốc gia Xuân Thủy, với độ dịch chiết từ 10.
Năm 1980, Majum a và Patra [11] từ lá và vỏ cây của Lumnitzera racemosa đã nhận biết được một số hợp chất như triacontanol (1), taraxerol (2), β-amyrin (3), betulin (4), β-sitosterol (5) và fridelin (6)
In 1993, Lin T.C and colleagues identified 11 tannin compounds from the leaves of Lumnitzera racemosa, including castalagin, corilagin, chebulagic acid, chebulinic acid, neochebulinic acid, 2,3-di-O-galloyl-D-glucopyranose, 1,2,3,6-terra-O-galloyl-D-glucopyranose, 2,3,4,6-O-galloyl-D-glucopyranose, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose, 2,3-(S)-HHDP-D-glucose, and punicalagin.
BỆN Đ T O ĐƯỜNG
1.2.1 Khái niệm Đái tháo đường (hay còn gọi là tiểu đường) là bệnh trạng khi lượng đường (glucose) trong máu tăng quá cao Đường là nguồn năng lượng chính của cơ thể, nhưng khi lượng đường này trong máu quá cao trong thời gian dài có thể làm tổn hại một số cơ quan trong cơ thể [15] Đường glucose này có từ các loại thức ăn gọi là car ohy rate, được phân hủy và đi vào máu Các thức ăn car ohy rate ao gồm có ánh m , cơm, khoai tây, trái cây, sữa… Tuyến tụy, một bộ phận nằm sau dạ dày, tiết ra hooc-môn gọi là insulin vào dòng máu Insulin cho phép glucose di chuyển từ máu vào các tế bào nhất định của cơ thể để chuyển hóa thành năng lượng chúng ta sử dụng năng lượng này để đi lại, nói chuyện, suy nghĩ và thực hiện nhiều hoạt động khác
Bệnh tiểu đường xảy ra khi cơ thể thiếu insulin, sản xuất không đủ insulin hoặc insulin không hoạt động hiệu quả, dẫn đến việc glucose không được chuyển ra khỏi máu.
Bệnh tiểu đường, hay còn gọi là Diabetes mellitus, là tình trạng mà người bệnh không chỉ có lượng đường cao trong máu mà còn trong nước tiểu Tên gọi này xuất phát từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là "mật ong".
Hiện nay chưa có thuốc chữa khỏi bệnh tiểu đường
Một cách tổng quát bệnh tiểu đường chia làm hai loại: bệnh đái tháo đường loại
1 và bệnh đái tháo đường loại 2
Bệnh đái tháo đường loại 1 thường xuất hiện ở trẻ em từ 10 tuổi trở lên và chiếm khoảng 10% tổng số ca bệnh Nguyên nhân chính là do cơ thể không sản xuất được insulin, do hệ thống miễn dịch nhầm lẫn tấn công các tế bào của tuyến tụy, dẫn đến tình trạng tuyến tụy không thể sản xuất insulin Khi thiếu insulin, tế bào không thể chuyển hóa glucose, gây ra tình trạng tăng cao lượng glucose trong máu.
Bệnh đái tháo đường loại 2 thường gặp ở người trên 50 tuổi, chiếm gần 90% tổng số trường hợp đái tháo đường Mặc dù cơ thể vẫn sản xuất insulin, nhưng các tế bào không nhạy cảm hoặc kém nhạy cảm với insulin, dẫn đến lượng đường trong máu không được chuyển hóa thành năng lượng và giữ ở mức cao Để đối phó, cơ thể tăng cường sản xuất insulin, gây quá tải cho tuyến tụy, và theo thời gian, lượng insulin tiết ra giảm dần Bệnh cũng có thể có nguyên nhân di truyền, làm tăng tốc độ phát triển của bệnh Nếu phát hiện sớm những người mang gen tiềm ẩn và áp dụng biện pháp phòng ngừa qua chế độ ăn uống hợp lý, bệnh có thể không xuất hiện hoặc phát triển chậm Tuy nhiên, nếu không có biện pháp phòng ngừa, bệnh sẽ tiến triển nhanh chóng.
Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 1:
Người mắc bệnh đái tháo đường loại 1 cần tiêm insulin suốt đời vì cơ thể không sản xuất hormon này Insulin có hai dạng chính: dạng tác dụng nhanh, được tiêm trước bữa ăn để điều chỉnh lượng insulin tương ứng với carbohydrate, và dạng tác dụng chậm, dùng vào buổi tối để duy trì mức đường huyết ổn định trong nhiều giờ tiếp theo.
Hiện nay, việc uống insulin dạng viên gặp khó khăn do insulin dễ bị phân hủy trong môi trường dạ dày Các nhà khoa học đang nghiên cứu bọc insulin trong vỏ nang thích hợp để thuốc có thể vượt qua dạ dày, giải phóng trong ruột non và ngấm vào máu Gần đây, insulin dạng bột đã xuất hiện, được đưa vào máu qua đường phổi và cho thấy hiệu quả rất cao sau nhiều năm nghiên cứu.
Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 2:
Tùy thuộc vào tình trạng bệnh nhân, việc điều trị bệnh tiểu đường loại 2 cần kết hợp chế độ ăn uống hợp lý và tăng cường hoạt động thể chất Bệnh nhân có thể sử dụng thuốc viên đơn lẻ hoặc kết hợp với việc tiêm insulin để giảm lượng đường huyết hiệu quả.
Thuốc sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 chủ yếu chia ba nhóm:
- Nhóm thuốc thúc tụy tạng tiết thêm insulin như nhóm sulfonylurea: gly uri e (Micronase, Diabeta, Glynase), glipizide (Glucotrol, Glucotrol XL)
- Nhóm thuốc giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn như nhóm iguani e: metformin (Glucophage, Glucophage XR, Metformin XR, nhóm thiazolidinedione: glitazone, rosiglitazone (Avandia), pioglitazone (Actos)
- Nhóm ngăn ruột bớt hấp thu chất đường khi ăn ằng chất ức chế enzyme α- glucosidase: acarbose (Precose, Glucobay), miglitol (Glyset)
Phương pháp ức chế enzyme α-glucosidase là lựa chọn hàng đầu trong điều trị đái tháo đường loại 2 nhờ vào cơ chế đơn giản và an toàn Phương pháp này chỉ tác động tại bộ phận tiêu hóa, không can thiệp vào quá trình chuyển hóa đường, không cải thiện chức năng insulin, và cũng không kích thích sản sinh insulin như các phương pháp điều trị khác.
