GIỚI THIỆU VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA ĐỀ TÀI
Đặt vấn đề
Ngày nay, biến đổi khí hậu và ô nhiễm môi trường đang ở mức báo động, khiến con người tiếp xúc với nhiều yếu tố nguy hại như phóng xạ, năng lượng cao, ngộ độc thực phẩm, thuốc bảo vệ thực vật và tia tử ngoại Những tác nhân này không chỉ gây ra stress mà còn dẫn đến tình trạng dư thừa chất béo, làm tăng nhanh quá trình lão hóa và nguy cơ mắc các bệnh nguy hiểm như ung thư và Alzheimer.
Bác Sĩ Hans Frischer, chuyên gia nghiên cứu về hồng huyết cầu và là nhà khoa học đoạt giải Nobel, đã phát hiện rằng cấu trúc của hồng huyết cầu tương tự như cấu trúc của Chlorophyll Hồng huyết cầu trong cơ thể con người có chức năng vận chuyển dưỡng khí, với sắt (Fe) là thành phần chính, trong khi magnesium (Mg) là yếu tố cấu thành Chlorophyll Sự tương đồng này cho phép cơ thể chuyển đổi chlorophyll thành hồng huyết cầu, từ đó tăng cường chỉ số hồng huyết cầu, hỗ trợ gan, giải độc và loại bỏ các chất độc hại trong máu.
Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng chlorophyll hoạt động như một chất chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp làm chậm quá trình lão hóa bằng cách quét các gốc tự do như DPPH và Hydroxyl, đồng thời khử sắt và ngăn ngừa oxy hóa lipid Ngoài ra, chlorophyll còn có khả năng ngăn ngừa ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm và hỗ trợ trong việc điều trị vết thương.
Cây lúa là cây lương thực chủ yếu không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới Dự báo vào năm 2010, lượng gạo xuất khẩu từ Đồng bằng sông Cửu Long sẽ đạt từ 5,5 đến 6 triệu tấn, với các tỉnh Kiên Giang, Cần Thơ, An Giang và Đồng Tháp là những nơi có sản lượng xuất khẩu cao nhất Ở Việt Nam, cây lúa chủ yếu được trồng để thu hoạch hạt, trong khi thân và lá lúa thường được sử dụng làm thức ăn cho gia súc hoặc trở thành phế liệu nông nghiệp.
Khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại học Công Nghệ Đồng Nai đã giao cho chúng tôi nghiên cứu đề tài "Nghiên cứu trích ly chlorophyll từ cây lúa non" Mục tiêu của nghiên cứu này là tận dụng cây lúa non để thu nhận chlorophyll, phục vụ cho ngành thực phẩm.
Mục đích và nội dung nghiên cứu
Xác định thông số cho quá trình trích ly chlorophyll: nồng độ dung môi trích ly, tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu, thời gian và nhiệt độ chiết.
Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm, nhiệt độ ngâm và thời gian ủ đến sự phát triển của hạt lúa Kết quả được xác định dựa trên tiêu chuẩn mầm hạt dài 1/2 chiều dài hạt lúa, nhằm tối ưu hóa quy trình ngâm và ủ hạt lúa.
Hạt lúa được khảo sát để xác định hàm lượng chlorophyll theo từng ngày, nhằm chọn ra thời điểm thu hoạch lúa non với hàm lượng chlorophyll cao nhất Nghiên cứu cũng đánh giá hiệu quả của các loại dung môi trích ly như methanol, ethanol và acetol, cũng như nồng độ của các dung môi này Quá trình trích ly được thực hiện bằng sóng siêu âm ở các bước sóng DEGAS, SOLF và NORMAL.
Sau khi khảo sát bước sóng siêu âm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tỉ lệ nguyên liệu và dung môi, cũng như thời gian trích ly, nhằm xác định thông số tối ưu cho quá trình trích ly chlorophyll.
Ý nghĩa khoa học
Tìm hiểu được các tác động ánh hượng đển hát luá náy mám.
Tìm ra các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly chlorophyll.
Ý nghĩa thực tiễn
Hượng tợi nghiển cưu xáy dưng quy trình tư hát luá đển quá trình trìch ly rá chlộrộphyll nhánh nhát, nhằm tối ưu hóa hàm lượng chlộrộphyll và phát hiện các sản phẩm có lợi cho sức khỏe con người từ cây luá Ngoài ra, nghiên cứu còn giúp tìm ra các hợp chất khác có trong cây luá.
CỞ SỞ LÝ THUYẾT
Giới thiệu về cây lúa
Lúa gạo, với tên khoa học là Oryza sativa, là loại lương thực thiết yếu cho khoảng 3,5 tỷ người, chủ yếu tập trung ở châu Á và châu Mỹ La Tinh, chiếm 50% dân số toàn cầu Tại Việt Nam, diện tích trồng lúa ước tính đạt 7,8 triệu ha vào năm 2015, với năng suất bình quân đạt 57,7 tạ/ha trong cùng năm.
Đặc điểm hình thái cây lúa
Lúa là cây lương thực chính của thế giới, thuộc nhóm cỏ đã thuần dưỡng, có chiều cao từ 1-1,8 m, với lá mỏng, hẹp dài 50–100 cm Màu sắc lá lúa thay đổi theo thời kỳ sinh trưởng, và khi chín, lúa chuyển sang màu vàng Hoa lúa nhỏ tự thụ phấn, mọc thành cụm dài 35–50 cm Hạt lúa, hay còn gọi là thóc, có kích thước 5–12 mm và dày 2–3 mm Cây lúa non được gọi là mạ, có thể gieo thẳng hạt đã nảy mầm vào ruộng đã chuẩn bị hoặc gieo trên ruộng riêng để phát triển tốt, sau đó nhổ mạ để cấy vào ruộng chính Sản phẩm thu được từ cây lúa là hạt lúa.
Rễ lúa thuộc loại rễ chùm, với những rễ non có màu trắng sữa, rễ trưởng thành mang màu vàng nâu và nâu đậm, trong khi rễ già có màu đen.
Hinh 2.1 Bộ rễ cây lúa
Thời kỳ mạ: Nếu mạ gieo thưa, rễ mạ có thể dài 5-6 cm Tiêu chuẩn của mạ tốt là bộ rễ ngắn, nhiều rễ trắng.
Thời kỳ sau cấy: Bộ rễ tăng dần về số lượng và chiều dài ở thời kỳ đẻ nhánh, làm đòng.
Thời kỳ trỗ bông là giai đoạn mà bộ rễ phát triển tối đa, với số lượng rễ có thể lên tới 500 – 800 cái Chiều dài của rễ đạt từ 2 đến 3 dm mỗi cây khi được trồng riêng trong chậu.
