Sàng lọc bacillus có khả năng kháng nấm gây bệnh rụng lá và bệnh nấm hồng trên cây cao su nghiên cứu khoa học

TỔ

BACILLUS

Theo khóa phân loại của Bergey‟s, Bacillus đƣợc phân loại nhƣ sau:

Chi Bacillus là một nhóm lớn và đa dạng trong họ Bacillaceae, với 51 loài đã được xác định và nhiều loài khác chưa được phân loại rõ ràng Họ Bacillaceae bao gồm 5 chi chính: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina và Desulfotomaculum, nổi bật với đặc trưng hình thành nội bào tử.

Hầu hết chi Bacillus là các vi khuẩn hình que , Gram dương (+), hiếu khí, các tế bào tồn tại riêng lẻ hay dính nhau thành chuỗi ngắn

Nội bào tử được phát hiện lần đầu bởi Cohn trong nghiên cứu về B subtilis và sau đó bởi Koch trong các nghiên cứu về B anthracis vào năm 1976 Sự hình thành nội bào tử đã được công nhận là một đặc điểm quan trọng trong việc phân loại và xác định các thành viên của chi Bacillus Tuy nhiên, một số loài Bacillus như B thermoamylovorans và B halodenitrificans không tạo bào tử, cùng với một số loài khác có đặc tính Gram âm hoặc Gram dương yếu như B thermosphaericus, B horti, B oleronius, và B azotoformans.

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG 17 đã chỉ ra rằng, khi phân loại dựa vào giải trình tự ADN - ARN, vi khuẩn không tạo bào tử và kỵ khí bắt buộc thuộc nhóm Bacillus, chẳng hạn như B infernus.

Một số loài Bacillus không tạo bào tử như B thermoamylovorans và B halodenitrificans, cũng như một số loài Gram âm và Gram dương yếu như B thermosphaericus, B horti, B oleronius và B azotoformans Ngoài ra, khi phân loại dựa vào giải trình tự ADN - ARN, các vi khuẩn không tạo bào tử và kỵ khí bắt buộc cũng thuộc nhóm Bacillus, ví dụ như B infernus.

Phản ứng Gram của Bacillus có thể thay đổi trong chu trình sống của nó, với chỉ các tế bào trẻ chắc chắn Gram dương Theo Wiegel (1981), cấu trúc vách tế bào "kiểu Gram" không hoàn toàn tương đồng với phản ứng nhuộm Gram Điều này có nghĩa là một vách tế bào nhuộm Gram âm vẫn có thể có cấu trúc Gram dương Ngược lại, một vách tế bào có cấu trúc Gram dương có thể nhuộm Gram âm hoặc dương tùy thuộc vào các điều kiện nhất định.

Bacillus là một loại vi khuẩn có khả năng chịu đựng và tồn tại lâu dài trong các điều kiện bất lợi, vì vậy chúng rất phổ biến và có thể dễ dàng phân lập từ nhiều nguồn khác nhau, đặc biệt là trong đất.

Bacillus hoạt động trao đổi chất khi có đủ nguồn dinh dưỡng và tạo bào tử khi thiếu hụt, đây là chiến lược sinh tồn của vi sinh vật trong đất Nhiều loài Bacillus có khả năng phân giải hiệu quả các hợp chất cao phân tử như protein, tinh bột và pectin, từ đó đóng vai trò quan trọng trong chu trình sinh học của carbon và nitơ.

1.2.2 H Đặc điểm cụ thể về chi này đƣợc mô tả nhƣ sau: Tế bào hình que thẳng hoặc gần thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước 0,5-1,2 x 2,5-10 m Trừ B anthracis và B

Hầu hết các loài Bacillus đều có khả năng di động, với roi điển hình nằm ở hai bên tế bào Chúng hình thành bào tử chịu nhiệt, thường chỉ có một bào tử trong mỗi tế bào, có hình dạng hình trụ, oval hoặc tròn, thỉnh thoảng là hình bầu dục Quá trình hình thành bào tử không bị ảnh hưởng bởi sự tiếp xúc với không khí Bacillus thực hiện trao đổi chất kiểu hô hấp nghiêm ngặt hoặc đồng thời cả hô hấp và lên men, yêu cầu nhiều thành phần khác nhau Chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyển hoá hô hấp là oxy phân tử, và hầu hết các loài này đều có catalase dương tính.

Vi khuẩn Bacillus chủ yếu có vỏ nhầy là polysaccharide, trong khi một số ít có vỏ glycopeptide Khi phát triển trong môi trường dinh dưỡng, vi khuẩn có vỏ nhầy polysaccharide tạo thành khuẩn lạc ướt, bóng nhờn gọi là khuẩn lạc S (Smooth), trong khi vi khuẩn có vỏ glycopeptide tạo khuẩn lạc khô xù xì R (Rough) Vỏ nhầy giúp vi khuẩn chống lại các điều kiện bất lợi của môi trường.

Hình 1.1 Các dạng hình thái khuẩn lạc Bacillus

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG 19

Hình 1.2 Các dạng khảo sát vi thể của Bacillus

1.2.3 Dinh dưỡng và tăng trưởng

Hầu hết các loại tế bào dinh dưỡng ưa nhiệt trung bình, với nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển dao động từ 25ºC đến 75ºC Chúng có khả năng phát triển trong khoảng pH rộng từ 2 đến 11 và chịu được nồng độ muối lên đến 25%.