TỔNG QUAN VỀ ENZYME α - GLUCOSIDASE
Enzyme α-glucosidase, còn được gọi là maltase, glucoinvertase, và glucosidoinvertase, là một thành viên của nhóm hydrolase, chịu trách nhiệm xúc tác các phản ứng thủy phân Các tên khác của enzyme này bao gồm glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α-D-glucosidase, transglucosidase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase và α-1,4-glucosidase.
1.3.2 ơ chế hoạt động của enzyme α – glucosidase
Carbohydrate trong thức ăn là nguồn cung cấp đường cho cơ thể Khi vào cơ thể, carbohydrate được thủy phân thành các phân tử đường đơn nhờ enzyme trong ruột non Quá trình này yêu cầu tụy tiết ra α-amylase để phân hủy carbohydrate lớn thành oligosaccharide, sau đó α-glucosidase từ màng tế bào ruột non tiếp tục phân hóa oligosaccharide thành đường đơn, cho phép chúng thẩm thấu vào máu Enzyme α-glucosidase có vai trò cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid, giải phóng α-D-glucose Kiềm chế hoạt động của enzyme này có thể giảm sự thủy giải carbohydrate và làm chậm quá trình thẩm thấu glucose vào máu.
1.3.3 Tác nhân ức chế enzyme α – glucosidase
Việc tìm kiếm các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase đóng vai trò quan trọng trong ngành dược phẩm và thực phẩm Nhiều hợp chất tự nhiên và tổng hợp đã được phát hiện với khả năng ức chế enzym này Tuy nhiên, các tác nhân hiện tại thường gây ra nhiều phản ứng phụ không mong muốn Do đó, nghiên cứu và phát triển các chất ức chế enzym α-glucosidase an toàn và hiệu quả vẫn là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học toàn cầu.
CÔNG NGHỆ BÀO CH VIÊN NANG CỨNG
1.4.1 Khái quát về thuốc viên nang:
Thuốc nang là dạng thuốc uống bao gồm một hoặc nhiều hoạt chất được bọc trong vỏ nang cứng hoặc mềm, có nhiều kiểu dáng và kích thước khác nhau Vỏ nang thường được làm từ gelatin và có thể chứa các chất phụ gia an toàn cho cơ thể Đối với thuốc nang cứng, vỏ nang bao gồm hai phần hình trụ lồng vào nhau, mỗi phần có một đầu kín và một đầu hở, trong khi thuốc bên trong thường ở dạng rắn như bột hoặc cốm.
1.4.1.2 Ƣu điểm của viên nang cứng:
Viên nang là dạng thuốc dễ uống và dễ nuốt, với màu sắc phong phú hơn so với viên nén Dược chất bên trong viên nang có thể tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau như bột, cốm, vi hạt, viên nang nhỏ, viên nén, hoặc có thể kết hợp nhiều dạng dược chất trong cùng một vỏ nang.
Sự phối hợp này giúp cách ly các thành phần tương kỵ và điều chế viên nang phóng thích kéo dài, thông qua việc kết hợp các vi hạt hoặc vi nang phóng thích thuốc tại nhiều thời điểm và vị trí khác nhau trong đường tiêu hóa một cách hiệu quả.
Viên nang là dạng thuốc dễ nghiên cứu và phát triển công thức hơn so với viên nén Chúng có khả năng sản xuất linh hoạt ở nhiều quy mô khác nhau, từ máy đóng nang thủ công cho quy mô nhỏ đến máy đóng nang tự động cho quy mô sản xuất lớn.
Viên nang có ưu điểm vượt trội về sinh khả dụng so với viên nén, nhờ vào cấu trúc không bị nén chặt, giúp viên dễ dàng rã và hấp thu hơn.
Vỏ nang được chế tạo từ nguyên liệu chính là gelatin, các chất màu, chất tạo độ đục như titan ioxy và các chất phụ gia khác
Vỏ nang cũng có thể chế tạo từ dẫn chất cellulose, loại vỏ nang này ít được sử dụng v độ tan kém và giá thành cao
1.4.2.2 Thành phần dƣợc chất trong viên nang:
Xây dựng công thức cho viên nang
Khối thuốc (hạt, bột) dùng để đóng vào nang cần đảm bảo hai tính chất cơ bản là độ trơn chảy và tính chịu nén Những thuộc tính này có thể thay đổi tùy thuộc vào thiết bị sử dụng để đóng thuốc vào nang.
Các ược chất có tính hút ẩm cao có thể làm mềm vỏ nang, trong khi các ược chất có tính kiềm hoặc axit cao có nguy cơ làm hỏng vỏ nang Để cải thiện lưu tính và khả năng chịu nén của khối thuốc, phương pháp xát hạt khô hoặc xát hạt ướt là lựa chọn hiệu quả.
Kích thước của hạt nên phù hợp để có thể đảm bảo hạt chảy đều vào nang đồng thời hạn chế được sai số khối lượng thuốc trong nang
ác tá dược thông thường dùng để điều chế khối bột gồm:
Tá dược độn, bao gồm các loại như tinh bột, lactose, và calci phosphat, có thể được sử dụng trong viên nang Các loại tinh bột dập thẳng như tinh bột tiền gelatin hóa và tinh bột phun sấy giúp cải thiện lưu tính và tính chịu nén của khối hạt.
Tá dược trơn là thành phần quan trọng giúp hạt hoặc bột chảy đều, đảm bảo hiệu suất cho các máy đóng nang Độ trơn chảy đặc biệt cần thiết khi đóng thuốc theo nguyên tắc đĩa phân liều Các tá dược trơn phổ biến bao gồm Mg stearate, talc và tinh bột bắp, giúp cải thiện quá trình sản xuất dược phẩm.
Tá dược chống dính có vai trò quan trọng trong việc tăng cường lưu tính của bột hoặc hạt, đồng thời ngăn chặn sự kết dính của bột thuốc lên các bề mặt kim loại.
Tá dược rã là thành phần quan trọng trong thuốc, đặc biệt khi không sử dụng phương pháp nén vào nang Trong các trường hợp có xát hạt hoặc nén ép, việc sử dụng tá dược rã giúp thuốc phóng thích nhanh hơn Để tối ưu hóa hiệu quả, nên lựa chọn các tá dược siêu rã, giúp tạo ra kiểu nang nhỏ gọn và hiệu quả hơn.
VẬT LIỆU VÀ P ƢƠNG P P NG ÊN ỨU
VẬT LIỆU
Lá cây Cóc đỏ trưởng thành có hình dạng trứng ngược, dài từ 3-8 cm và rộng 1-2,5 cm, mọc cách và tập trung ở đầu cành, với màu xanh đậm và ít gân Sau khi thu hoạch từ rừng ngập mặn Cần Giờ, nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, phơi khô và xay nhuyễn để tạo thành bột cây, phục vụ cho quá trình nghiên cứu.
