TỔNG QUAN
Giới thiệu chung về chi Diệp hạ châu (Phyllanthus)
1.1.1 Đặc điểm của chi Diệp hạ châu (Phyllanthus)
Chi Diệp hạ châu (Phyllanthus) là chi lớn nhất thuộc họ Đại kích (Euphorbiaceae), bao gồm các loài cây đơn tính với lá kép mọc so le hoặc đối Hoa của chi này nhỏ, tập trung thành hình cốc và có màu trắng, xanh lục hoặc trắng xanh, trong khi quả có dạng thùy nang với cuống dài Ước tính có từ 550 đến 750 loài trong chi này, chủ yếu phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới, bao gồm châu Á, châu Âu và châu Mỹ Tại Việt Nam, có 45 loài Diệp hạ châu, chủ yếu tập trung ở miền Nam, như Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum), Diệp hạ châu ngọt (Phyllanthus urinaria) và Phèn đen (Phyllanthus reticular Poir).
Hình 1.1 Một số thực vật thuộc chi Diệp hạ châu (Phyllanthus) a) Cây chó đẻ răng cưa b) Cây chó đẻ thân tía c) Cây phèn đen d) Cây me rừng
1.1.2 Hoạt tính các hợp chất có trong chi Diệp hạ châu (Phyllanthus)
Trong y học cổ truyền Đông phương và Việt Nam, các loài thực vật thuộc chi Diệp hạ châu được sử dụng rộng rãi trong các bài thuốc với nhiều tác dụng điều trị, bao gồm bệnh thận, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng đường ruột, tiểu đường và viêm gan siêu vi B, cũng như các bệnh ngoài da Nghiên cứu về các cây thuộc chi Phyllanthus, như Phyllanthus niruri, Phyllanthus flexuosus (diệp hạ châu), Phyllanthus amarus (diệp hạ châu đắng) và Phyllanthus urinaria, đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, không chỉ về hóa thực vật mà còn về dược học ở cả cấp độ in vitro và in vivo.
(chó đẻ răng cưa), Phyllanthus emblica (me rừng), Phyllanthus sellowianus được nghiên cứu khá nhiều về mặt hoá học [6][8].
Các hợp chất chiết xuất từ diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) và chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) cho thấy khả năng kháng virus và kháng khuẩn, đặc biệt hiệu quả trong việc ức chế virus viêm gan B Ngoài ra, các hợp chất từ quả me rừng (Phyllanthus emblica) cũng có tác dụng phòng ngừa một số loại ung thư và kìm hãm sự phát triển của virus.
HIV và chống suy giảm miễn dịch.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cao chiết từ các loài thuộc chi Phyllanthus như Phyllanthus amarus, Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus watsonii và Phyllanthus emblica có khả năng gây độc tính đối với các dòng tế bào ung thư Các tác dụng nổi bật bao gồm ức chế sự xâm lấn và di căn, đồng thời kích hoạt quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Năm 2011, nghiên cứu của Lee và cộng sự đã xác nhận hiệu quả của cao chiết từ bốn loài Phyllanthus, bao gồm Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria, và Phyllanthus watsonii.
Phyllanthus amarus đều có tác dụng ức chế sự di căn của dòng tế bào ung thư phổi
A549 và dòng tế bào ung thư vú MCF-7, bằng cách kích hoạt quá trình apoptosis [16].
Cao chiết từ loài Phyllanthus emblica chứa các hợp chất polyphenol, đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế sự xâm lấn, di chuyển và gắn bám của tế bào ung thư Nghiên cứu của Sumalatha vào năm 2013 cho thấy cao chiết ethanol từ loài này có khả năng chống oxy hóa và ức chế dòng tế bào ung thư tá tràng HT-29.
Giới thiệu chung về cây chùm ruột
1.2.1 Đặc điểm cây chùm ruột
Cây chùm ruột, hay còn gọi là tầm ruột, có tên khoa học là Phyllanthus acidus, thuộc họ Thầu dầu Đây là loài cây vừa được trồng làm cảnh vừa lấy quả, có chiều cao trung bình từ 4-6 mét, tối đa lên đến 10 mét Cây có tán rộng, hoa màu hồng và thường được trồng trong sân nhà hoặc vườn Thân cây gỗ bở, với nhiều cành mọc từ thân chính, cành giòn dễ gãy, và nhánh cây sần sùi Ở cuối mỗi cành chính, có các nhánh nhỏ màu xanh dài từ 15 cm.
Chùm ruột là loại cây có chiều cao khoảng 30 cm, mọc thành chùm dày đặc với rễ chùm lan rộng và ăn sâu vào lòng đất Lá chùm ruột nhỏ, xếp so le, có hình dạng lá chét trứng, dài từ 4-5 cm và rộng 1.5-2 cm Hoa của cây thường nở thành từng chùm vào tháng 3-5, và quả chín vào tháng 6-8 Quả mọc thành từng chùm trên cành non, cành già hoặc ngay trên thân, có vỏ màu xanh non chuyển sang vàng nhạt, mờ đục Mỗi quả chứa một hạt cứng, to, nằm ở trung tâm, và vị của chùm ruột rất giòn và chua.