Các loài Bacillus là sinh vật hóa dị dưỡng linh hoạt, có khả năng hô hấp và sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, amino acid và acid hữu cơ Chúng có thể lên men carbohydrate, tạo ra glycerol và butanediol trong một số trường hợp Một số loài như B megaterium không cần tác nhân tăng trưởng hữu cơ, trong khi một số khác lại cần amino acid, D-vitamin hoặc cả hai Bacillus phát triển tốt trên các môi trường dinh dưỡng thương mại với các thành phần cơ bản như pepton, cao thịt, glucose, lactose và chất khoáng, mặc dù trong một số trường hợp đặc biệt, các môi trường này cần được điều chỉnh.

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG nghiên cứu sự điều chỉnh pH và nồng độ muối trong môi trường nuôi cấy Bacillus, với pH từ 2 đến 11 và nồng độ muối từ dưới 2% đến 25% Trong điều kiện tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus khoảng 25 phút, tạo váng trên bề mặt môi trường lỏng và khuẩn lạc lớn, tròn hoặc hình dạng bất thường trên môi trường thạch Hình dạng khuẩn lạc có thể thay đổi theo độ tuổi và các đĩa nuôi cấy khác nhau Để phát triển, B larvae và B popilliae cần bổ sung thiamine, trong khi B pasteuri yêu cầu thêm 0,5 - 1% urea B stearothermophilus phát triển tốt trên môi trường dinh dưỡng có canxi và sắt, và sự tạo bào tử được kích thích khi nồng độ dinh dưỡng giảm, đặc biệt là thiếu carbon, nitrogen hoặc phospho.

Có thể sử dụng môi trường nhân tạo để cảm ứng tạo bào tử như Difico sporulation agar

(DSM), 2xSG agar 2009; Nguyễn Đức Quỳnh Nhƣ, 2008)

Phần lớn các chủng Bacillus ƣa nhiệt trung tính, và tạo khuẩn lạc đặc trƣng sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 o C Các loài ƣa nhiệt nhƣ B stearothermophilus phát triển từ 55 o C đến

70 o C, thường là khoảng 60 o C Các loài này ưa nhiệt bắt buộc và không thể phát triển ở

37 o C Loài ƣa nhiệt trung bình nhƣ B coagulans phát triển tốt tại 45 o 50 o C Loài gây bệnh cho côn trùng nhƣ B larvae và B popilliae phát triển ở nhiệt độ từ 25 o

30 o C Tương tự như vậy đối với B thuringiensis và B cereus.

Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử, bắt đầu vào cuối giai đoạn sinh trưởng khi thức ăn cạn kiệt hoặc có sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại Bào tử Bacillus nổi bật với khả năng chịu nhiệt, chịu chất độc và men phân giải nhờ lớp vỏ bào tử bảo vệ.

Bacillus sản xuất kháng sinh có khả năng tiêu diệt vi khuẩn xung quanh bằng cách phá vỡ thành tế bào của chúng Quá trình này giải phóng chất dinh dưỡng, không chỉ cung cấp thức ăn cho Bacillus mà còn hỗ trợ nó quay trở lại trạng thái sinh dưỡng.

TRÊN CÂY CAO SU

dụng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản, Bacillus subtilis dùng làm chế phẩm phòng và điều trị viêm tai mũi họng ở người ( , 2002)

Bacillus được sử dụng làm vật chủ biểu hiện gen để sản xuất enzym, acid amin, vitamin và polysaccharide Các chủng Bacillus brevis có khả năng tiết nhiều protein mà không tiết protease vào môi trường nuôi cấy, do đó chúng được ứng dụng làm hệ thống vector để biểu hiện các protein tái tổ hợp từ người, động vật hữu nhũ và các sinh vật khác, bao gồm nhân tố tăng trưởng biểu mô, insulin, interleukin 1- của bò và antigen virus viêm gan B.

1.3 NG LÁ TRÊN CÂY CAO SU

Bệnh rụng lá do nấm Corynespora cassiicola là một bệnh mới, gây thiệt hại lớn cho cây cao su tại khu vực Đông Á và Nam Á Lần đầu tiên, bệnh này được phát hiện trên cây cao su ở Sierra Leone vào năm 1949, sau đó đã được ghi nhận tại Ấn Độ (1958), Malaysia (1961), Nigeria (1968), cũng như Thái Lan, Sri Lanka, Brazil và Indonesia vào năm 1985, và Bangladesh vào năm 1988.

Nấm xâm nhập chủ yếu qua mặt dưới lá thông qua biểu bì và khí khổng, đồng thời tiết ra men celluloza giúp phân hủy màng tế bào Trong quá trình sinh trưởng, nấm sản sinh chất độc CC toxin, gây hại cho cây cao su; chỉ cần một vết bệnh nhỏ trên gân lá chính cũng đủ dẫn đến hiện tượng rụng lá Nấm có khả năng tồn tại và phát triển trong dải nhiệt độ rộng, nhưng nhiệt độ tối ưu nhất cho sự phát triển của chúng là 28 ± 2 độ C và độ ẩm bảo hòa.

Bệnh xuất hiện tại Việt Nam vào tháng 8 năm 1999, gây hại nặng cho các dòng vô tính như RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372 Đến năm 2010, bệnh đã lan rộng ở nhiều tỉnh miền Đông Nam Bộ, Tây Nguyên và miền Trung, đặc biệt tập trung vào dòng cao su vô tính RRIV 4, hiện chiếm một diện tích trồng lớn tại các vùng cao su đại điền và tiểu điền.