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh Hóa thuộc Khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, diễn ra từ tháng 8/2018 đến tháng 4/2019.
2.1.3 óa chất và thiết bị
In Vietnam, various solvents are utilized across different industries, including ethanol, n-hexane, ethyl acetate, methanol, chloroform, sodium hydroxide (NaOH), and acetonitrile from Merck Additionally, formic acid and phosphoric acid are commonly used, alongside magnesium and magnesium carbonate These solvents play a crucial role in chemical processes and applications throughout the region.
- Các hóa chất sử dụng trong chạy phổ DMSO, CDCl 3 (Mesk)
- DMSO, thuốc thử Folin-Ciocalteu (Merck)
- DPPH, enzyme α- glucosi ase, acar ose, cơ chất p- Nitrophenyl-α-D- glucopyranoside ( Aldrich Sigma), cơ chất para-nitrophenyl--D-glucosidase
Hóa chất sử dụng đạt tr nh độ tinh khiết phân tích
- Cân phân tích điện tử (AA – 200)
- Cân kĩ thuật (Sartorius TE 412)
- Đèn UV hiện huỳnh quang Vilber Lourmat VL – 6.LC
- Máy đo quang phổ BioTeK
- Máy sát hạt và sửa hạt, máy trộn
- Cân sấy ẩm hồng ngoại
PHƯƠNG P P NG ÊN ỨU
2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu nghiên cứu được thu thập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, TP.HCM, và đã được giám định tên khoa học bởi TS Phạm Văn Ngọt từ trường Đại học Sư Phạm TP.HCM Sau khi thu thập, mẫu được rửa sạch, phơi khô, xay mịn và ngâm với ethanol.
2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất
Cao chiết tổng an đầu được phân bố lại trong các dung môi như hexan, ethylacetat và ethanol Sử dụng sắc ký cột để chia cao ethylacetate thành nhiều phân đoạn, từ đó tiến hành phân lập chất tinh khiết Quá trình phân lập chất tinh khiết áp dụng các kỹ thuật sắc ký cột pha thường, pha đảo, Sephadex LH-20, HPLC điều chế kết hợp với sắc ký bản mỏng.
Sắc ký bản mỏng (TLC) [6]
Sắc ký bản mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F 254 (Merck 1,05715) và RP 18 F 254s (Merck) Để phát hiện chất, có thể sử dụng đèn tử ngoại với hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc áp dụng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng, sau đó sấy khô và hơ nóng trên ếp điện từ cho đến khi xuất hiện màu.
Sắc ký cột được thực hiện trên cột thủy tinh, sử dụng silica gel pha thường và pha đảo làm chất nhồi Silica gel pha thường có kích thước hạt từ 0,040 đến 0,063 mm (240 - 430 merck), trong khi silica gel pha đảo, như sephadex LH-20, được sử dụng để phân lập các chất.
2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được thực hiện với 1 H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer tại Viện Hóa Học, thuộc Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.4 Xác định hàm lƣợng polyphenol Định lượng hợp chất polyphenol tổng số của dịch chiết an đầu theo phương pháp Folin - Ciocalteau của Aiyegoro và Okoh [18]
Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol trong dung dịch với thuốc thử Folin-Ciocalteau Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với hàm lượng polyphenol trong một phạm vi nhất định Bằng cách đo cường độ màu ở bước sóng 765 nm và sử dụng đồ thị đường chuẩn acid gallic, chúng ta có thể xác định chính xác hàm lượng polyphenol trong mẫu.
Hàm lượng polyphenol được tính theo công thức sau:
X: nồng độ polyphenol ựa trên đồ thị đường chuẩn aci gallic (mg/ml)
V: thể tích ịch chiết đem định lượng (ml)
K: hệ số pha loãng ịch chiết m: khối lượng nguyên liệu đem chiết (mg) w: độ ẩm cao (%)
2.2.5 Xác định hàm lƣợng flavonoid
Hàm lượng flavonoi của chất chiết xuất được xác định theo phương pháp tạo màu với AlCl3 ằng cách xây ựng đường chuẩn quercetin [19]
Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid dựa vào khả năng tạo phức màu mạnh của flavonoid với ion kim loại, trong đó Al3+ thường được sử dụng do tính chất không độc hại và khả năng tạo phức màu hiệu quả Cường độ màu của hỗn hợp có mối liên hệ tỉ lệ thuận với hàm lượng flavonoid, cho phép xác định hàm lượng này thông qua việc đo cường độ màu ở bước sóng 425 nm và so sánh với đồ thị chuẩn của quercetin.
Hàm lượng flavonoi được tính theo công thức sau:
F(%w/w khô ) Trong đó: a: nồng độ flavonoi ựa vào phương tr nh đường chuẩn (mg/ml)
V: thể tích ịch lọc đem phân tích (ml) k: độ pha loãng m: khối lượng mẫu an đầu (mg) w: độ ẩm cao (%)
2.2.6 Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme α - glucosidase
Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme α-glucosidase được thực hiện theo phương pháp của Apostoli et al (2007) bằng cách sử dụng p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosi (pNPG) làm cơ chất Khi enzyme α-glucosidase thủy phân pNPG, nó chuyển hóa thành α-D-glucose và p-nitrophenol (pNP), cho phép đánh giá hiệu quả ức chế hoạt tính của cao chiết.
Hình 2.1:Phản ứng thủy phân p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosi ởi enzyme α-glucosidase
Hoạt tính ức chế α-glucosi ase được tính ằng phương tr nh sau:
A control là chất hấp thụ của tất cả các thành phần ngoại trừ chiết xuất từ lá
A sample là sự hấp thụ của tất cả các thành phần ao gồm các chiết xuất lá
2.2.7 Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa
Năm 1922, Golschmidt và Renn đã phát hiện ra gốc tự do DPPH• (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), một gốc tự do màu tím đậm, không phân hủy, không nhị trùng hóa và không phản ứng với oxy DPPH• có màu tím tương tự như dung dịch KMnO4, không tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH• có cực đại hấp thụ tại bước sóng 517 nm, trong khi sản phẩm khử của nó, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H), có màu vàng cam.
Ngày nay, DPPH được sử dụng rộng rãi để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này nổi bật nhờ tính hiệu quả, đơn giản, nhanh chóng và ổn định.
Các chất kháng oxi hóa có khả năng trung hòa gốc DPPH• bằng cách cung cấp hydrogen, từ đó làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu sắc của dung dịch phản ứng.
DPPH• là một gốc tự do mà khi phản ứng với các chất kháng oxy hóa sẽ chuyển từ màu tím sang vàng nhạt, thể hiện quá trình trung hòa Phản ứng này minh họa rõ ràng khả năng của các chất kháng oxy hóa trong việc loại bỏ gốc tự do, góp phần bảo vệ sức khỏe.