Hình 1.2 Một số hình ảnh về cây chùm ruột (Phyllanthus acidus)
1.2.2 Cây chùm ruột trong y học cổ truyền
Chùm ruột, một loại trái cây quen thuộc với người phương Đông, không chỉ được sử dụng trong ẩm thực mà còn có nhiều công dụng chữa bệnh Quả và lá chùm ruột có thể ăn sống, chế biến thành các món ăn hoặc làm mứt, mang lại lợi ích cho sức khỏe như tăng cường đề kháng và giải độc Trong khi đó, lá chùm ruột có thể dùng để nấu nước tắm, giúp điều trị các bệnh ngoài da như ngứa và lở loét Vỏ thân cây chùm ruột, khi phơi khô và tán nhuyễn, có thể được sử dụng để chữa các bệnh liên quan đến ung nhọt và tiêu đờm Mặc dù rễ chùm ruột có độc tính cao, nhưng nó vẫn được sử dụng trong y học dân gian ở Malaysia để trị nhức đầu và ho, và ở đảo Giava dùng để chữa hen suyễn với liều lượng rất nhỏ.
1.2.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về cây chùm ruột
Nghiên cứu gần đây tại Việt Nam đã phát hiện nhiều hợp chất sinh học có hoạt tính cao từ cây chùm ruột Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Nguyen T T đã cô lập các hợp chất phenylbutanoid và diphenylheptanoid, bao gồm một hợp chất diphenylpentanoid mới Đến nay, các hợp chất phenylbutanoid và phenylheptanoid vẫn chưa được công bố trong chi Phyllanthus Các hợp chất được cô lập gồm glochodinone, 4-[4’-(O-y?-D-glucopyranosyl)phenyl-2-butanone và 1-[4’-(O-y?-D-glucopyranosyl)phenyl]-5-[4”(O-y?-D-glucopyranosyl)phenyl]-3-pentanone Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Duong T H đã công bố 6 hợp chất flavonoid chứa nhóm sulfonic acid, bao gồm acidoflavanone, acidoauronol và 5-O-methylacidoauronol.
(6), acidoaurone (7), acidoisoflavone (8), and acidoflavonol (9) [9] Năm 2017, Duong
T.H và cộng sự đã cô lập và công bố 2 hợp chất diterpene mới từ rễ cây chùm ruột là phyllane A (10) và phyllane B (11) [12].
Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cao chiết từ cây chùm ruột cho thấy nhiều tiềm năng, bao gồm khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, và kháng ký sinh trùng giun đũa Ngoài ra, cây còn có tác dụng chống lại bệnh sơ nang và kháng bleomycin gây viêm phổi Đặc biệt, các thí nghiệm trên chuột lang cho thấy cao chiết này giúp giảm mỡ ở các mô và tạng, cũng như giảm lipid trong huyết thanh và gan sau 6 tuần sử dụng.
Nghiên cứu hoá thực vật trên cây chùm ruột đã chỉ ra sự cô lập của các hợp chất triterpene và phytosterol từ khá sớm Các triterpene được phát hiện bao gồm oleane như /-íimyTÍn, lupane như lupeol, và cyclopropyl-hexacyclic triterpenoid như phyllanthol Ngoài ra, các hợp chất sterol chủ yếu có cấu trúc sitosterol và các glycoside liên quan.
Trong 15 năm qua, nhiều nghiên cứu trên toàn cầu đã chỉ ra rằng cây Phyllanthus acidus chứa một nhóm hợp chất norbisabolane sesquiterpenoid với hoạt tính sinh học đa dạng Năm 2000, các nhà khoa học đã cô lập thành công hai hợp chất phyllanthusol A và B, có cấu trúc khung serquiterpenoid loại norbisabolane, được gắn với các phân tử đường glucosyl và mannosamine-N-acetate.
Đến năm 2014, 19 hợp chất thuộc khung sườn norbisabolane đã được cô lập, trong đó có phyllanthusol A và B với cấu trúc xác định gồm hai đơn vị đường là glucopyranosyl và glucosamine-N-acetate Tổng cộng, 21 hợp chất norbisabolane đã được phát hiện, được gọi là phyllanthacidoid A-T Hai hợp chất phyllantacidoid S và T có cấu trúc độc đáo với phần tricyclo[3.1.1.1] Các hợp chất này đã được thử nghiệm với hoạt tính kháng virus viêm gan siêu vi B (HBV) và cho giá trị IC50 trong khoảng 0.8-36.0 pM Ngoài ra, phyllanthacidoid là thành phần chính trong rễ cây chùm ruột, với hàm lượng khoảng 1 mg/g, được xác nhận qua phương pháp điện di.