1.3.2 Triệu chứng bệnh trên cây cao su

1.3.2.1 Các dạng triệu chứng phổ biến

Bệnh gây hại chủ yếu trên lá, cuống và chồi với những triệu chứng khác nhau ( Phan Thành Dũng, 2000; Phan Thành Dũng , 2010)

Hình 1.3 Hai dạng đốm và xương cá

Hình 1.4 Đốm, đốm có lỗ và viền vàng

Hình 1.5 Héo và bạc đầu lá

Hình 1.7 Dạng nứt dọc trên chồi Hình 1.6 Dạng xương cá và cháy phiến lá

Hình 1.8 Dạng nứt dọc trên cuống lá

1.3.2.2 Triệu chứng bệnh trên lá

Trên lá non, bệnh xuất hiện dưới dạng vết tròn màu xám đến nâu, bao quanh bởi vòng màu vàng, và có thể hình thành lỗ ở trung tâm Lá bị hại sẽ xoăn lại, biến dạng và cuối cùng rụng Các lá đã chuyển màu xanh sẽ có triệu chứng đặc trưng với vết bệnh màu vàng, sau đó chuyển sang màu đen, với đường kính khoảng 1-3 mm, phân bố theo hình xương cá dọc theo gân lá Nếu gặp điều kiện thuận lợi, các vết bệnh có thể lan rộng, gây chết từng phần lá do sự phá hủy diệp lục, dẫn đến việc toàn bộ lá chuyển màu vàng - vàng cam và rụng từng lá một.

Trên lá già, xuất hiện các vết bệnh có hình thủng, đặc trưng với màu đen và hình dạng xương cá dọc theo gân lá Khi gặp điều kiện thuận lợi, các vết bệnh này có thể lan rộng, gây chết từng phần của lá do sự phá hủy lục lạp, dẫn đến hiện tượng lá chuyển màu vàng-cam và rụng dần.

1.3.2.3 Triệu chứng bệnh trên cuống lá và chồi

Dấu hiệu đầu tiên của bệnh là vết nứt dọc theo cuống và chồi có hình dạng hình thoi, với mủ rỉ ra và sau đó chuyển sang màu đen Khi cắt bỏ lớp vỏ ngoài, sẽ thấy những sọc đen ăn sâu vào gỗ, chạy dọc theo vết bệnh.

Cuống lá xuất hiện vết nứt màu đen dài từ 0,5 đến 3,0 mm Khi cuống lá bị tổn thương, toàn bộ lá chét sẽ rụng ngay cả khi còn xanh, mà không có triệu chứng nào trên phiến lá.

Chồi xanh thường dễ bị nhiễm bệnh, nhưng nấm bệnh cũng có thể tấn công chồi đã hóa nâu Vết bệnh có thể phát triển dài tới 20 cm, dẫn đến việc chồi bị chết, thậm chí có thể gây chết cả cây.

Bệnh rụng lá do nấm Corynespora cassiicola gây ra có triệu chứng dễ nhầm lẫn với các bệnh khác trên cây cao su như bệnh héo đen đầu lá và bệnh đốm mắt chim Để phân biệt chính xác bệnh rụng lá, cần dựa vào các triệu chứng đặc trưng của bệnh này.

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG 30 đen

Quanh năm đen trung tâm

(Jayasuriya K.E and Thennakoon B.I., 2007; Phan Thành Dũng, 1995)

Vào năm 1996, một dịch bệnh lớn đã bùng phát, ảnh hưởng nghiêm trọng đến diện tích cao su, đặc biệt là trên dvt RRII 105, chiếm gần 80% tổng diện tích cao su trong nước Bệnh này đã làm giảm sản lượng mủ lên đến 50% tại những vùng bị ảnh hưởng nặng nề Để kiểm soát dịch bệnh, hàng năm, việc phun thuốc đại trà được thực hiện trên hơn 10.000 ha, chủ yếu tại những khu vực có điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của bệnh.

Giai đoạn ban đầu: RRIM 600, RRIM 610, RRIM 622 và Tjir 1 Giai đoạn gần đây: RRII 105, RRII 118, RRII 300, PR 107, PR 255, PR 261, PB 86, PB217,PB235, PB255,

PB 260, PB 311 (Jayasinghe C.K.,1997; Phan Thành Dũng, 1995)

Vào thập niên 80, 1200 ha cao su bị nhiễm bệnh nghiêm trọng, dẫn đến việc chặt bỏ 400 ha và gây thiệt hại khoảng 200 triệu Rupiah Đáng lưu ý, 70% diện tích cao su trong nước bị ảnh hưởng bởi bệnh gây hại ở mức độ đáng kể.

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG 33 khác nhau Nhiều dvt cao sản phải loại bỏ: IAN 873, một số PR 300 serses Bệnh làm giảm sản lƣợng từ 30 – 50 %

Giai đoạn ban đầu: RRIC 103, KRS 21, RRIM 600, RRIM 725, PPN 2444, PPN

2477, PPN 2658, IAN 873 VÀ GT 1 Giai đoạn gần đây: AVROS 2037, PR 300, PR 303 và nhiều dvt thuộc series IR 100, IR 200 (Jayasinghe C.K.,1997; Phan Thành Dũng,

Dịch bệnh cao su bùng phát vào năm 1985 đã gây thiệt hại nặng nề cho hàng ngàn hecta cao su, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng và sự sinh trưởng của cây, thậm chí dẫn đến tình trạng chết toàn bộ cây Các giống cây cao su như GT 1 và RRIM cũng bị ảnh hưởng bởi dịch bệnh này.