Hình 2.2: Cơ chế kháng oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa được tính theo công thức:
% Ức chế gốc tự do = 100%
OD o là giá trị OD chứng : mật độ quang của dung dịch DPPH • và MeOH
OD t là giá trị OD thử : mật độ quang của DPPH • và mẫu thử
2.2.8 Phương pháp khảo sát đặc tính của khối bột thuốc và đo độ rã của viên nang:
Đo độ ẩm của khối bột thuốc được thực hiện bằng cân sấy ẩm hồng ngoại, sử dụng mẫu có khối lượng khoảng 3 g Quá trình sấy diễn ra ở nhiệt độ 105 oC với tốc độ đạt độ ẩm tới hạn là 0,01 %/phút.
- Khảo sát sự phân bố cỡ hạt:
Cân 50g bột thuốc và sử dụng bộ rây với các kích thước 0,45 mm, 0,3 mm và 0,2 mm Lắc đều trong 5 phút, sau đó cân trọng lượng bột còn lại trên mỗi rây để vẽ đường phân bố kích thước hạt.
- Xác định tỷ trọng biểu kiến trước và sau khi gõ:
Xác định tỷ trọng biểu kiến trước khi gõ (tỷ trọng thô) và tỷ trọng biểu kiến sau khi gõ (tỷ trọng vỗ) theo công thức sau:
: Tỷ trọng biểu kiến của hạt
V b : Thể tích biểu kiến của hạt
Tỷ trọng biểu kiến sau khi gõ xác định theo USP30 trên máy đo tỷ trọng biểu kiến Pharma test touch
- Xác định lưu tính của hạt: đo góc chảy
Cân 50g bột thuốc, đổ hạt chảy liên tục để tạo thành khối chóp và xác định góc nghỉ α biết:
Trong đó: h: chiều cao khối ột r: án kính đáy của khối ột
Hình 2.3: Phương pháp xác định góc nghỉ của bột, hạt thuốc
2.3.2 Khảo sát tiêu chuẩn chất lƣợng lá óc đỏ
2.3.2.1 Khảo sát các tính chất hóa lý
Mục đích: Phân tích, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu
Sau khi thu hái, lá Cóc đỏ được phân loại, rửa sạch và bảo quản cẩn thận Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu hóa lý theo phương pháp đã được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1: Phương pháp khảo sát thành phần và tính chất nguyên liệu
Chỉ tiêu Phương pháp Độ ẩm (%) Sấy đến khối lượng không đổi
Hàm lượng chất khô hòa tan (%) Sử dụng Brix kế
Hàm lượng tro tổng (%w/w khô) Nung ở 550 - 600 0 C đến khối lượng không đổi Hàm lượng đường khử, đường tổng (%) Phương pháp Bertrand
1 Sắc ký cột Silica gel
1 Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
2 Khảo sát cấu trúc hóa học Hợp chất hoạt tính sinh học
Nguyên liệu (Lá Cóc đỏ)
Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ nghiên cứu
2.3.2.2 Xác định hàm lƣợng polyphenol
K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN
K T QUẢ KHẢO SÁT TIÊU CHUẨN CHẤT LƢỢNG L Ó ĐỎ
3.1.1 Kết quả thành phần hóa lý của nguyên liệu
Khảo sát các tính chât cơ ản của nguyên liệu an đầu, ta thu được các thông số cơ bản của lá Cóc đỏ như bảng 3.1 sau:
Bảng 3.1:Kết quả khảo sát thành phần và tính chất của nguyên liệu
Lá Cóc đỏ có hàm lượng ẩm cao lên đến 77,60%, do đó cần được bảo quản đúng cách sau khi thu hoạch để tránh bị ảnh hưởng bởi vi sinh vật và nấm mốc Để đảm bảo chất lượng, lá Cóc đỏ nên được phơi khô để loại bỏ độ ẩm hoặc bảo quản trong môi trường lạnh.
Hàm lượng tro tổng trong lá Cóc đỏ đạt 5,85%, cho thấy lá có hàm lượng khoáng chất cao, cung cấp đầy đủ và chất lượng cho cơ thể Ngoài ra, nguyên liệu này còn chứa đường tổng và đường khử, mang lại vị ngọt nhẹ, nâng cao chất lượng cảm quan và cung cấp một phần năng lượng cho cơ thể.
3.1.2 Kết quả định lƣợng hợp chất có hoạt tính sinh học trong nguyên liệu
Để điều chế cao từ 100 g bột sung, thực hiện theo sơ đồ 2.2 Kết quả định lượng hợp chất polyphenol và flavonoid được trình bày trong bảng 3.2, với chỉ tiêu độ ẩm đạt 77,60%.
Hàm lượng chất khô toàn phần (%) 22,40
Hàm lượng tro tổng (%w/w khô) 5,85
Bảng 3.2: Kết quả định lượng hợp chất có hoạt tính sinh học
Mẫu thí nghiệm àm lƣợng hợp chất có hoạt tính sinh học Polyphenol (%)
Lá Cóc đỏ chứa hàm lượng polyphenol cao, giúp tăng cường khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn Polyphenol là một trong những hoạt chất chính, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân gây hại.
Sau khi xác định hàm lượng polyphenol, tiến hành xác định hàm lượng flavonoid dựa trên đường chuẩn quercetin Đồ thị đường chuẩn quercetin được xây dựng từ mối quan hệ giữa nồng độ quercetin (mg/ml) và giá trị OD tại 425 nm.
Hàm lượng flavonoid cao trong lá Cóc đỏ cho thấy đây là nguồn dược liệu quý giá Flavonoid là nhóm hoạt chất lớn, nổi bật với các hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme.
3.1.3 Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α -glucosidase
Bảng 3.3: Kết quả khả năng ức chế enzyme α-glucosi ase của cao chiết ao chiết Nồng độ (àg/ml) IC 50
G iá trị được biểu diễn bằng giá trị trung bình ±
SD (-) Giá trị tỷ lệ ức chế (%I) < 1
Kết quả trong bảng 3.3 cho thấy rằng nồng độ cao chiết xuất từ phân đoạn cao tổng và các phân đoạn n-hexan, ethyl acetate, methanol từ lá cây Cóc đỏ có sự tương quan đáng chú ý.
Khi nồng độ chiết xuất tăng từ 0,1 àg/ml đến 1,0 àg/ml, khả năng ức chế enzyme α-glucosidase cũng tăng lên đáng kể Cụ thể, cao chiết tổng hợp cho thấy khả năng ức chế tăng từ 99,12% đến trên 100% với giá trị IC50 dưới 0,1 Tương tự, cao chiết n-hexan tăng từ 37,37% đến trên 100% với IC50 là 0,21; cao chiết ethyl acetate từ 5,34% đến trên 100% với IC50 là 0,53; và cao chiết methanol tăng từ 78,00% đến trên 100% với IC50 dưới 0,1.