Hinh 2.2 Thời kỳ rễ cây lúa
Trên đồng ruộng, rễ lúa chủ yếu phát triển ở độ sâu 0-20 cm Khi cấy lúa quá sâu (>5 cm), cây sẽ tạo ra 2 tầng rễ và chậm phát triển như bị ngẹt rễ Cấy ở độ sâu thích hợp (3-5 cm) giúp khắc phục tình trạng này Để bộ rễ phát triển tốt, cần làm cỏ, sục bùn, điều chỉnh lượng nước hợp lý và giữ cho tầng đất vùng rễ thông thoáng Điều này giúp cây lúa sinh trưởng khỏe mạnh, chống chịu sâu bệnh và nâng cao năng suất.
Thân gồm nhiều mắt và lóng Trước thời kỳ lúa trỗ, thân lúa được bao bọc bởi bẹ lá.
Số mắt trên thân chính của cây bằng tổng số lá cộng thêm 2 Chỉ có một vài lóng ở ngọn dài ra, trong khi các lóng còn lại ngắn và dày đặc Trong đó, lóng trên cùng là dài nhất, và bất kỳ lóng nào dài hơn 5 mm được coi là lóng dài.
Số lóng dài: Từ 3-8 lóng Theo giải phẫu ngang lóng, lóng có một khoảng trống lớn gọi là xoang lỏi.
Chiều cao thân Được tính từ gốc đến cổ bông.
Chiều cao thân và chiều cao cây liên quan đến khả năng chống đổ của giống lúa.
Cây lúa bắt đầu đẻ nhánh khi có từ 4-5 lá thật và sau khi bén rễ hồi xanh Quá trình đẻ nhánh diễn ra tại ruộng lúa cấy và kết thúc vào thời kỳ làm đốt, làm đòng.
Cây mẹ sinh ra nhánh cấp 1, từ nhánh cấp 1 lại phát triển thành nhánh cấp 2, và nhánh cấp 2 tiếp tục tạo ra nhánh cấp 3 Những nhánh hình thành ở giai đoạn cuối thường không có tác dụng.
Thường thì các giống lúa mới khả năng đẻ nhánh cao, tỷ lệ nhánh hữu hiệu cũng cao hơn các giống lúa cũ, cổ truyền.
Khả năng đẻ nhánh của cây lúa phụ thuộc vào giống và các điều kiện chăm sóc cũng như yếu tố ngoại cảnh Cây lúa có nhiều nhánh và tỷ lệ nhánh hữu hiệu cao sẽ đạt năng suất cao hơn.
Lá lúa điển hình gồm: bẹ lá, phiến lá, lá thìa và tai lá.
Bẹ lá là phần đáy của lá, kéo dài và cuộn thành hình trụ, bao bọc phần non của thân cây Phiến lá thì hẹp, phẳng và thường dài hơn bẹ lá, ngoại trừ lá thứ hai.
Lá thìa: là vảy nhỏ và trắng hình tam giác.
Tai lá: Một cặp tai lá hình lưỡi liềm
Lá được hình thành từ các mầm lá ở mắt thân Tốc độ ra lá thay đổi theo thời gian sinh trưởng và điều kiện ngoại cảnh.
Thời kỳ mạ non: trung bình 3 ngày ra được 1 lá.
Thời kỳ mạ khoẻ: từ lá thứ 4, tốc độ ra lá chậm lại, 7-10 ngày ra được 1 lá. Thời kỳ đẻ nhánh: 5-7 ngày /1lá ở vụ mùa.
Cuối thời kỳ đẻ nhánh – làm đòng: khoảng 12 – 15 ngày / lá cây lúa trỗ bông cũng là lúc hoàn thành lá đòng.
Số lá trên cây phụ thuộc chủ yếu vào giống, thời vụ cấy, biện pháp bón phân và quả trình chăm sóc Thường số lá của các giống:
Giống lúa ngắn ngày: 12 – 15 lá.
Giống lúa trung ngày: 16 – 18 lá.
Giống lúa dài ngày: 18 – 20 lá.
Lá ở thời kỳ nào thường quyết định đến sinh trưởng của cây trong thời kỳ đó.
Ba lá cuối cùng thường liên quan và ảnh hưởng trực tiếp đến thời kỳ làm đòng và hình thành hạt.
Chức năng của bẹ lá
Chống đỡ cơ học cho toàn cây.
Dự trữ tạm thời các Hydratcacbon trước khi lúa trỗ bông.
Lá cây thực hiện chức năng quang hợp, vì vậy việc chăm sóc hợp lý và bảo đảm sức khỏe cho bộ lá, đặc biệt là lá đòng, là rất quan trọng Khi lá khỏe mạnh, lúa sẽ phát triển chắc hạt và đạt năng suất cao.
Thời gian hình thành bông lúa kéo dài từ khi cây lúa bắt đầu phân hoá đòng cho đến khi lúa trỗ Trong giai đoạn này, nếu được chăm sóc và bón phân đầy đủ, cây lúa sẽ phát triển bông khỏe mạnh và giữ nguyên đặc tính của giống Đặc biệt, thời gian phát triển bông ở giống lúa ngắn ngày thường ngắn hơn so với giống dài ngày.
Hinh 2.7 Bông và hạt lúa
Hạt lúa gồm: Gạo lức và vỏ trấu.
Gạo lức gồm: phôi và phôi nhũ.
Vỏ trấu bao gồm hai phần: trấu trên và trấu dưới, trong đó trấu dưới lớn hơn và chiếm khoảng hai phần ba bề mặt của gạo lức trưởng thành Ở độ ẩm 0%, trọng lượng của một hạt lúa dao động từ 12 đến 44 mg, với kích thước chiều dài, rộng và độ dày khác nhau tùy thuộc vào từng giống lúa.
Quá trình chín của hạt gồm: chín sữa, chín sáp và chín hoàn toàn Thời gian chín từ 30 – 35 ngày tuỳ theo giống, môi trường và biện pháp canh tác.
Đặc điểm hình thái của cây mạ
Cây mạ có chiều cao từ 10 đến 20 cm, với thân ngắn, mảnh và màu xanh nổi bật Lá cây dài, mảnh và thẳng đứng, có màu xanh non hoặc xanh ngọc Rễ của cây mạ dạng chum, nhỏ và bám chắc vào đất trồng.
Là cây ưu sáng, có nhu cầu nước và độ ẩm cao Ưu không khí và đất màu mỡ, sống tốt trong môi trường nước.
Thời gian mạ lúa có thể dài hoặc ngắn tùy thuộc vào giống lúa, mùa vụ và phương pháp gieo trồng Đối với các giống lúa cũ dài ngày, thời kỳ mạ khi gieo mạ ruộng (mạ dược) thường kéo dài hơn.