600 và một số RRIM 2000 series, IAN 873 phải loại bỏ do mẫn cảm với bệnh Bệnh hiện diện trên cả nước và gây hại nặng các tỉnh phía nam

Trong giai đoạn ban đầu, các giống cây cao su được trồng bao gồm RRIC 103, Fx 25, RRIM 725, KRS 21, PPN 2658, PPN 2444 và PPN 2447 Giai đoạn gần đây, những giống cây nổi bật là GT 1, PR 107, PBIG, PB 217, PR 261, cùng với các giống RRIM 600, RRIM 605, RRIM 701, RRIM 702, RRIM 705, RRIM 2015 và RRIM 2020 (Phan Thành Dũng, 1995; Chee K.H., 1988).

Bệnh xuất hiện lần đầu vào năm 1985, gây thiệt hại khoảng 2% số cây của giống dvt RRIC 103 và KRS 21 trong vườn thí nghiệm trao đổi giống quốc tế Tình trạng bệnh nặng nề hơn ở các vùng phía Nam, Tây và Tây Nam, dẫn đến sự gia tăng đáng kể số lượng dvt mẫn cảm.

Giai đoạn ban đầu: RRIC 103, KRS 21 Giai đoạn gần đây: RRIM 600, GT 1, KTS 225,

226, PR 255, PR 305, RRIT 251 và Songkhla 36 (Jayasinghe C.K.,1997; Phan Thành Dũng, 1995)

BỆNH NẤM HỒNG TRÊN CÂY CAO SU

Bệnh do nấm hồng đã xuất hiện tại tất cả các quốc gia trồng cao su trên thế giới, từ châu Á, châu Phi đến châu Mỹ Các khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề bao gồm Bắc Mỹ (Mexico, Mỹ, Florida), Trung Mỹ và Tây Ấn, Nam Mỹ (Brazil, Colombia, Guyana, Peru, Surinam), châu Phi (Cameroon, Congo, Zaire, Gabon, Guinea, Bờ Biển Ngà, Kenya, Madagascar, Mauritius, Nigeria, Rhodesia, Sierra Leone, Nam Phi, Tanzania, Togo), châu Á (Quần đảo Andaman, Brunei, Myanmar, Campuchia, Sri Lanka, Đài Loan, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Việt Nam), châu Úc và châu Đại Dương (Úc, New Zealand, Quần đảo British Solomon, Fiji và các đảo Thái Bình Dương), cùng với châu Âu (Liên Xô cũ, Kavkaz).

Bệnh xuất hiện lần đầu tại Việt Nam vào năm 1920 do Vincens phát hiện và được xác nhận là nghiêm trọng bởi Bugnicourt vào năm 1937 Trước khi Viện Nghiên Cứu Cao Su Đông Dương thành lập năm 1941, bệnh đã gây hại đáng kể trên cây cao su tại khu vực Đông Nam Bộ, trong khi ở Tây Nguyên, mức độ gây hại lại thấp hơn.

Nấm bệnh gây hại cho cây cao su chủ yếu ở độ tuổi từ 3-12 năm, đặc biệt nghiêm trọng nhất trong giai đoạn 4-8 tuổi Loại nấm này tấn công vào thân cành có vỏ đã hóa nâu và có đường kính lớn hơn 1 cm, thường phát triển mạnh trong mùa mưa khi độ ẩm không khí đạt trên 90% Tại Việt Nam, bệnh xuất hiện từ tháng 6 đến tháng 11 hàng năm, trong khi các tháng còn lại, nấm tồn tại ở dạng ủ bệnh Điều đáng lưu ý là nấm thường gây hại tại cùng một vị trí cho đến khi cành hoặc tán cây bị chết, do đó, bệnh này có tầm quan trọng lớn vì ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cây cao su.

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG 36 nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phòng trị bệnh kịp thời cho cây trồng Nếu không được xử lý, bệnh có thể dẫn đến chết cây, làm giảm độ đồng đều của vườn và ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất trong suốt giai đoạn thu hoạch Hơn nữa, nấm bệnh còn gây thiệt hại nghiêm trọng cho sự sinh trưởng và sản lượng cây trồng.

1.4.2 Triệu chứng bệnh trên cây cao su

Vết bệnh có màu sắc hồng đặc trưng, được gọi là nấm hồng, chủ yếu xuất hiện ở các vị trí phân cành trên thân cây và cành có vỏ đã hóa nâu Bệnh này phát triển qua hai giai đoạn chính.

1.4.2.1 Bệnh nhẹ (giai đoạn corticium)

Bệnh xuất hiện tại vị trí phân cành do ẩm độ cao, nơi bào tử dễ bám dính và nảy mầm Ban đầu, vỏ cây bị bệnh có màu trắng nhạt và có giọt mủ chảy ra Sau đó, khuẩn ty trắng giống như mạng nhện phát triển xung quanh và lan rộng Khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi, vết bệnh chuyển từ màu trắng.

Tô Hồng Sơn và Nguyễn Thị Đài Trang 37 ghi nhận sự xuất hiện của nấm với màu hồng nhạt lan rộng, khuẩn ty phân bố dày đặc xâm nhập sâu vào vỏ cây, gây ra tình trạng mủ chảy nhiều thành vệt dài và chuyển màu đen do oxy hóa Trong giai đoạn này, nấm phát triển bào tử (basidiospore) và phát tán qua gió Khi gặp điều kiện bất lợi, nấm sẽ ngừng phát triển và tái hoạt động vào mùa mưa năm sau, có thể gây chết cành hoặc cụt ngọn, trở thành nguồn lây lan ban đầu.

Hình 1.11 Dạng triệu chứng bệnh ở giai đoạn bệnh nhẹ

1.4.2.2 Bệnh nặng (giai đoạn necator)

Vết bệnh chuyển sang màu hồng đậm, làm cho phần tán lá trên vết bệnh trở nên vàng và héo rũ Cuối cùng, toàn bộ cành lá phía trên đều chết khô, trong khi ngay dưới vết bệnh lại xuất hiện dấu hiệu mới.