Khi nồng độ chiết xuất từ lá cây Cóc đỏ tăng, hàm lượng các hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase cũng gia tăng, dẫn đến hoạt tính của enzyme này giảm Điều này thể hiện qua việc enzyme α-glucosidase khi xúc tác với cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside tạo ra p-nitrophenol với hàm lượng thấp, cho thấy giá trị mật độ quang giảm và phần trăm ức chế enzyme cao Ngược lại, khi nồng độ chiết xuất thấp, lượng hoạt chất ức chế không đủ, khiến enzyme α-glucosidase tạo ra p-nitrophenol nhiều hơn, dẫn đến mật độ quang cao và phần trăm ức chế enzyme thấp.
Nồng độ cao chiết xuất từ lá cây Cóc đỏ, bao gồm các cao phân đoạn n-hexan, ethyl acetate và methanol, tỷ lệ thuận với khả năng ức chế hoạt tính enzyme α-glucosidase.
3.1.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa
Sau khi điều chế cao chiết từ quả sung, chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết này bằng phương pháp đánh giá gốc tự do DPPH Kết quả cho thấy khả năng kháng oxy hóa của cao chiết quả sung đáng kể, cho thấy tiềm năng ứng dụng của nó trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe.
Kết quả kháng oxy hóa của cao chiết cồn
Bảng 3.4:Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao cồn
% ức chế gốc tự do
Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH cho thấy rằng khi nồng độ mẫu tăng, khả năng kháng oxy hóa cũng tăng theo Quả sung chứa polyphenol, một hợp chất có khả năng kháng oxy hóa, do đó khi nồng độ chiết xuất tăng, khả năng kháng oxy hóa cũng gia tăng Cụ thể, tại nồng độ 75 µg/ml, phần trăm ức chế gốc tự do đạt được kết quả cao.
40 tự o là thấp nhất (28,50%) và tại nồng độ 175 àg/ml th phần trăm ức chế gốc tự o là cao nhất (48,61%).
CÔ LẬP HỢP CHẤT TỪ O P ÂN ĐOẠN C
Lá Cóc đỏ từ huyện Cần Giờ đã được nghiên cứu và xác định được sáu hợp chất chính, bao gồm LE01, LE02, LE03 thuộc nhóm flavonoid, và LE04, LE05, LE06 thuộc nhóm triterpenoid.
3.2.1 iện luận cấu trúc của hợp chất LE01
Hợp chất LE01 được cô lập từ phân đoạn C2 (sơ đồ 2.2) Tính chất vật lý của hợp chất này được mô tả như sau:
- Chất rắn vô định hình, màu vàng (10 mg)
Kết quả từ sắc ký lớp mỏng cho thấy sự xuất hiện của một vết vàng có hệ số lưu Rf 0.68, khi mẫu được giải ly bằng dung môi gồm ethyl acetate, methanol, nước và axit acetic theo tỷ lệ 40:1:1:1 Vết này được hiện hình bằng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
- Dữ liệu phổ 1 H, 13 C NMR (DMSO–d 6 ) (Phụ lục 1 và 2) bảng 3.5
Thảo luận cấu trúc hóa học
Dựa vào phổ cộng hưởng từ hạt nhân, hợp chất LE01 được xác định là một flavonoid
Dữ liệu phổ 1 H-NMR cho thấy tín hiệu mũi đơn tại độ dịch chuyển δ H 12.49 (1H, s) của nhóm -OH kiềm tại vị trí C-5 Ngoài ra, có hai tín hiệu proton mũi đôi ghép meta tại δ H 6.18 (1H, d, 2.0 Hz) và 6.37 (1H, d, 2.0 Hz) tương ứng với H-6 và H-8 trong vòng A của 5,7-dihydroxyflavonoid Thêm vào đó, tín hiệu tại δ H 7.24 (2H, s) đặc trưng cho nhóm 3,4,5– trisubstituted phenyl đối xứng Những tín hiệu này cho thấy hợp chất đang được xác định là myricetin.
Dữ liệu phổ 13 C-NMR của LE01 cho thấy có 13 tín hiệu khác nhau, bao gồm một tín hiệu carbonyl tại vị trí δ C 175.8 (C-4), sáu tín hiệu carbon sp² gắn dị nguyên tố tại các vị trí δ C 163.9 (C-7), 160.8 (C-5), 156.1 (C-9), 146.9 (C-2), 135.9 (C-3, 4) và 145.8 (C-3, 5) Bên cạnh đó, còn có 3 tín hiệu methine carbon tại δ C 107.2 (C-2, 6), 98.2 (C-6) và 93.2 (C-8), cùng với 2 tín hiệu carbon bậc IV tại δ C 103.0 (C-10) và 120.8 (C-1).
Từ các dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR của hợp chất LE01, khi so sánh với tài liệu tham khảo [20] , chúng tôi đề nghị đây là cấu trúc của myricetin
Hình 3.1: Công thức cấu tạo của Myricetin (LE01)
Bảng 3.5:Dữ liệu phổ NMR của hợp chất LE01 và myricetin
LD01 (DMSO-d 6 ) Myricetin (DMSO-d 6 ) δ H , J (Hz) δ C δ H , J (Hz) δ C
3.2.2 iện luận cấu trúc của hợp chất LE02
Hợp chất LE02 được cô lập từ phân đoạn C3.1 (Sơ đồ 2.2) Tính chất vật lý của hợp chất này được mô tả như sau:
- Chất rắn vô định hình, màu vàng (25 mg)
Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy sự xuất hiện của một vết vàng có hệ số lưu Rf 0.71, khi sử dụng dung môi ethyl acetate–methanol–nước–acetic acid theo tỷ lệ 40:1:1:1, và được hiện hình bằng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
- Dữ liệu phổ 1 H, 13 C-NMR (DMSO–d 6 ) (Phụ lục 3 và 4) bảng 3.6
Thảo luận cấu trúc hóa học
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR của hợp chất LE01 và LE02 tương tự nhau, nhưng LE01 có 2 proton đối xứng trên vòng B, trong khi LE02 cho thấy 3 tín hiệu tại δ H 7.67 (1H, d, 2.0 Hz), 7.54 (1H, dd, 2.0 Hz, 8.5 Hz) và 6.88 (1H, d, 8.5 Hz).