40 – 45 ngày ở vụ mùa, 50 -60 ngày ở vụ đông xuân, các giống lúa ngắn ngày khoảng
Gieo mạ nền và mạ sân trong khoảng thời gian 25-30 ngày Đối với trà xuân muộn, tuổi mạ từ 15-18 ngày, trong khi gieo mạ khay (mạ Nhật Bản) chỉ mất 7-10 ngày, tương ứng với 2,5-3 lá ở vụ mùa.
Từ khi gieo hạt đến khi cây mạ phát triển được 3 lá thật, tốc độ hình thành lá diễn ra nhanh chóng Rễ phôi cũng phát triển, hình thành một số lứa rễ đầu tiên, tuy nhiên số lượng rễ vẫn còn hạn chế Để đảm bảo cây mạ sinh trưởng thuận lợi, cần giữ ẩm cho ruộng mạ và tránh tình trạng ngập úng hoặc hạn hán.
Trong giai đoạn này, cây mạ chủ yếu nhận dinh dưỡng từ chất dự trữ trong hạt, do đó chưa cần bón thúc Cây mạ còn nhỏ và yếu, khả năng chống chịu kém, vì vậy cần tạo điều kiện thuận lợi để cây có thể chống chọi với rét và sâu bệnh.
Từ khi cây mạ có 4 lá thật đến khi có 5 – 6 lá đối với giống trung ngày và 6 –
7 lá đối với giống dài ngày là có thể nhổ cấy.
Trong thời kỳ này, cây mạ cần được chăm sóc và bón thúc để phát triển, sử dụng dinh dưỡng từ môi trường Chiều cao và kích thước cây mạ tăng mạnh, có thể ra được 4 – 5 lứa rễ, đồng thời khả năng chống chịu cũng được cải thiện Ở miền Bắc, trong những năm rét, mạ sinh trưởng chậm và tốc độ ra lá giảm, khiến thời kỳ mạ kéo dài Ngược lại, trong năm ấm, tốc độ ra lá nhanh, mạ sớm đạt tuổi cấy, do đó cần áp dụng biện pháp hãm mạ để tránh tình trạng mạ già và mạ ống.
Thời kỳ mạ đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của cây lúa Việc chăm sóc mạ tốt và đảm bảo mạ khỏe mạnh sẽ giúp cây lúa hồi xanh nhanh chóng sau khi cấy, nâng cao khả năng đẻ nhánh và tạo điều kiện thuận lợi cho các giai đoạn sinh trưởng tiếp theo.
Thành phần dinh dưỡng có trong lúa non chủ yếu là carbohydrate, đồng thời cũng có một lượng vừa phải chất đạm như calo, photpho, protein…
Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng có trong cây lúa non
Thành phần Giá trị dinh dưỡng
Thành phần Giá trị dinh dưỡng
Hydratcacbon (%) 35,4 Kali (mg%) 74,00 Đường tổng số (g
Chlorophyll, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng
Hình 2.9 Chlorophyl dưới kính hiển vi
Chlorophyll là sắc tố màu xanh lá cây có mặt trong thực vật, đặc biệt là ở lá, đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp Quá trình này giúp cây hấp thụ ánh sáng mặt trời để sản xuất hợp chất hữu cơ và cung cấp oxy cho trái đất.
Là sắc tố quang tổng hợp màu xanh lá cây có ở thực vật, tảo, vi khuẩn lam,lượng chlorophyll có trong tế bào phụ thuộc vào lượng sinh khối
Chúng là phân tử sinh học rất quan trọng, quyết định đến quá trình quang hợp của cây, giúp cây tổng hợp năng lượng từ ánh sáng
Hình 2.10 Sự phân bố chlorophyll trung bình trên bề mặt nước biển (mg/chl m 3 )
2.4.2 Lịch sử nghiên cứu chlorophyll
Chlorophyll được phân lập lần đầu bởi Joseph Bienaimé Caventou and Pierre Joseph Pelletier vào năm 1817 [4]
Năm 1913, nhà hóa học người Đức Richard Wllstatter đã chỉ ra rằng tất cả năng lượng sống đều phụ thuộc vào mặt trời Ông phát hiện ra rằng cây xanh có khả năng giữ năng lượng mặt trời Đến năm 1919, Wllstatter đã giải thích rằng chất giữ năng lượng mặt trời chính là Chlorophyll Thực vật bậc cao với lá xanh có khả năng hấp thụ năng lượng bức xạ và chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể.
Cấu trúc tổng quát của chlorophyll được Hans Fischer tìm ra vào năm 1940 và đến năm 1960 cấu trúc lập thể của chlorophyll a đã được làm sáng tỏ hoàn toàn.
2.4.3 Cấu trúc và quá trình sinh hóa tổng hợp chlorophyl
Cấu trúc chung của chlorophyll được làm sáng tỏ bởi Hans Fischer vào năm
1940 Năm 1960, hầu hết các lập thể của chlorophyll đã được biết đến, Robert Burns Woodward đã xuất bản một tổng hợp tổng số về phân tử
Vào năm 1967, Ian Fleming đã hoàn thành việc giải thích lập thể cuối cùng Đến năm 2010, chlorophyll được công nhận tồn tại ở vi khuẩn lam và các vi sinh vật hiếu khí khác có khả năng hình thành stromatolites Chlorophyll có công thức phân tử C55H70O6N4Mg, và cấu trúc 2-formyl-chlorophyll đã được phân tích thông qua các phương pháp NMR, quang học và phổ khối.
Chlorophyll chứa nhân porphyrin, được hình thành từ bốn vòng pyrol liên kết qua cầu nối ethyl, tạo thành một vòng kín với tâm là ion Mg Ngoài ra, chlorophyll còn có một vòng phụ thứ.
5 Nhân porphyrin có 2 gốc rượu methanol (CH3OH) và fythol (C20H39OH) nối nhau tại vị trí C10 và C7, và 10 nối đôi tạo cơ sở cho quá trình quang hóa.
Sự khác nhau giữa chlorophyll a và chlorophyll b là tại vị trí C7 ở chlorophyll a là nhóm -CH3, còn ở chlorophyll b là nhóm –CHO [6]
Trong hầu hết các loài thực vật bậc cao, tỷ lệ giữa chlorophyll a và chlorophyll b thường là 3/1 Tuy nhiên, tỷ lệ này có thể thay đổi tùy thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm loài thực vật, trạng thái sinh trưởng và điều kiện môi trường như độ sáng, độ ẩm và hàm lượng khoáng chất.
Ví dụ: thực vật sống ở nới có ánh sáng nhiều thì thường có tỉ lệ chlorophyll a so với chlorophyll b cao hơn đối với thực vật ở chỗ mát, tối.