SVTH: Tô Hồng Sơn – Nguyễn Thị Đài Trang 38 cho biết rằng chồi bất định xuất hiện khi vỏ cây đã bị hủy hoại hoàn toàn và nứt từng mảng Tại Việt Nam, vết bệnh có thể dài từ 5-7 m và gây hại ngay cả trên bề mặt cạo.

Hình 1.12 Dạng triệu chứng bệnh ở giai đoạn bệnh nặng

1.4.2.3 Cảnh báo về bệnh nấm hồng trên cây cao su non

Bệnh nấm hồng chủ yếu gây hại cho cây cao su từ 4-8 năm tuổi, nhưng các nghiên cứu gần đây của Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Viện Nghiên cứu Cao Su Việt Nam đã chỉ ra rằng bệnh này cũng ảnh hưởng nghiêm trọng đến cây cao su non Những phát hiện này cho thấy sự mở rộng của tác động của bệnh nấm hồng không chỉ giới hạn ở cây cao su trưởng thành mà còn đe dọa cây cao su non, cần có biện pháp phòng ngừa kịp thời.

Từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2007, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam đã tiến hành thí nghiệm về chủng bệnh nấm hồng trên cây cao su non 9 tháng tuổi trong điều kiện nhà lưới, sử dụng nhiều nguồn nấm khác nhau.

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG 39 đã phân lập từ cây cao su, mít lai, bưởi năm roi và cây quít ngọt Sau 2 tuần, các vết chủng xuất hiện triệu chứng bệnh với tỷ lệ cao, bao gồm 4 dạng triệu chứng khác nhau: dạng khảm, mạng nhện, xì mủ và dạng gai nấm Trong đó, dạng gai nấm là dạng xuất hiện nhiều nhất và hoàn toàn khác biệt so với triệu chứng trên cây cao su trưởng thành.

Vào tháng 11/2007, Bộ môn Bảo vệ Thực vật Viện nghiên cứu cao su Việt Nam đã phát hiện triệu chứng bệnh gai nấm trên cây cao su trong vườn ươm Sau khi phân lập, xác định rằng đây là nấm hồng, Bộ môn chú trọng phòng trị bệnh này không chỉ ở các vườn cao su lớn mà còn theo dõi sát sao ở vườn ươm và vườn nhân để phát hiện sớm và xử lý kịp thời, nhằm ngăn chặn bệnh lây lan rộng rãi.

1.4.3 Phân biệt bệnh nấm hồng với các bệnh khác trên cây cao su

Cây cao su mắc bệnh nấm hồng, ở cả giai đoạn nhẹ (giai đoạn corticium) và giai đoạn nặng (giai đoạn necator), đều có triệu chứng tương tự như bệnh Botryodiplodia, một loại bệnh cũng ảnh hưởng đến thân cây cao su.

Bảng 1.4 Phân biệt bệnh nấm hồng với bệnh Botryodiplodia Đặc tính Bệnh nấm hồng Bệnh Botryodiplodia

Bệnh xuất hiện trên thân và cành với đặc điểm nhẹ, vỏ có màu hơi trắng Sau đó, mủ chảy nhiều thành vệt dài và hình thành các mụn nhỏ trên toàn bộ thân cành.

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG 41 đen

Vết bệnh chuyển sang màu hồng đậm, phần tán lá trên vết bệnh vàng và héo rũ, sau đó toàn bộ cành lá phía trên đều chết khô

Toàn bộ thân cành bị nứt và có màu nâu đặc trƣng với mủ rỉ ra từ những vết nứt

1.4.4 Điều kiện phát sinh phát triển bệnh

NẤM CORYNESPORA CASSIICOLA

1.5.1 Phân loại theo (Berk & Curt.) Wei

Nấm còn có tên khác: Helminthosporium cassiicola Berk & Curt., apud Berk.; H papayae H Syd.; H vignae Olive, apud Olive, Bain & Lefbvre; Cercospora melonis

Cooke; C vignicola Kawamura; Corynespora melonis (Cooke)

1.5.2 Hình thái và đặc điểm sinh lý của Corynespora cassiicola

Khuẩn ty có màu xám đến nâu

Bào tử phát triển trên vết bệnh và trong môi trường nhân tạo, có màu nâu nhạt và hình dạng cong với nhiều vách ngăn Kích thước bào tử dao động từ 36 đến 186 × 8 đến 19 μm, đôi khi đạt đến 700 μm Chúng có thể xuất hiện dưới dạng đơn hoặc chuỗi dính với nhau ở hai đầu gọi là hilum, và được phát tán chủ yếu nhờ gió.

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG 43 cho biết rằng bào tử nấm phóng thích chủ yếu vào ban ngày, đạt đỉnh điểm từ 8-11 giờ, đặc biệt sau thời gian mưa nhiều và nắng ráo Bào tử này có khả năng tồn tại lâu dài trên các vết bệnh hoặc trong đất, và có thể duy trì khả năng gây bệnh trên lá cao su khô đến 3 tháng Nấm thường xâm nhập qua mặt dưới lá thông qua biểu bì và khí khổng, đồng thời tiết ra men celluloza để phân hủy màng tế bào (Phan Thành Dũng, 1995)

Nấm gây hại cho cây cao su bằng cách tiết ra chất độc CC toxin, làm cho chỉ một vết bệnh nhỏ trên gân lá chính cũng đủ gây rụng lá Nấm có khả năng phát triển trong dải nhiệt độ rộng, tối ưu nhất là 30 oC và độ ẩm cao Chúng có thể tấn công cả lá già và non, cũng như cuống lá và chồi Sự hiện diện của nấm quanh năm trong suốt chu kỳ sống của cây cao su gây ra tác hại lớn, đặc biệt đối với các giống cây nhạy cảm.