Dữ liệu phổ 13 C NMR của LE02 cho thấy có tổng cộng 15 tín hiệu, bao gồm một tín hiệu của nhóm carbonyl tại vị trí δC 175.9 (C-4) Ngoài ra, có bảy tín hiệu carbon sp² gắn dị nguyên tố tại các vị trí δC 164.0 (C-7), 161.0 (C-5), 156.2 (C-9), 146.8 (C-2), 135.8 (C-3), 147.7 (C-4), và 145.1 (C-3) Bên cạnh đó, còn có 5 tín hiệu methine carbon tại các vị trí δC 93.4 (C-8) và 98.2 (C-6).
120.0 (C-6), và 115.6 (C-5), 115.1 (C-2), và 2 tín hiệu carbon bậc IV tại C 103.0 (C-10) và 122.0 (C-1)
Từ các dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR của hợp chất LE02, khi so sánh với tài liệu tham khảo [21] , cho thấy rằng đây là cấu trúc của quercetin
Bảng 3.6: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất LE02 và quercetin
Hình 3.2:Công thức cấu tạo của Quercetin (LE02
3.2.3 iện luận cấu trúc của hợp chất LE03
Hợp chất LE03 cô lập từ phân đoạn C3.2 (Sơ đồ 2.2) Tính chất vật lý của hợp chất này được mô tả như sau:
- Chất rắn vô định hình, dạng bột, màu vàng (25 mg)
Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy sự xuất hiện của một vết vàng với hệ số lưu Rf là 0.22 Vết này được giải ly bằng hệ dung môi chloroform–methanol–nước theo tỷ lệ 70:30:5 và được hiện hình bằng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
- Dữ liệu phổ 1 H, 13 C-NMR (DMSO–d 6 ) (Phụ lục 5 và 6) bảng 3.7
Thảo luận cấu trúc hóa học
Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất LE03 cho thấy cấu trúc flavonoid tương tự như hợp chất LE02 Cụ thể, trên phổ 1H-NMR, tín hiệu proton anome tại vị trí δH 5.25 (1H, d, 1.5 Hz, H-1), bốn tín hiệu proton của nhóm CH-OH trong khoảng 3.1–4.0 ppm, cùng với một tín hiệu methyl tại vị trí δH 0.82 (3H, d, 6.0 Hz, H-6), chỉ ra sự hiện diện của một đường rhamnose.
Dữ liệu phổ 13 C-NMR cho thấy hợp chất LE03 có 21 tín hiệu carbon, bao gồm các giá trị δ C như 177.7 (C-4), 164.4 (C-7), 161.2 (C-5) và nhiều tín hiệu khác liên quan đến đường rhamnose Tín hiệu carbon anome xuất hiện ở vùng từ trường cao hơn với δ C 101.9, cho thấy rằng LE03 là một hợp chất flavonoid có gắn nhóm O–glycosyl.
Từ các dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR của hợp chất LE03, khi so sánh với tài liệu tham khảo [22] , cho thấy rằng đây là cấu trúc của quercitrin
Hình 3.3: Hình công thức cấu tạo của Quercitrin (LE03)
Bảng 3.7: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất LE03 và quercitrin
3.2.4 iện luận cấu trúc của hợp chất LE04
Hợp chất LE04 cô lập từ phân đoạn C4.1 (Sơ đồ hình 2.4)
Dữ liệu phổ 1 H, 13 C-NMR (DMSO–d 6 ) (Phụ lục 7 và 8)
Thảo luận cấu trúc hóa học
Trên phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), (ppm): 0.76 (3H, s, H-24); 0.82 (3H, s, H-26); 0.97 (3H, s, H-23); 0.98 (3H, s, H-27), 1.02 (3H, s, H25); 1.68 (3H, s, H-30); 2.39 (1H, dt, J = 11 và 5,5 Hz, H-19); 3,19 (1H, dd, J = 11 và 4,5 Hz, H-3); 3,32 (1H,
45 dd, J = 11 và 5 Hz, H-28); 3,81 (1H, dd, J = 11,5 và 3,5 Hz, H-28); 4,58 (1H, br s, H- 29); 4,68 (1H, br s, H-29)
Dữ liệu phổ 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) d(ppm): 150.6(C-20), 109.8(C-29), 79.1 (C-3), 60.7 (C-28), 55.5 (C-5), 50.6 (C-9), 48.9 (C-18), 47.9 (C-19, C-17), 42.9 (C-14), 41.1 (C-8), 39.0 (C-1), 38.9 (C-4), 37.5 (C-10), 37.3 (C-13), 34.4 (C-7), 34.1 (C-22), 29.9 (C-21), 29.3 (C16), 28.1 (C-23), 27.6 (C-2), 27.2 (C-15), 25.4 (C-12), 21.0 (C-11), 19.2 (C-30), 18.5 (C-6), 16.3 (C-25), 16.1 (C-26), 15.5 (C-24) và 14.9 (C-27)
Từ các dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR của hợp chất LE04 cho thấy rằng đây là cấu trúc của Betulin
Hình 3.4: Công thức cấu tạo của Betulin (LE04)
3.2.5 iện luận cấu trúc của hợp chất LE05
Hợp chất LE05 cô lập từ phân đoạn C4.2 (Sơ đồ hình 2.4)
Dữ liệu phổ 1 H, 13 C-NMR (DMSO–d 6 ) (Phụ lục 9 và 10)
Thảo luận cấu trúc hóa học
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) d(ppm): 4.74 (brs, H-29a), 4.61 (brs,H-29b), 3.19 (dd,11.0,4.5Hz, H-3), 3.00 (m, H19), 1.69 (s, H-30), 0.98 (s, H-26), 0.96 (s, H-27), 0.93 (s, H-23), 0.82 (s, H-25) và 0.75 (s, H-24)
13C-NMR (125MHz, CDCl3) d(ppm): 180.5 (C-28), 150.6 (C20), 109.8 (C-29), 79.2 (C-3), 56.5 (C-17), 55.5 (C-5), 50.7 (C-9), 49.4 (C-19), 47.1 (C-18), 42.6(C-14), 40.9 (C-8), 39.0 (C-4), 38.9 (C-1), 38.6 (C-13), 37.4 (C-10), 37.2 (C-22), 34.5 (C-7), 32.3 (C-16), 30.7 (C-15), 29.9 (C-21), 28.1 (C-23), 27.6 (C-2), 25.7 (C-12), 21.0 (C11), 19.5 (C-30), 18.4 (C-6), 16.3 (C-26), 16.2 (C-25), 15.5 (C-24) và 14.9 (C-27)
Từ các dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR của hợp chất LE05 cho thấy rằng đây là cấu trúc của Betulinic acid