Bảng 2.2 Cấu trúc các phân tử chlorophyll
Cấu trúc chlorophyll a Cấu trúc chlorophyll b Cấu trúc chlorophyll d
Một số cấu trúc khác nhau của chlorophyll được tóm tắt dưới bảng sau:
Bảng 2.3 Các cấu trúc khác nhau của phân tử chlorophyll
Diệp lục tố a Diệp lục tố b
Diệp lục tố c2 Diệp lục tố d
Phân Mg Mg Mg Mg Mg tử
C3 -CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CHO
C7 -CH3 -CHO -CH3 -CH3 -CH3
-CH2CH3 -CH2CH3 -CH2CH3 -CH=CH2 -CH2CH3
C18 Đơn Đơn Kép Đơn Kép
Phổ biến Đa số thực vật
Các loại tảo khác nhau
Các loại tảo khác nhau
Quá trình tổng hợp chlorophyll ở thực vật bắt đầu từ succinyl-CoA và glycine, với tiền chất chính để hình thành chlorophyll a và b là protochlorophyllide.
Trong thực vật hạt kín, quá trình chuyển đổi protochlorophyllide thành chlorophyll phụ thuộc vào ánh sáng, dẫn đến việc thực vật có màu nhạt khi được trồng trong bóng tối.
Thực vật không mạch và tảo xanh sở hữu một enzyme không phụ thuộc vào ánh sáng, cho phép chúng phát triển màu xanh ngay cả trong bóng tối Chlorophyll kết hợp với protein giúp chuyển đổi năng lượng hấp thụ theo nhu cầu.
2.4.4 Hoạt tính chống oxi hóa của chlorophyll
Chlorophyll và các dẫn xuất của nó, như chlorophyllin, có hoạt động chống oxy hóa mạnh mẽ Tiêu thụ rau lá giàu chlorophyll có thể giúp giảm nguy cơ mắc một số loại ung thư Do đó, việc duy trì chế độ ăn uống giàu chlorophyll không chỉ có lợi cho sức khỏe mà còn có thể ngăn ngừa hoặc trì hoãn sự xuất hiện của các bệnh liên quan đến lão hóa do gốc tự do gây ra.
Nghiên cứu trên động vật cho thấy các dẫn xuất của chlorophyll, như chlorophyllin, có hoạt tính chống oxy hóa tương đương vitamin C Chlorophyll giúp ức chế quá trình peroxy hóa lipid và bảo vệ ty thể khỏi hư hại do gốc tự do và các phản ứng oxy hóa khác Ngoài ra, chlorophyllin còn có khả năng ngăn chặn bức xạ gây biến đổi DNA và tổn thương màng ty thể.
Chất chống oxy hóa và hoạt động antimutagenic của các dẫn xuất chlorophyll trong chế độ ăn uống đã được nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá dựa trên khả năng của các hợp chất trong việc thu gom gốc tự do, cụ thể là 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS +).
Hoạt động antimutagenic đã được nghiên cứu với vi khuẩn Salmonella typhimurium TA100, sử dụng benzo[a]pyrene như chất gây đột biến Kết quả cho thấy các dẫn xuất của chlorophyll a có khả năng bắt gốc tự do hiệu quả hơn so với các dẫn xuất của chlorophyll b.
Các dẫn xuất kim loại tự do của chlorophyll, bao gồm chlorins, pheophytins và pyropheophytins, có khả năng chống oxy hóa thấp hơn so với các dẫn xuất kim loại như Mg-chlorophyll, Zn-pheophytins, Zn-pyropheophytins, Cu-pheophytins và Cu-chlorophyllins.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các dẫn xuất của chlorophyll trong chế độ ăn uống, bao gồm cả thực phẩm tươi và chế biến, có tác dụng chống oxy hóa và hoạt động antimutagenic Nghiên cứu về chlorophyll từ bột Spirulina đã được thực hiện nhằm xác định hàm lượng chlorophyll a, so sánh mô hình suy thoái của chlorophyll a và chiết xuất thô, đồng thời điều tra sự khác biệt trong hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll dưới tác động của chiếu xạ.
Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll a được xác định thông qua phương pháp DPPH, cho thấy rằng sau 60 phút chiếu xạ, hoạt tính này tăng lên rõ rệt.
Tình hình nghiên cứu chlorophyll trong nước và trên thế giới
Nghiên cứu chlorophyll trong nước là công cụ quan trọng để đánh giá năng suất sinh học sơ cấp tại các vùng sinh thái biển ven bờ Việc này được thực hiện thông qua việc đo lường hàm lượng chlorophyll a, với dữ liệu được thu thập theo đơn vị gam chlorophyll a/m3 hoặc gam chlorophyll a/m2.
Methanol là dung môi tối ưu để trích xuất chlorophyll từ Nannochloropsis gaditana, theo phương pháp Lichtenthaler 1983 sau 24 giờ chiết tách Việc áp dụng kỹ thuật phá vỡ vách tế bào giúp nâng cao năng suất chiết tách, với kỹ thuật đông lạnh bằng nitơ lỏng cho hiệu quả tốt hơn so với siêu âm trong 15 phút đối với các sắc tố bền như carotenoid Dung môi ưa nước như methanol đóng vai trò quan trọng trong quá trình chiết tách, không bị ảnh hưởng bởi các phương pháp vật lý hay cơ học Chlorophyll thường được sử dụng như chỉ số dinh dưỡng, do mối quan hệ trực tiếp với sinh khối tảo, là yếu tố quan trọng để phát hiện hiện tượng phú dưỡng Định lượng chlorophyll a là phương pháp dễ dàng hơn so với việc đo lường sinh khối tảo, nhưng có sự biến đổi về hàm lượng chlorophyll a giữa các loài và cần lựa chọn phương pháp định lượng phù hợp, chú ý đến tính kháng của vách tế bào Do đó, nguồn gốc của vật liệu sinh học là yếu tố quyết định trong việc chọn lựa phương pháp chiết tách hiệu quả nhất.
Pepe và cộng sự đã giới thiệu hai phương pháp chiết tách chlorophyll a: một là sử dụng ethanol và một là methanol lạnh Sự khác biệt về năng suất chiết tách được giải thích bởi thành phần vi tảo, với ethanol cho kết quả tốt hơn cho các chủng Chlorophyceae và Dinophyceae, trong khi methanol lại hiệu quả hơn với Bacillariophyceae Điều này cho thấy khả năng chiết tách của dung môi phụ thuộc vào tính hydrat hóa và tính thấm của thành tế bào vi tảo Ngoài ra, sự ảnh hưởng của cấu trúc tế bào, sự biến đổi của sắc tố trong quá trình chiết tách, và tác động của các sắc tố khác lên chlorophyll có thể làm phức tạp việc xác định chlorophyll và dẫn đến sai sót trong ước tính.
Louda và Monghkonsri đã so sánh ước tính quang phổ hàm lượng chlorophyll với kết quả từ sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) và kết luận rằng phương pháp quang phổ chlorophyll dựa trên UNESCO và công thức của Jeffrey và Humphrey cho kết quả tuyệt vời Hai nghiên cứu này cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa hai phương pháp Phân tích quang phổ nhanh chóng và tiết kiệm hơn HPLC, là công cụ hiệu quả để đánh giá chlorophyll thường xuyên Nannochloropsis gaditana chỉ chứa chlorophyll a, do đó, việc đánh giá tổng số chlorophyll tương đương với việc định lượng một loại sắc tố cụ thể Các phương pháp định lượng chlorophyll bao gồm tách tế bào vi tảo, chiết tách sắc tố bằng dung môi hữu cơ và sử dụng quang phổ để xác định nồng độ chlorophyll trong chiết tách.
Việc chọn lựa dung môi trong quá trình chiết tách là rất quan trọng, vì nó ảnh hưởng đến khả năng hòa tan và ly giải tế bào của các hợp chất Dung môi mạnh có thể nâng cao năng suất chiết tách, đặc biệt với các vách tế bào cứng Mặc dù methanol từng là dung môi chính, nhưng do độc tính, nó đã được thay thế bằng các dung môi khác như acetone và ethanol Theo khuyến nghị của Edler, từ năm 1995, acetone đã được sử dụng để đánh giá hàm lượng chlorophyll Trong kỹ thuật phá vỡ vách tế bào, có hai nhóm chính: cơ học và phi cơ học Trong nhóm cơ học, siêu âm được áp dụng, trong khi nhóm phi cơ học bao gồm các phương pháp hóa học và vật lý, như quá trình làm đông, có thể thực hiện chậm hoặc nhanh bằng nitơ lỏng, tạo ra cú sốc nhiệt lớn, từ đó tăng cường hiệu quả phá vỡ tế bào.
Thời gian tiếp xúc giữa các hợp chất tế bào và dung môi là yếu tố quan trọng quyết định số lượng sản phẩm chiết Khi ly giải tế bào, cần chú ý đến nồng độ dung môi để bảo vệ các hợp chất cần chiết tách Thời gian chiết tách dài hơn sẽ nâng cao hiệu quả của quá trình Để dễ dàng so sánh các phương pháp và xác định ảnh hưởng của từng bước trong quá trình chiết tách, các định nghĩa cụ thể được đề xuất.
Một phương pháp phân tích bao gồm nhiều hạng mục và thủ tục cần thiết để đánh giá các sắc tố đang được nghiên cứu.
Sử dụng methanol làm dung môi chiết tách để định lượng nồng độ chlorophyll a mang lại kết quả tốt hơn (Mackinney 1941) so với nghiên cứu của Porra và cộng sự Cả hai nghiên cứu đều chỉ ra rằng năng suất chiết tách chlorophyll a tăng lên khi áp dụng các phương pháp cơ học hoặc vật lý để phá vỡ vách tế bào Trong đó, quá trình đóng băng hoặc không đóng băng đạt hiệu quả cao nhất, trong khi siêu âm lại dẫn đến sự lây lan kết quả.
Sử dụng dung môi acetone để chiết tách chlorophyll a cho kết quả năng suất thấp hơn so với methanol, với chỉ các mẫu làm đông/không làm đông cho kết quả gần tương tự Tuy nhiên, tương quan với nghiên cứu của Porra và cộng sự lại không thuận lợi, cho thấy quy trình ly giải tế bào có thể ảnh hưởng đến kết quả Khi áp dụng các điều kiện giống nhau, ba nghiên cứu cho kết quả gần giống nhau, cho thấy tính tương đồng trong các phương trình thực nghiệm liên quan.
Ethanol là một dung môi ít được sử dụng trong việc chiết tách và định lượng sắc tố, với Kaczmar là nghiên cứu duy nhất đã thử nghiệm Kết quả cho thấy phương pháp này hiệu quả hơn so với acetone, mặc dù nồng độ sắc tố thu được tương đương với methanol Kỹ thuật phá vỡ vách tế bào không ảnh hưởng đáng kể đến việc chiết tách chlorophyll, dẫn đến các giá trị nồng độ tương tự Thủ tục tiêu chuẩn cho thấy sự phân tán kết quả, có thể do sự không đồng nhất của mẫu Theo các thí nghiệm, phương pháp tối ưu để đánh giá hàm lượng chlorophyll a trong tế bào vi tảo biển là sử dụng methanol theo Mackinney 1941 hoặc ethanol theo Kaczmar.
Trong thực tế, phương pháp đầu tiên có thuận lợi hơn vì thời gian chiết ngắn
Thời gian chiết tách chlorophyll từ vi tảo là rất quan trọng, với ethanol chỉ mất 20 phút để hoàn thành, trong khi acetone không hiệu quả, cho kết quả rất thấp Điều này gây bất ngờ vì acetone thường được coi là phương pháp phổ biến nhất để định lượng chlorophyll trong nước như một chỉ số dinh dưỡng.
Vách tế bào của Nannochloropsis gaditana có khả năng đề kháng tốt, khiến việc phá vỡ trở nên khó khăn, điều này ảnh hưởng đến quá trình chiết tách chlorophyll Cấu trúc vững chắc của vi tảo này yêu cầu sử dụng dung môi có khả năng chiết tách cao như methanol để đạt hiệu quả tối ưu và phục hồi chlorophyll nhanh chóng Các kỹ thuật phá vỡ vách tế bào đã được thử nghiệm, với mục tiêu chính là đánh giá ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau trong việc chiết tách chlorophyll Nghiên cứu tập trung vào hiệu quả của các phương pháp phá vỡ vách tế bào cơ học và vật lý, cùng với tác động của thời gian chiết tách đến năng suất chlorophyll.
Kết luận, methanol là dung môi tách chiết hiệu quả nhất để thu được hàm lượng chlorophyll cao từ vi tảo Nannochloropsis gaditana So với ethanol, methanol cho thấy ưu thế vượt trội trong việc đánh giá chlorophyll trong sinh khối vi tảo, trong khi acetone lại không hiệu quả cho mục đích này Trước đây, acetone được sử dụng phổ biến trong các phương pháp chiết tách, nhưng nghiên cứu của Pepe và cộng sự cùng với Dere và cộng sự đã khẳng định rằng methanol là dung môi tối ưu cho việc định lượng chlorophyll trong Nannochloropsis gaditana (Eustigmatophyceae).
Một phương pháp quang phổ hiệu quả để định lượng chlorophyll là sử dụng methanol theo Mackinney (1941), cho phép đánh giá nhanh chóng trong 20 phút mà không cần phá vỡ vách tế bào Tuy nhiên, năng suất chiết tách chlorophyll có thể được cải thiện bằng cách tăng thời gian chiết, áp dụng phương pháp Lichtenthaler (1983) thay vì Mackinney (1941), thực hiện siêu âm trong 15 phút, và sử dụng các phương pháp làm đông hoặc không làm đông với nitơ lỏng.
Nhiều phương pháp tách chiết chlorophyll đã được nghiên cứu, trong đó tác giả Karsten, U., Schumann, R., Haubner, N., và Klausch, S (2005) sử dụng acetone 90% để trích ly chlorophyll từ tảo Nhóm nghiên cứu này đã áp dụng hạt micro-bead trong quá trình đồng hóa, giúp tăng khả năng phá vách tế bào gấp 3 lần so với các phương pháp truyền thống Kết quả thu hồi chlorophyll đạt hiệu suất từ 39-85%.
Các phương pháp trích ly và xác định chlorophyll, ưu nhược điểm
2.6.1 Các phương pháp trích ly chlorophyll
Chiết xuất bằng phương pháp siêu âm sử dụng sóng âm thanh để tạo ra áp suất thay đổi trong chất lỏng, tạo ra bọt chân không chứa năng lượng Khi bọt này nổ, nó giải phóng lực mạnh, tạo ra áp suất cao và làm vỡ tế bào, từ đó tăng cường khả năng trao đổi chất Hiệu ứng này giúp chiết xuất lipid từ tảo dễ dàng hơn Ngoài ra, khi kết hợp với enzyme, siêu âm giúp enzyme thâm nhập vào tế bào hiệu quả hơn, mang lại kết quả tối ưu trong quá trình chiết xuất, với nước đóng vai trò như dung môi hỗ trợ enzyme phân hủy các thành tế bào.
Bộ chiết soxhlet, được phát minh vào năm 1879 bởi Franz Von Soxhlet, là một thiết bị phòng thí nghiệm dùng để chiết tách lipid từ vật liệu rắn Thiết bị này hoạt động bằng cách hòa tan các hợp chất mong muốn vào dung môi, trong khi không hòa tan các tạp chất Nếu các hợp chất mong muốn có độ hòa tan cao trong dung môi, chỉ cần thực hiện một quá trình lọc đơn giản để tách chúng khỏi các chất không hòa tan Nguyên liệu rắn chứa các hợp chất cần chiết sẽ được gói trong giấy lọc dày và đặt vào buồng chính của bộ chiết soxhlet.
Bộ Soxhlet hoạt động bằng cách đặt vào một bình chứa dung môi để chiết tách Sau khi lắp với bình ngưng, dung môi được làm nóng và bay hơi, hơi dung môi sẽ di chuyển lên ống dẫn hơi và vào bình trụ chiết Bình ngưng làm mát hơi dung môi, giúp nó ngưng tụ và rơi trở lại bình trụ chiết chứa mẫu Qua quá trình này, dung môi ấm từ từ hòa tan các hợp chất mong muốn Khi bình trụ chiết gần đầy, dung môi sẽ tự động chảy trở lại bình chứa dung môi qua ống xi-phông Chu trình này có thể lặp lại nhiều lần, cho phép các hợp chất không bay hơi hòa tan vào dung môi, từ đó tập trung các hợp chất mong muốn vào bình chưng cất sau nhiều chu kỳ.
Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn là quá trình mà bất kỳ dung môi nào sẽ ở trạng thái siêu tới hạn khi tồn tại ở nhiệt độ và áp suất vượt quá giá trị tới hạn Mỗi chất thông thường có thể tồn tại ở một trong ba trạng thái: rắn, lỏng và khí, tùy thuộc vào điều kiện áp suất và nhiệt độ Khi nén chất khí đến áp suất cao, chất khí sẽ hóa lỏng, nhưng khi đạt đến một áp suất nhất định và tăng nhiệt độ, chất lỏng sẽ không trở về trạng thái khí mà chuyển sang trạng thái siêu tới hạn Ở trạng thái này, chất khí có những đặc tính của cả chất lỏng và chất khí, tạo ra một dung môi trung gian Khi CO2 được đưa lên nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn (trên 31°C và 73,8 bar), nó sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn, mang lại khả năng hòa tan tốt các chất cần tách ra từ mẫu ở cả ba dạng Để thu hồi sản phẩm sau quá trình chiết xuất, chỉ cần giảm áp suất xuống thấp hơn áp suất tới hạn.
CO2 được chuyển đổi thành khí và thoát ra ngoài, trong khi sản phẩm được thu thập ở bình hứng Mỗi điều kiện về nhiệt độ và áp suất sẽ tương ứng với các đối tượng cần chiết tách khác nhau.
Trích ly chlorophyll bằng dung môi acetone là phương pháp phổ biến trong cả trắc quang và huỳnh quang Đối với trắc quang, cần ly tâm để loại bỏ độ đục, trong khi huỳnh quang có thể bỏ qua bước này do không nhạy với độ đục thông thường Nếu mẫu trắng có giá trị huỳnh quang cao hoặc không thể thiết lập giá trị bằng 0 với dung môi acetone trắng, điều này cho thấy acetone đã bị nhiễm bẩn, thường là do dầu từ quá trình sản xuất bình chứa kim loại.
Trích ly chlorophyll bằng dung môi methanol cho hiệu quả cao hơn acetone trong một số trường hợp, đặc biệt khi không yêu cầu độ chính xác cao và hàm lượng pheophitin thấp Đối với những trường hợp cần độ chính xác cao và có sự hiện diện đáng kể của pheophitin, dịch chiết methanol thường được làm khô và chuyển sang acetone 90% Phổ pheophitin a và b nhạy cảm với pH trong dung môi methanol nhưng không nhạy trong acetone 90%, dẫn đến khó khăn trong việc loại bỏ ảnh hưởng của pH trong quá trình tính toán Kết quả là các phép xác định trắc quang và đo huỳnh quang thường không theo quy tắc.
Trích ly chlorophyll bằng dung môi DMSO (dimethyl sulfoxide) là phương pháp hiệu quả cho việc chiết xuất tảo nâu, loại tảo khó chiết xuất bằng các dung môi khác DMSO cho phép chiết xuất gần như hoàn toàn, không để lại sắc tố trong bã thải, nhờ vào khả năng phá vỡ cấu trúc màng và các thể hạt bên trong của tảo Phương pháp này mang lại sản phẩm chất lượng cao với màu sắc và mùi tự nhiên, đồng thời giảm thiểu lượng dung môi dư thừa và tách được các hoạt chất có hàm lượng cao, không gây ô nhiễm môi trường Đây là một công nghệ cao, an toàn và thân thiện với các sản phẩm tự nhiên.
2.6.2 Các phương pháp xác định chlorophyll
Có 4 phương pháp xác định chlorophyll:
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng (HPLC)
Phương pháp huỳnh quang có độ nhạy cao hơn so với phương pháp trắc quang, vì vậy nó được ưu tiên sử dụng cho các mẫu có hàm lượng chlorophyll thấp.
HPLC là thiết bị phức tạp hơn nhưng vẫn dựa trên nguyên tắc của phương pháp huỳnh quang và trắc quang.
Phương pháp điện hóa để xác định chlorophyll a sử dụng cực phổ tuần hoàn trực tiếp qua điện cực màng carbon (SPCE), cho thấy mũi đơn thuận nghịch oxy hóa tại cực dương ở EV = +400 mV với điện cực so sánh là Ag/AgCl Nghiên cứu chỉ ra rằng chlorophyll a hấp thụ trên bề mặt màng SPCE, cho phép phát triển phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll a dựa trên sự trao đổi trung gian bằng cực phổ tích góp hòa tan (AdSV) Để tối ưu hóa phương pháp, cần khảo sát pH của dung dịch đệm tích góp, thời gian tích góp và lượng acetone trong đệm tích góp Phương pháp tối ưu này có thể xác định hàm lượng chlorophyll a trong dung dịch đệm phosphate với nồng độ khoảng 0,014 - 2,24μM.
Phương pháp đo trực tiếp cho phép xác định chlorophyll trong phiêu sinh vật mà không cần chiết hay xử lý hóa học Phương pháp này có thể thực hiện qua hai cách: đo trên dòng chảy liên tục để giám sát môi trường hoặc đo trên mẫu nước riêng lẻ tại hiện trường hoặc trong phòng thí nghiệm Thiết bị sử dụng cho phương pháp này bao gồm máy đo huỳnh quang hiện trường 10-AU và máy huỳnh quang cho phòng thí nghiệm DT-700.
Phương pháp ngâm chiết gián tiếp sử dụng các phép đo huỳnh quang trong dung môi từ tế bào bị phá vỡ để xác định lượng chlorophyll và sản phẩm phân hủy chính là pheophytin Thí nghiệm thường tập trung vào chlorophyll a và pheophytin a, giúp đánh giá chính xác sự hiện diện của các hợp chất này trong mẫu nghiên cứu.
Nguyên tắc xác định chlorophyll a dựa trên ba dạng chlorophyll a, b, c có thể ngâm chiết bằng acetone, mỗi loại có phổ hấp thu ánh sáng đặc trưng Phần ngâm chiết này được phân tích trên máy so màu, với chiều cao biểu thị nồng độ chlorophyll Phương pháp trắc quang để xác định chlorophyll a bao gồm các bước lọc, phá vỡ tế bào và ngâm chiết, sau đó đo độ hấp thụ So với phương pháp trắc quang, phương pháp huỳnh quang có độ nhạy cao hơn 1000 lần, với quy trình xử lý mẫu tương tự nhưng yêu cầu lượng mẫu ít hơn.
Tốc độ đo lường trong phương pháp trắc quang yêu cầu lấy mẫu ở nhiều bước sóng, trong khi phương pháp huỳnh quang chỉ cần đo ở một bước sóng duy nhất Đặc biệt, với máy huỳnh quang, kết quả đo không bị ảnh hưởng bởi việc chọn bước sóng.
Cuvet: phương pháp huỳnh quang không phụ thuộc quá nhiều vào vị trí cũng như sự tương thích của cuvet.
Trong quá trình chiết tách chlorophyll, việc tách định lượng chlorophyll ra khỏi tế bào là rất quan trọng Ba loại dung môi phổ biến được sử dụng trong các thí nghiệm là acetone 90%, methanol và DMSO Cần lưu ý rằng chlorophyll không ổn định với acid và ánh sáng, vì lượng vết acid có thể chuyển chlorophyll thành pheophitin Do đó, dụng cụ cần được trung hòa để tránh acid, và thí nghiệm nên được thực hiện dưới ánh sáng dịu để ngăn ngừa phân hủy chlorophyll Nghiên cứu cho thấy việc nghiền mẫu trước khi chiết có thể tăng lượng chlorophyll tách được từ 5 – 60%, tuy nhiên, một số thử nghiệm với dung môi DMSO không yêu cầu nghiền mẫu.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm thực hiện
Đề tài được thực hiện tại lầu 4 trung tâm công nghệ trường Đại học CôngNghệ Đồng Nai (DNTU) từ tháng 1 năm 2018 đến tháng 7 năm 2018.
Phương tiện nghiên cứu
Cây lúa non được trồng tại khu thực hành thí nghiệm của Trường Đại Học Công Nghệ Đồng Nai Tại phòng thí nghiệm, lá hư và tạp chất của cây lúa non được loại bỏ Sau đó, cây lúa non được cắt nhỏ và xay nhuyễn bằng máy xay khô chuyên dụng.
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Bảng 3.1 Dụng cụ thí nghiệm
Tên dụng cụ Xuất xứ Tên dụng cụ Xuất xứ
1 Cốc thủy tinh 100ml TQ 9 Pipet 10ml Germany
2 Ống đong 100ml TQ 10 Nhiệt kế Germany
3 Đũa thủy tinh TQ 11.Cuvet Germany
4 Chén sứ VN 12 Bóp cao su VN
100ml TQ 13 Erlen 250ml TQ
250ml TQ 14 Cốc thủy tinh 500ml TQ
7 Nồi, rổ, thau VN 15 Phễu lọc VN
Bảng 3.2 Thiết bị thí nghiệm
Tển thiểt bi Xuát xư Tển thiểt bi Xuát xư
1 Bểp điển VN 4 Bểp gás TQ
2 Máy xáy Philips HR2108, TQ 5 Máy siểu ám TQ
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Quy trình nghiên cứu thử nghiê ̣m
Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Xáy nhộ Cáy luá nộn
Lựa chọn hạt lúa được đồng nhất về nguồn gốc, chất lượng.
Trong công đoạn này các biến đổi không đáng kể.
Để phân loại hạt lúa, bạn cần ngâm chúng trong nước, từ đó sẽ dễ dàng nhận diện các hạt lép, hạt kém chất lượng và vỏ trấu Hãy loại bỏ những hạt không đạt tiêu chuẩn nổi trên mặt nước.
Nước đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích sự nảy mầm của hạt lúa Hạt lúa trưởng thành rất khô và cần hấp thu một lượng nước tương đương với trọng lượng khô của hạt để làm ẩm, từ đó phục hồi quá trình chuyển hóa và phát triển tế bào Trong giai đoạn ngâm, hạt lúa sẽ hút nước và trương nở, tạo điều kiện thuận lợi cho phôi hạt nảy mầm.
Khi nhiệt độ giảm, thời gian ngâm kéo dài có thể dẫn đến hiện tượng chua Do đó, cần thường xuyên kiểm tra, nếu thấy khô thì bổ sung nước Nếu ngửi thấy mùi chua, hãy thay nước ngay.
Ngâm hạt giống trong nước sạch trong 36 giờ ở nhiệt độ 30˚C, với lượng nước ngập hạt ít nhất 20cm, cần thay nước và rửa hạt mỗi 6-8 tiếng Hạt thóc đạt tiêu chuẩn phải no nước, mép hạt hơi sưng, vỏ trấu trong suốt và có thể nhìn thấy phôi hạt bên trong Khi hạt giống đủ tiêu chuẩn, hãy đãi thật sạch, để ráo nước và tiến hành ủ.
Ủ hạt là một quá trình quan trọng giúp kích thích sự nẩy mầm của hạt lúa mà không cần ánh sáng, đồng thời phá vỡ tính miên trạng của hạt giống Khi hạt giống được ngâm ủ trong điều kiện đủ nước và nhiệt độ, các phản ứng hóa học diễn ra, tạo ra hormone cần thiết để thúc đẩy sự phát triển của chồi và rễ mầm.
Biến đổi ủ lâu khiến mầm lúa dài, yếu và dễ gãy, ảnh hưởng đến chất lượng cây lúa non Nếu hạt lúa bị nhớt trong quá trình ủ mà không được rửa kịp thời, chúng sẽ không nảy mầm và có nguy cơ thối hoặc khô Để khắc phục, cần phun nước và đảo trộn hạt giống để đảm bảo độ ẩm cần thiết cho sự phát triển.
Khi hạt thóc đã hút đủ nước và được đãi sạch, cần để ráo nước trước khi ủ trong vải mỏng trong 36 giờ Trong quá trình ủ, mỗi 6-8 giờ nên đảo trộn hạt, phun nước và kiểm tra độ nhớt của hạt lúa Khi mầm phát triển khỏe mạnh và đạt chiều dài bằng hạt lúa, cùng với rễ dài khoảng 1/3 chiều dài hạt, có thể tiến hành trồng.
Tạo ra nguồn nguyên liệu chính cho quá trình nghiên cứu, sản xuất.
Trong công đoạn này các biến đổi không đáng kể.
Hạt lúa đạt tiêu chuẩn về chiều dài mầm và rễ sẽ được gieo trồng trên đất sạch Quá trình chăm sóc bao gồm tưới nước thường xuyên và bảo vệ cây khỏi các tác nhân sinh học, vật lý có thể ảnh hưởng đến chất lượng lúa non Sau một thời gian chăm sóc, cây lúa sẽ được thu hoạch.
Xay nhỏ cây lúa non giúp phá vỡ cấu trúc tế bào, từ đó tăng cường khả năng tương tác với dung môi chiết và rút ngắn thời gian trích ly.
Trong công đoạn này các biến đổi không đáng kể
Sau khi trồng, cây lúa non đạt đủ điều kiện thu hoạch cần được loại bỏ tạp chất và lá úa Tiếp theo, lúa được rửa sạch và để ráo nước Cuối cùng, lúa được cho vào máy xay khô chuyên dụng và xay nhuyễn đến khi đạt yêu cầu.
3.3.2.6 Bổ sung dung môi và sử dụng siêu âm để trích ly
Xúc tác giúp phá vỡ tế bào nguyên liệu của cây lúa, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trao đổi chất diễn ra dễ dàng hơn và nâng cao khả năng thu nhận chlorophyll.
Trong công đoạn này các biến đổi không đáng kể
Để tiến hành trích ly chlorophyll, cho dung môi ethanol 80% vào bình Erlen chứa lúa non đã xay nhuyễn với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/15, sau đó đậy nắp và sử dụng sóng siêu âm.
Duy trì thời gian xúc tác phản ứng và trao đổi chất Trích ly triệt để nguồn chlorophyll trong các phân tử lúa
Thất thoát lượng chlorophyll do ảnh hưởng từ ánh sáng
Thời gian trích ly kéo dài chuyển hóa chlorophyll thành pheophytin
Lượng dung môi bị bốc hơi gây mất cân bằng
Mẫu dung dịch chiết sau khi qua sóng siêu âm được lưu giữ và bảo quản trong tủ tối khoảng 24 giờ.
3.3.2.8 Lọc thu hồi dung dịch Chlorophyll
Loại bỏ phần bã thu hồi dung dịch chlorophyll sau khi trích ly
Trong công đoạn này các biến đổi không đáng kể
Sử dụng giấy lọc chuyên dụng trong phòng thí nghiệm giúp lọc và loại bỏ bã cây lúa non, đồng thời thu hồi dung dịch chlorophyll để sử dụng hiệu quả.
Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian ngâm hạt lúa.
Mục đích: Tìm ra thời gian ngâm cho hạt nảy mầm nhiều nhất.
Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian ngâm.
Bảng 3.3 Yếu tố khảo sát, yếu tố cố định cho thời gian ngâm
Yếu tố khảo sát (giờ) Yếu tố cố định
Nhiệt độ ngâm(30 0 C) Thời gian ủ (36 giờ)
Chuẩn bị 100 hạt lúa đã được đãi sạch hạt lép, cho vào cốc nhựa và ngâm trong nước ở nhiệt độ phòng Thời gian ngâm có thể là 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ hoặc 42 giờ, với thể tích nước gấp đôi chiều cao của hạt lúa.
Xác định hạt nảy mầm
Sau 36 giờ ngâm, hạt lúa được ủ thêm 36 giờ để đếm số lượng hạt nảy mầm Tiêu chuẩn để xác định hạt nảy mầm là chiều dài mầm đạt 1/2 chiều dài hạt lúa Dựa vào kết quả này, thời gian ngâm hạt lúa sẽ được chọn lựa phù hợp.
Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ ngâm hạt lúa.
Mục đích: Tìm ra được nhiệt độ cho hạt nảy mầm nhiều nhất.
Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ ngâm.
Bảng 3.4 Yếu tố khảo sát, yếu tố cố định cho nhiệt độ ngâm
Yếu tố khảo sát ( 0 C) Yếu tố cố định
Thời gian ngâm (36 giờ) Thời gian ủ (36 giờ)
Xác định hạt nảy mầm