Nấm có khả năng ký sinh trên hơn 150 loại cây thuộc nhiều họ khác nhau, gây hại cho tất cả các bộ phận của cây, từ lá đến rễ Chúng tồn tại ở hơn 80 quốc gia và phát triển trong nhiều vùng khí hậu, từ nhiệt đới đến ôn đới (Phan Thành Dũng, 1995)

NẤM CORTICIUM SALMONICOLOR

1.6.1 Phân loại theo Berkeley, M.J and Broome, C.E., 1875

Corticium salmonicolor do Berkeley và Broome đƣa ra khi hai ông tìm thấy nấm đang ở giai đoạn corticium trên cây cà phê ở Ceylon vào năm 1873 Thời điểm thứ

Vào năm 1898, nấm Necator discretus được mô tả lần đầu tiên trên cây cà phê ở Malaysia.

C salmonicolor và tên này đƣợc sử dụng cho đến ngày nay (Tims, E C.,1960; Hilton,

Thể quả trên bề mặt vỏ cây có đường kính vài cm, lộn ngược và có màng dày khoảng 500 µm, trơn nhẵn, màu hồng da cam khi tươi và chuyển sang kem nhạt hoặc trắng khi khô Khuẩn có dạng sợi nấm trong suốt, trơn nhẵn, với sợi nấm gốc có đường kính 6 - 10 µm và tế bào dài 30 - 150 µm Vách tế bào dày 1,5 µm, phân cành thưa thớt với góc phân cành rộng Các cành bào tầng nhỏ hơn, tế bào ngắn hơn, vách mỏng hơn và phân cành nhiều hơn Bề mặt bào tầng phẳng, chỉ có một lớp bào tử đặc Khi chưa trưởng thành, bào tử có dạng trứng ngược, dần dần chuyển sang dạng chùy rộng, và khi trưởng thành thì chuyển sang hình trụ, với kích thước 30 - 55 x 5 - 10 µm Bào tử dạng bầu dục rộng, có đỉnh nhỏ nhô ra, vách mỏng, trơn nhẵn, kích thước 10 - 13 x 6 - 9 µm Gốc cụm cuống bào tử có dạng đĩa, phát sinh trên bề mặt vỏ cây, tạo thành khối tế bào thể bình màu đỏ cam Sự tách rời tại các vách ngăn của tế bào thể bình tạo ra các bào tử đính trong suốt với kích thước 10 µm.

1.6.3 Đặc điểm sinh học của nấm

Nấm Corticium salmonicolor có khả năng xâm nhập vào vỏ cây nguyên vẹn thông qua các bì khổng, dẫn đến việc tiêu diệt tƣợng tầng hoặc gây nhiễm bệnh qua các vết thương Khi nấm xâm nhập vào vỏ cây, nó sẽ giết chết mô vỏ sống và hình thành các vết loét trên thân và cành Trong gỗ, nấm lan truyền theo chiều dọc qua các mạch dẫn và mở rộng ra xung quanh qua vành ngoài của các nhu mô.

Hình 1.14 Khuẩn lạc nấm Corticium salmonicolor RRIV 4 lô 18 – NT5 – CTCS lộc ninh

Trên hầu hết các loại cây kí chủ, nấm Corticium salmonicolor thường trải qua 4 giai đoạn với 4 dạng sinh trưởng và phát triển khác nhau

Khi cây bị nhiễm bệnh, dấu hiệu đầu tiên là sự xuất hiện của một lớp khuẩn ty thể sáng chói trên bề mặt vỏ cây Ở giai đoạn này, khuẩn ty thể chỉ có chức năng sinh dưỡng và được gọi là giai đoạn mạng nhện.

Hình 1.15 Dạng bào tử và sợi nấm C.salmonicolor

A: Đảm (chưa trưởng thành và đã trưởng thành) và các bào tử đảm

B: Tế bào thể bình và bào tử đính

C: Sợi nấm với một „mấu nối‟ đƣợc tìm thấy phổ biến trong khuẩn ty thể của lớp etes

D: Thể quả trên bề mặt vỏ cây

F: Mặt cắt dọc của cấu trúc thể quả sản sinh các bào tử đính

Thanh ngang = 15 àm đối với A, 20 àm đối với B và C, 120 àm đối với D, E và F

Hình 1.16 Đảm và bào tử đảm của nấm C salmonicolor

Giai đoạn thứ hai của sự phát triển bệnh là sự xuất hiện của những mụn mủ và lớp khảm màu hồng hoặc hồng da cam vô sinh trên bề mặt vỏ cây và trong các vết nứt của vỏ cây Giai đoạn này diễn ra nhanh chóng ngay sau giai đoạn đầu và được gọi là giai đoạn mụn mủ.

Dạng thứ ba (giai đoạn necator) của nấm phát triển sau khi các vết loét hình thành, đánh dấu sự xuất hiện của bào tử đính và cấu trúc thể quả màu đỏ cam (đĩa bào tử) Các thể quả này sản sinh ra bào tử đính, có khả năng phát tán nhờ nước mưa và có thể sống đến 20 ngày trong điều kiện khô ráo, nhưng cần độ ẩm cao để nảy mầm Giai đoạn cuối cùng, giai đoạn hoàn thiện của nấm trong mùa mưa, là sự hình thành bào tử đảm với lớp khảm màu hồng.

Cả hai loại bào tử đính và bào tử đảm đều được phát tán qua gió và có khả năng gây nhiễm bệnh qua mô vỏ cây còn nguyên vẹn, nhưng bào tử đảm là quan trọng nhất Hiện tại, thời gian tồn tại của nấm trên bề mặt vỏ cây hoặc trong gỗ vẫn chưa được xác định Tuy nhiên, có khả năng các thể quả trên vỏ cây sẽ sản sinh bào tử trong một giai đoạn nhất định.

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG 48 khoảng vài tháng dưới các điều kiện môi trường thuận lợi (Hilton, R.N., 1958; Tims, E C.,1960)

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chủng vi khuẩn

C Bacillus ỉ ớ ện Củ Chi, thành phố Hồ Chí

V

2.1 U Đề tài đƣợc thực hiện trong thời gian từ 05/11/2012 – 10/04/2013 tại phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3), 68 Lê Thị Trung, TP Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

C Bacillus ỉ ớ ện Củ Chi, thành phố Hồ Chí

Nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola đã được thực hiện trên 5 mẫu lá cây cao su bị bệnh rụng lá tại tỉnh Bình Dương và huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh Nấm này gây ra bệnh nấm hồng trên cây cao su, với tên và mã chủng là Corticium salmonicolor – RRIV 4 lô 18 – NT5 – CTCS Lộc Ninh.

2.3.1 Dụng cụ và thiết bị

- Nồi hấp tiệt trùng Hirayama

- Máy lắc Certomat BS- 1 Jeiotech

- Một số dụng cụ thí nghiệm khác: đĩa petri, ống nghiệm, đầu soi, pipette, micropipette, đèn cồn, que cấy, que trãi, erlen, bercher, lame, lamell, ống đong, kẹp,…

- Hóa chất: Cồn 96 o , cồn 70 o , NaCl 0,85 %, dung d ch lactophenol, NaOH 2M, HCl 2M, NaCl, casein, KOH

- Thuốc thử: giấy thử oxidase, Kovac‟s, Gress A, Gress B, α – naphtol 5%, thuốc thử catalase H2O2 5%, phenol red

- Thuốc nhuộm: tím kết tinh (crystal violet), lugol, Safranin O,

- Môi trường: Sabouraud agar (SA), PDA (Potato D-Glucose Agar), PS (Potato Sabouraud), NA (Nutrient Agar), NB (Nutrient Broth), glucose, agar, tinh bột tan

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG trang 52

Từ mẫu lá cao su bị bệnh

Chọn khuẩn lạc điển hình, làm thuần và định danh

Phân lập nấm bệnh trên môi trường PDA

Phân lập vi khuẩn trên môi trường NA

Xác định nhóm vi khuẩn Bacillus

Thử khả năng đối kháng nấm bệnh của Bacillus

Chọn các chủng Bacillus có khả năng kháng nấm

Thử nghiệm ức chế nấm được thực hiện thông qua phương pháp phun dịch lọc nuôi cấy Kết quả cho thấy phần trăm ức chế nấm đạt hiệu quả cao Đồng thời, việc định danh các chủng Bacillus đến mức loài được thực hiện bằng các thử nghiệm sinh hóa theo khóa phân loại.

Cowan andSteels Thử khả năng tương hỗ giữa các chủng Bacillus kháng nấm mạnh

Khảo sát mối tương quan giữa tăng trưởng và khả năng kháng nấm của

Thử nghiệm ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên sự ổn định của dịch lọc kháng nấm

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG trang 53

Tại huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh, quá trình lấy mẫu đất được thực hiện bằng cách loại bỏ lớp đất mặt trước khi thu thập mẫu đất vào hộp đựng vô trùng (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2003)

(Nguyễn Đức Lƣợng và cs, 2003)

2.4.2.3 (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2003)

Tiến hành phân lập theo quy trình sau:

Pha loãng mẫu với dung dịch NaCl 0,85 % với độ pha loãng từ 10 -1 đến 10 -6

Trải 100 L mẫu ở ba độ pha loãng cuối lên môi trường NA và ủ ở 37°C trong 24 giờ Sau đó, chọn những khuẩn lạc có hình dạng ria hoặc răng cưa, và thực hiện cấy ria qua môi trường thạch dinh dưỡng mới để thuần hóa.

Nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi xem hình dạng vi thể

- Trực khuẩn (dạng hình que)

Chọn thử hoạt tính catalase dương (+)

Phân lập đƣợc nấm bệnh Corynespora cassiicola

2.4.3.2 để thu mẫu lá bệnh với những

Quan sát triệu chứng bệnh trên lá bằng mắt thường hoặc kính lúp để nhận diện các đặc điểm bên ngoài như sự biến đổi màu sắc và tình trạng bệnh Ghi lại sự phân bố của bệnh trạng trên lá và thực hiện mô tả cùng chụp ảnh lá bị bệnh để lưu trữ thông tin.

2.4.3.3 Corynespora cassiicola ững miếng nhỏ (3 × 3 mm) ằng cồn 70 o trong 5 giây rồi rửa lại 2 -

3 lần bằng nước cất vô trùng C (90 mm đường kính) trườ đã cấy mẫu bệnh này ở nhiệt độ

30 o C trong khoảng 4 - 5 ngày cho sợi nấm phát triển

Phương pháp dùng kim nhọn (

 me vật kính X10 (độ phóng đại 100 lần)

 bào tử ở nhiệt độ 30 0 C, quan sát sự nảy mầm của bào tử đến khi hình thành khuẩn lạc thì chuyển sang môi trường thạch nghiêng

2.4.4 khả năng kháng nấm Corynespora cassiicola ST và nấm

Corticium salmonicolor RRIV 4 của các chủng Bacillus

2.4.4.1 Mục tiêu ột số Bacillus có khả năng kháng nấm Corynespora cassiicola ST và nấm Corticium salmonicolor RRIV4 lô 18 – NT5 – CTCS lộc ninh, và bệnh nấm hồng trên cây cao su

Môi trường PS và PDA thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121 o C trong 15 phút

PDA được đổ vào đĩa Petri (đường kính 90 mm) với chiều cao thạch 4 mm tính từ đáy đĩa 2.4.4.3 Chuẩn bị vi khuẩn và nấm thử nghiệm

Vi khuẩn Bacillus được nuôi tăng sinh trong 8 mL môi trường PS trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 48 giờ 8 CFU/mL

Nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA và sau đó, sử dụng thanh inox đã được khử trùng bằng lửa đèn cồn để hòa bào tử nấm vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý 0,85% đã được hấp vô trùng, cho đến khi đạt mật độ 10^6 bào tử/mL, được xác định bằng buồng đếm hồng cầu.

Phương pháp đếm trên buồng đếm hồng cầu (Phan Hữu Nghĩa và cs, 2000)

 Buồng đếm là một phiến kính trong, dày, hình chữ nhật

Giữa buồng đếm là phần lõm phẳng với hai rãnh dùng để bơm dung dịch vào, và có hai khung đếm chứa 400 ô nhỏ Ngoài ra, bên ngoài buồng còn ghi rõ tên loại buồng đếm cùng các thông số kỹ thuật liên quan.

 Buồng đếm sử dụng với thông số kỹ thuât: o Chiều cao một ô nhỏ 0,100 mm o Diện tích một ô nhỏ 0,0025 mm 2 (1/400 mm 2 )

Cấu tạo một khung đếm:

 Một khung đếm có 16 ô lớn, một ô lớn có 25 ô nhỏ Vậy một khung đếm có 16 x

 Thể tích của một ô nhỏ: V ô nhỏ = 0,1 mm x 1/400 mm 2 = 1/4000 mm 3

 Đặt lamem sạch phủ lên khung đếm

Sử dụng ống nhỏ giọt để hút dung dịch nấm đã pha loãng, sau đó bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm Dung dịch sẽ thấm vào kẽ buồng đếm và lan tỏa đều trên lamem.

 Đặt lên kính hiển vi và đếm 5 ô lớn với 125 ô nhỏ

Trong đó: a = số tế bào trung bình trong một ô nhỏ

4000 = số qui đổi từ 1/4000 mm 3 thành 1 mm 3

1000 = số qui đổi từ 1 mm 3 thành 1 mL (1 mL = 1000 mm 3 )

Sử dụng que bông vô trùng để lấy mẫu, ép que lên thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều mẫu lên bề mặt đĩa môi trường PDA Lặp lại quy trình này ba lần, mỗi lần xoay đĩa 60 độ, rồi để cho mặt thạch ráo nước.

Hỳt 20 àL dịch vi khuẩn cấy vào tõm đĩa mụi trường đó trải nấm Ủ ở 30 o C trong 3

- 4 ngày thì tiến hành đánh giá khả năng kháng nấm gây bệnh của Bacillus bằng việc đo đường kính vòng kháng nấm (

Thí nghiệm được lặp lại ba lần để kiểm tra khả năng kháng nấm Kết quả được xử lý bằng phương pháp thống kê Anova một yếu tố qua phần mềm Excel (xem chi tiết trong phụ lục 1) và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình (mm) ± sai số.

2.4.4.5 Kết quả Đường kính vòng kháng nấm của Bacillus đối với nấm bệnh được tính bằng công thức:

Trong đó: V (mm): đường kính trung bình vòng kháng nấm

D (mm): đường kính tính theo hai chiều từ tâm của đĩa đến mép của vòng kháng nấm

SVTH: TÔ HỒNG SƠN – NGUYỄN THỊ ĐÀI TRANG 59 d (mm) là đường kính trung bình của khuẩn lạc vi khuẩn, được tính theo hai chiều vuông góc tại tâm khuẩn lạc.

Căn cứ vào trị số V, các chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng kháng nấm Corynespora cassiicola và Corticium salmonicolor, nguyên nhân gây ra bệnh rụng lá và bệnh nấm hồng trên cây cao su, được xác định Trị số V càng cao, khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn càng mạnh.

Hình 2.1 Kết quả kháng nấm của vi khuẩn

2.4.5 Thử nghiệm phần trăm ức chế nấm Corynespora cassiicola ST và nấm

Corticium salmonicolor – RRIV4 lô 18 – NT5 – CTCS lộc ninh của các chủng Bacillus

Tính kháng nấm mạnh hay yếu của Bacillus vô cùng quan trọng, đƣợc thể hiện qua phần trăm ức chế

2.4.5.1 Môi trường chuẩn bị (Gong M và cs, 2006; Chang W.T và cs, 2007; Zhao Z.Z và cs, 2010)

Môi trường PS và PDA thử nghiệm được tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút Môi trường PDA với nồng độ gấp đôi được bảo quản trong ống nghiệm và được giữ ở nhiệt độ thích hợp.

2.4.5.2 Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm (Gong M.và cs, 2006; Chang.W.T và cs, 2007; Zhao Z.Z và cs, 2010)

Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong 8 mL môi trường PS trên máy lắc với tốc độ

Sau khi nuôi cấy, ly tâm dịch nuôi cấy với vận tốc 5100 vòng/phút trong 10 phút Dùng màng lọc 0,2 m lọc dịch vi khuẩn sau khi ly tâm

Định dạng
Số trang	159
Dung lượng	6,73 MB