Hình 3.5:Công thức cấu tạo của Betulinic acid (LE05)
3.2.6 iện luận cấu trúc của hợp chất LE06
Hợp chất LE06 cô lập từ phân đoạn C4.3 (Sơ đồ hình 2.4)
Dữ liệu phổ 1 H, 13 C-NMR (DMSO–d 6 ) (Phụ lục 11 và 12)
Thảo luận cấu trúc hóa học
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) d(ppm): 4.68 (brs, H-29a), 4.56 (brs, H-29b), 3.18 (dd, 11.5, 5.0 Hz, H-3), 1.68 (s, H-30), 1.03 (s, H-26), 0.96 (s, H-23), 0.94 (s, H-27), 0.83 (s, H-25), 0.79 (s, H-28) and 0.76 (s, H-24)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3) d (ppm): 151.1 (C-20), 109.5 (C-29), 79.1 (C-3), 55.5 (C-5), 50.6 (C-9), 48.5 (C-18), 48.1 (C-19), 43.1 (C14), 43.0 (C-17), 41.0 (C-8), 40.2 (C-22), 39.0 (C-4), 38.9 (C-1), 38.2 (C-13), 37.3 (C-10), 35.7(C-16), 34.4 (C-7), 30.0 (C-21), 28.1 (C-23), 27.6 (C-2,C-15), 25.3 (C-12), 21.1 (C-11), 19.5 (C-30), 18.5 (C-6), 18.2 (C28), 16.3 (C-25), 16.1 (C-26), 15.5 (C-24) và 14.7 (C27)
Từ các dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR của hợp chất LE06 cho thấy rằng đây là cấu trúc của lupeol
Hình 3.6: Công thức cấu tạo của Lupeol (LE06)
Bảng 3.8: Dữ liệu phổ 1 H-NMR của hợp chất LE04, LE05 và LE06
Bảng 3.9: Dữ liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất LE04, LE05 và LE06
LE04 LE05 LE06 δ C (ppm) δ C (ppm) δ C (ppm) δ C (ppm) δ C (ppm) δ C (ppm)
K T QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CH ENZYME α-
GLUCOSIDASE CỦA CÁC CHẤT CÔ LẬP ĐƢỢC
Bảng 3.10:Kết quả hoạt tính chống lại α-glucosidase của các hợp chất cô lập ợp chất
Nồng độ (àg/ml) IC 50
LE03 28,27 ± 0,88 43,11 ± 0,43 53,71 ± 0,27 74,91 ± 0,98 89.40 0.65 7,74 ợp chất Nồng độ (àg/ml) IC50
Các hợp chất cô lập từ Lumnitzera littorea đã được nghiên cứu về khả năng ức chế enzyme α-glucosidase Kết quả cho thấy hầu hết các hợp chất này có hiệu quả ức chế tốt hơn so với acarose, một chất kiểm soát dương tính.
Các hợp chất flavonoid cho thấy khả năng ức chế enzym α-glucosidase mạnh mẽ hơn so với các hợp chất triterpenoid Sự hiện diện của hai nhóm 7-OH và 4’-OH đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính ức chế, với giá trị IC50 của quercetin đạt 3,42 µg/l Ngược lại, sự hiện diện của nhóm 5’-OH và 3-OH làm giảm hoạt tính ức chế của myricetin.
K T QUẢ KHẢO SÁT CÔNG THỨC VIÊN NANG CHỨA CAO CÓC ĐỎ
Bảng 3.11: Công thức thiết kế tối ƣu viên nang
3.4.1 Lựa chọn hàm lƣợng cao óc đỏ
Bảng 3.12:Độ ẩm công thức tối ưu
Lần đo 1 Lần đo 2 Lần đo 3 Trung bình
Theo kết quả từ bảng 3.12, công thức có hàm lượng cao 50% của Cóc đỏ cho thấy độ ẩm trung bình đạt > 5% (4,55%) Do đó, hàm lượng cao 50% này đáp ứng được tiêu chuẩn độ ẩm quy định.
3.4.2 Lựa chọn hàm lƣợng tá dƣợc hút
Bảng 3.13: Độ ẩm các công thức tối ưu
Lần đo 1 Lần đo 2 Lần đo 3 Trung bình
Khi sử dụng hàm lượng MgCO3 là 15%, công thức đạt độ ẩm trung bình ≤ 5% (4.78%) Do đó, với hàm lượng MgCO3 15%, chúng tôi đã thiết kế công thức đảm bảo độ ẩm quy định cho viên nang.
Bảng 3.14: Góc chảy công thức viên nang tối ưu được khảo sát h r tgα α
Nhận xét: Công thức khảo sát có góc chảy tốt, phù hợp để đóng nang
Bảng 3.15: Tỷ trọng biểu kiến của công thức khảo sát
V tvđ (ml) V svđ (ml) d tvđ (g/ml) d svđ (g/ml)
Nhận xét: Công thức khảo sát có tỷ trọng sau va đập 0,75
Bảng 3.16: Phân bố cỡ hạt của công thức khảo sát
Nhận xét: Dựa vào kết quả phân bố cỡ hạt của công thức có tỷ lệ hạt mịn nhỏ (< 20%) và phân bố cỡ hạt phù hợp cho đóng nang
Công thức đưa ra có thời gian rã 7.5 phút, đạt yêu cầu về độ tan rã của viên nang theo DĐVN IV
Từ các kết quả trên thì công thức đưa ra (Bảng 3.11) phù hợp cho viên nang chứa cao Cóc đỏ
3.4.7 Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật viên nang chứa cao óc đỏ
Công thức pha chế cho một viên nang:
Tá ược vừa đủ 1 viên
Cao Cóc đỏ Đạt tiêu chuẩn cơ sở
Tá ược A Đạt tiêu chuẩn
Tá ược B Đạt tiêu chuẩn
Magnesi carbonate Đạt tiêu chuẩn cơ sở
Talc Đạt tiêu chuẩn USP 27
Povidon K30 Đạt tiêu chuẩn USP 27
Cồn 96% Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
- Tính chất: Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt Bột thuốc trong nang màu nâu đen, vị đắng hơi ngọt, mùi đặc trưng
- Độ đồng đều khối lƣợng: ± 7,5% so với khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang
- Độ tan rã: không quá 30 phút
K T QUẢ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT TRÀ HÒA TAN
3.5.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình sao đến chất lượng trà
Lá Cóc đỏ được thu hái, rửa sạch, phơi khô và nghiền nhỏ đồng nhất kích thước Nghiên cứu đã khảo sát quá trình xử lý ở các nghiệm thức nhiệt độ và thời gian khác nhau, cho kết quả như bảng 3.17.