Năm 2010, các hợp chất kaemferol (36), adenosine (37), 4-hydroxybenzoic acid
Cao n-butanol từ lá cây chùm ruột đã được sử dụng để cô lập hypogallic acid, caffeic acid và 5 hợp chất khác, tất cả đều cho thấy khả năng giảm huyết áp và giãn cơ vòng ở động mạch chủ Năm 2019, nghiên cứu của Sichaem J và cộng sự đã xác định và công bố 11 hợp chất từ cành và lá của cây Phyllanthus acidus.
Norlupane-1/-hydroxy-3,20-dione triterpenoid (41), 29-norlup-1-ene-3,20-dione
(42), phyllanthol (13), phyllanthone (43), glochidone (1), lupeol (14), lupeone (44),4-hydroxybenzoic acid (38), 4-hydroxybenzaldehyde (45), phyllane A (10) và methyl b-orsellinate (46) [26].
Dưới đây là một số công thức cấu tạo chất đã phân lập được từ cây chùm ruột:
Hình 1.3 Một số hợp chất cô lập từ cây chùm ruột
Hình 1.4 Một số hợp chất cô lập từ cây chùm ruột (tiếp theo)
Hình 1.5 Một số hợp chất cô lập từ cây chùm ruột (tiếp theo)
Hình 1.6 Một số hợp chất cô lập từ cây chùm ruột (tiếp theo)
THỰC NGHIỆM
Hóa chất, máy móc, thiết bị
• Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm: ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, n-hexane và nước cất.
• Sắc kí bản mỏng loại Kiesel gel 60 F254 (20x20, Merck).
• Silica gel pha thường, silica gel pha đảo, Sephadex LH-20.
• Thuốc thử để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng: dung dịch vanillin/H 2 SO 4
• Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.
• Các cột sắc kí pha thường, cột sắc kí pha đảo.
• Máy cô quay chân không.
• Bếp điện từ gia nhiệt.
• Các hợp chất được ghi phổ 1D và 2D-NMR tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội.
Mẫu lá chùm ruột (Phyllanthus acidus) được thu thập tại tỉnh Lampang, Thái Lan vào tháng 1 năm 2019 và được định danh bởi Tiến sĩ Suttira Khumkratok từ Đại học Mahasarakham Mẫu cây này hiện được lưu giữ với kí hiệu khumkratok no 03-19.
Lá cây chùm ruột sấy khô (3.0 kg) được nghiền thành bột và ngâm trong dung môi methanol (5 Lx5) Sau đó, dịch cao methanol được cô quay giảm áp để thu được 100 g cao methanol thô Tiến hành chiết lỏng lỏng lần lượt bằng n-hexane, n-hexane: EtOAc (1:1, v/v) và EtOAc, thu được các cao phân đoạn tương ứng là cao H (20 g), cao HEA (28,2 g) và cao EA (29,5 g).
Cao HEA được chọn để sắc kí cột Sephadex LH-20 (100 g) với dung môi
CH 3 OH 100% thu được 4 phân đoạn I (HA1-HA4) Phân đoạn HA4 (1.4 g) được sắc kí cột với hệ dung môi w-hexane: CHCl 3 : EtOAc: acetone: H 2 O (12:1:2:2:0.02, v/v/v/v/v), thu được 5 phân đoạn II (PC1 - PC5) Tiếp tục sắc kí cột phân đoạn PC3 với hệ dung môi w-hexane: CHCE: EtOAc: acetone: H 2 O (12:1:2:2:0.02, v/v/v/v/v), thu được 1 hợp chất kí hiệu lần lươt là PUVA (1.1 mg).
Hệ dung môi X: n-hexane: CHC13: EtOAc: acetone: H2O (12:1:2:2:0.02, v/v/v/v/v)
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình cô lập hợp chất PUVA
Quy trình thực nghiệm
Lá cây chùm ruột sấy khô (3.0 kg) được nghiền thành bột và ngâm trong dung môi methanol (5 Lx5), sau đó phần dịch cao methanol được cô quay giảm áp để thu được cao methanol thô (100 g) Tiến hành chiết lỏng lỏng lần lượt bằng n-hexane, n-hexane: EtOAc (1:1, v/v) và EtOAc, thu được các cao phân đoạn tương ứng là cao H (20 g), cao HEA (28,2 g) và cao EA (29.5 g).
Cao HEA được chọn để sắc kí cột Sephadex LH-20 (100 g) với dung môi
CH 3 OH 100% thu được 4 phân đoạn I (HA1-HA4) Phân đoạn HA4 (1.4 g) được sắc kí cột với hệ dung môi w-hexane: CHCl 3 : EtOAc: acetone: H 2 O (12:1:2:2:0.02, v/v/v/v/v), thu được 5 phân đoạn II (PC1 - PC5) Tiếp tục sắc kí cột phân đoạn PC3 với hệ dung môi w-hexane: CHCE: EtOAc: acetone: H 2 O (12:1:2:2:0.02, v/v/v/v/v), thu được 1 hợp chất kí hiệu lần lươt là PUVA (1.1 mg).
Hệ dung môi X: n-hexane: CHC13: EtOAc: acetone: H2O (12:1:2:2:0.02, v/v/v/v/v)
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình cô lập hợp chất PUVA