Bảng 3.17: Kết quả đánh giá cảm quan quá tr nh sao đến chất lượng trà
(* Trong cùng một cột, các số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức 0.05 qua phép thử Duncan)
Qua các thí nghiệm trích xuất, sự khác biệt về giá trị cảm quan của sản phẩm được thể hiện rõ Ở nhiệt độ 80°C trong 10 phút, sản phẩm đạt giá trị cảm quan tốt nhất với màu vàng nâu và hương thơm tự nhiên của lá Cóc đỏ, cùng hậu vị chát nhẹ Ngược lại, khi trích xuất ở các nhiệt độ 60°C, 70°C hoặc trong thời gian dưới 10 phút ở 80°C, sản phẩm có màu vàng nhạt và hương vị kém hơn Đặc biệt, khi trích xuất ở nhiệt độ 90°C, sản phẩm có màu tối và mùi cháy nhẹ, cho thấy rằng điều chỉnh nhiệt độ và thời gian là rất quan trọng để tối ưu hóa chất lượng sản phẩm.
Quá trình sao là quá trình truyền nhiệt từ thiết bị đến lá Cóc đỏ, giúp tăng cường màu sắc và hương vị cho sản phẩm chiết ly, đồng thời giảm lượng ẩm có trong lá và tiêu diệt vi sinh vật.
Khi sao mẫu ở nhiệt độ thấp trong thời gian ngắn, các phản ứng tạo màu và hợp chất hương diễn ra ở mức độ thấp, dẫn đến sản phẩm có màu nâu nhạt và hương thơm nhẹ Ngược lại, nếu sao ở nhiệt độ cao trong thời gian ngắn hoặc nhiệt độ thấp trong thời gian dài, các phản ứng tạo màu và tạo hương sẽ diễn ra mạnh mẽ hơn.
Khi thực hiện quá trình sấy ở nhiệt độ cao và trong thời gian dài, các phản ứng tạo màu và mùi cho sản phẩm diễn ra mạnh mẽ, điều này có thể dẫn đến tình trạng cháy khét sản phẩm.
Từ những kết quả trên thông số tối ưu được chọn cho quá trình sao là 80 0 C trong
3.5.2 Kết quả khảo sát các ảnh hưởng đến quá trình trích ly
Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly bột nguyên liệu, chúng tôi đã thu được những kết quả đáng chú ý.
3.5.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu (bột lá óc đỏ): nước
Sau khi tiến hành khảo sát thí nghiệm tỉ lệ nguyên liệu và ung môi trích ly ở nhiệt độ 70 0 C trong vòng 60 phút, kết quả thu được theo như ảng 3.18
Bảng 3.18: Kết quả tỷ lệ nguyên liêu: nước ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly
Stt Tỷ lệ óc đỏ: nước
Các giá trị được trình bày là giá trị trung bình từ ba lần lặp lại của kết quả thống kê Sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm đã được xác định qua phân tích thống kê Trong cùng một cột, các số có cùng ký tự cho thấy không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05% theo phép thử Duncan.
Kết quả thống kê cho thấy tỉ lệ nguyên liệu và dung môi ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thu hồi hàm lượng chất khô Cụ thể, khi tăng tỉ lệ nguyên liệu và dung môi từ 10/20 đến 10/90, hiệu suất thu hồi chất khô cũng tăng lên từ 16,66% đến 40,77%.
Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi ảnh hưởng lớn đến sự chênh lệch giữa các cấu tử trong nguyên liệu Khi tỉ lệ dung môi là 10/20, lượng dung môi quá ít không đủ để hòa tan các hợp chất, dẫn đến hiệu suất thu hồi chất khô chỉ đạt 16,66% Ngược lại, tỉ lệ 10/90 cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong khả năng hòa tan.
54 thu được 40,77 % đây là tỉ lệ nguyên liệu và ung môi hòa tan hầu như hoàn toàn chất khô trong nguyên liệu ra ngoài ung môi
Khi tỉ lệ tăng lên 10/100, hiệu suất thu hồi chất khô giảm xuống còn 23,7% Mặc dù tổng hàm lượng chất khô không thay đổi và sử dụng cùng một loại chất khô, nhưng tổng thể tích dung môi khác nhau dẫn đến hiện tượng pha loãng Tỉ lệ cao hơn có thể khiến các thành phần chất tan bị phân ly và phân hủy, từ đó làm giảm hiệu suất thu hồi chất khô.
V vậy tỉ lệ nguyên liệu 10/90 được chọn là thông số tối ưu để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo
3.5.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly
Sau khi tiến hành khảo sát thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly trong vòng
60 phút và tỉ lệ nguyên liệu ung môi là 1/90 được chọn ở thí nghiệm 1 kết quả thu được như ảng 3.19 sau:
Bảng 3 19: Kết quả nhiệt độ ảnh hưởng hiệu suất trích ly
(*)Các giá trị được thể hiện theo giá trị trung bình của kết quả thống kê 3 lần lặp lại
Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm được xác định qua thống kê Các số trong cùng một cột có cùng mẫu tự không cho thấy sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05% khi áp dụng phép thử Duncan.
Các hợp chất sinh học có trong nguyên liệu rất nhạy cảm với nhiệt độ và dễ bị phân hủy trong quá trình trích ly Do đó, cần hạn chế tối đa các yếu tố ảnh hưởng đến sự thu nhận các hợp chất này.
Kết quả cho thấy, ở nhiệt độ 40 o C, hàm lượng chất khô thu được là 34,83% Khi tăng nhiệt độ từ 40 o C đến 60 o C, hiệu suất trích ly tăng, với hàm lượng chất khô cao nhất đạt 40,10% ở 60 o C, có sự khác biệt rõ rệt so với các nghiệm thức ở 70 o C, 80 o C và 90 o C Tuy nhiên, từ 70 o C trở đi, hiệu suất trích ly bắt đầu giảm.
Quá trình trích ly chịu ảnh hưởng lớn từ thời gian và nhiệt độ Khi nhiệt độ cao, nếu thời gian kéo dài, các chất trong nguyên liệu sẽ bị phân hủy nhiều, đặc biệt là những chất không bền với nhiệt Ngược lại, nếu thời gian quá ngắn, các chất trong nguyên liệu sẽ không đủ thời gian để khuếch tán vào dung môi.
Theo bảng kết quả thống kê 3.19, nghiệm thức 60 o C đạt hiệu suất trích ly cao nhất và có sự khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức khác Vì vậy, nghiệm thức 60 o C được chọn làm thông số tối ưu cho thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly, và kết quả này sẽ được áp dụng cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.2.3 Kết qủa khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi hàm lƣợng chất khô trong dịch chiết
Sau khi tiến hành khảo sát thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian trích ly ở nhiệt độ
60 o C được chọn và tỉ lệ nguyên liệu ung môi là 10/90, kết quả thu được như ảng 3.20:
Bảng 3.20: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly
