TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Hoàn ngọc (Pseuderanthemum bracteatum Imlay)
Vị trí phân loại của chi Pseuderanthemum theo hệ thống phân loại của Takhtajan
Phân Ngành Ngọc lan: Magnoliophytina
Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida Phân lớp Bạc hà: Lamiidae
Bộ Hoa mõm sói: Lamiales
Họ Ô rô (Acantheceae) thuộc chi Pseuderanthemum, với khoảng 60 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, trong đó có 20 loài ở châu Á Tại Việt Nam, chi Pseuderanthemum có khoảng 9 loài và 2 thứ Đặc biệt, loài Hoàn ngọc (Pseuderanthemum bracteatum Imlay) còn được biết đến với các tên gọi dân gian như cây con khỉ đỏ và cây hoàn ngọc đỏ.
1.1.2 Đặc điểm thực vật Hoàn ngọc :
Cây thảo cao từ 50-60 cm, ít phân nhánh với thân màu vàng đỏ và có 4 cạnh, lúc non có lông mịn Lá bầu dục kích thước 5-9 cm x 3-5 cm, có lông mịn ở cả hai mặt và cuống lá dài 2-3 cm, với 5-6 cặp gân phụ Cụm hoa mọc ở đầu cành, dài 8-10 cm, lá bắc dạng lá kích thước 2 x 0,7 cm có lông mịn; lá bắc con 2, hình đường, dài khoảng 3 mm Đài hoa có 5 thùy xẻ sâu, thùy dài hình đường khoảng 7 mm, cũng có lông mịn Tràng hoa màu trắng, ống tràng dài khoảng 1,5 cm, miệng chia thành 5 thùy hình bầu dục gần bằng nhau, cao 6-7 mm và có đốm tím Nhị hữu thụ nhị 2, bầu và vòi nhụy có lông Quả nang hình chựy, dài 2 cm, có lông mịn và lộp ở phía dưới gốc.
1.1.3 Sinh học và sinh thái:
Cây mọc bụi, hơi ưa bóng và ưa ẩm, phát triển nhanh vào mùa mưa Cây ra hoa và quả vào tháng 3-5 Thường mọc ven rừng, ven đường
Phân bố: Chủ yếu Phú Yên, Bà Rịa-Vũng Tàu (Núi Ninh), còn ở Thái Lan.[4]
1.1.4 Bộ phận dùng: phần trên mặt đất gồm cả cành và lá.
Một số nghiên cứu về tác dụng sinh học và thành phần hóa học của cây thuộc chi Pseuderanthemum có mặt tại Việt Nam
chi Pseuderanthemum có mặt tại Việt Nam
Cây thuộc chi Pseuderanthemum tại Việt Nam chứa các thành phần hóa học chính như Lignan, Sterol, Flavonoid, Triterpen cùng một số hợp chất khác, được tổng hợp và trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 1.1: Thành phần hóa học trong chi Pseuderanthemum
STT Tên hợp chất Công thức hóa học
Tài liệu tham khảo Lignan
Qua các công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Pseuderanthemum, một số tác dụng sinh học của chi đã được chứng minh
Nghiên cứu trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264,7 cho thấy dịch chiết ethanol từ lá cây Hoàn ngọc trắng (Pseuderanthemum palatiferum) có khả năng ức chế protein điều hòa phiên mã NF-kB, C/EBP và AP-1, từ đó làm giảm sự giải phóng các chất trung gian của phản ứng viêm như IL-6 và TNF-α.
Dịch chiết ethanol từ lá cây Hoàn ngọc trắng có khả năng kháng viêm hiệu quả bằng cách giảm nồng độ nitric oxide, một chất trung gian quan trọng trong phản ứng viêm Cụ thể, tại nồng độ 50 µg/ml, dịch chiết này có tác dụng giảm nồng độ nitric oxide tương đương với việc sử dụng Vitamin C 500 µM.
Tác giả Võ Hoài Bắc và cộng sự đã phân lập polysaccharid trung tính từ lá cây Xuân hoa đỏ (Pseuderanthemum carruthersii) với tác dụng kháng viêm hiệu quả, thông qua việc ức chế phosphoryl hóa ERK và p38 trong quá trình truyền tín hiệu MAPK Điều này dẫn đến sự giảm nồng độ các chất gây viêm như TNF-α, IL-1β, IL-6 Hơn nữa, polysaccharid này còn làm giảm mức độ phản ứng oxy hóa nội bào, với nồng độ 10 µg/ml giảm 50% và 40 µg/ml giảm 80% so với nhóm tế bào bị viêm không điều trị Sự giảm này có ý nghĩa quan trọng vì tăng mức độ phản ứng oxy hóa là một nguyên nhân chính gây ra tình trạng viêm.
1.2.2.2 Tác dụng chống oxy hóa:
Hoàn ngọc trắng (Pseuderanthemum palatiferum) có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ, được xác định qua khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH Nghiên cứu của Patcharawan Sittisart và Benjamart Chitsomboon cho thấy dịch chiết ethanol toàn phần và dịch chiết phân đoạn nước từ lá cây này có khả năng dọn gốc tự do với nồng độ IC50 lần lượt là 23,45 ± 0,12 àg/ml và 21,55 ± 0,06 àg/ml Đặc biệt, nồng độ cao nhất 32,5 àg/ml của dịch chiết ethanol và phân đoạn nước có khả năng dọn gốc tự do lên đến 56,96 ± 0,21% và 73,19 ± 0,09%.
Nghiên cứu của Nguyễn Quang Vinh và Jong-Bang Eun đã chỉ ra rằng các dịch chiết từ cây Hoàn ngọc trắng trong MeOH, EtOH và Aceton đều có khả năng kháng khuẩn Đặc biệt, dịch chiết MeOH cho thấy hiệu quả kháng khuẩn tốt nhất, với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn Bacillus subtilis là 625 µg/ml.
Staphylococcus aureus (625 àg/ml), Lactobacillus brevis (625 àg/ml), Escherichia coli
Nghiên cứu của Đoàn Thị Mai Hương và cộng sự đã chỉ ra rằng các hoạt chất như Palatiferin 1, Palatiferin 2, lupenone và betulin được chiết xuất từ lá cây Hoàn ngọc trắng có tác dụng kháng khuẩn hiệu quả đối với nhiều loại vi khuẩn và nấm, bao gồm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis và nấm Candida albicans, với nồng độ 1250 àg/ml và 2500 àg/ml tương ứng.
1.2.2.4 Tác dụng hạ đường huyết:
Nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết ethanol lá cây Hoàn ngọc trắng cho thấy rằng dịch chiết này không ảnh hưởng đến nồng độ glucose lúc đói, insulin và các thông số sinh hóa ở chuột bình thường Ngược lại, ở chuột bị tiểu đường, dịch chiết ethanol đã giảm đáng kể nồng độ glucose lúc đói và các chỉ số sinh hóa như LDL, TC, TG, BUN, ALP, đồng thời làm tăng nồng độ insulin và HDL trong máu Đặc biệt, nồng độ 250 mg/kg của dịch chiết ethanol thể hiện tác dụng hạ đường huyết tốt nhất, cho thấy tác dụng này không tuyến tính với việc tăng nồng độ dịch chiết Nồng độ insulin trong máu của chuột bệnh sau khi sử dụng dịch chiết 250 mg/kg cao hơn so với chuột dùng thuốc đối chứng glybenclamid 0,25 mg/kg từ 150-200 IU/ml.
1.2.2.5 Tác dụng hạ huyết áp:
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết nước lá cây Hoàn ngọc trắng (Pseuderanthemum palatiferum) có tác dụng hạ huyết áp và giảm nhịp tim ở chuột, cả ở nhóm bình thường và nhóm tăng huyết áp do L-N-nitro arginine methyl ester, với hiệu quả kéo dài đến 20 phút tại nồng độ 25 mg/kg Thí nghiệm trên động mạch chủ cô lập cho thấy dịch chiết này có tác dụng giãn mạch với EC50 = 81,0 µg/mL, không bị ảnh hưởng bởi L-N-nitro-arginine methyl ester và atropin, nhưng hiệu quả giảm khi lớp nội mạc bị loại bỏ và không có tác dụng với co thắt do nồng độ kali cao Ngoài ra, trong thí nghiệm trên tâm nhĩ chuột cô lập, dịch chiết ở nồng độ 2,5 - 7,5 mg/mL làm giảm lực co bóp và nhịp tim mà không bị ảnh hưởng bởi atropin.
1.2.2.6 Tác dụng gây độc tế bào:
Dịch chiết lá Hoàn ngọc trắng (Pseuderanthemum palatiferum) có tác dụng gây độc đối với tế bào ung thư MDA-MB-231 Nghiên cứu cho thấy cả chiết xuất khô và tươi từ lá cây này đều sử dụng dung môi nước để chiết xuất, mang lại hiệu quả trong việc tiêu diệt tế bào ung thư Việc tìm hiểu về khả năng chống ung thư của Hoàn ngọc trắng mở ra tiềm năng cho các phương pháp điều trị mới trong y học.
Nghiên cứu đã tiến hành chiết xuất ethanol từ các mẫu dịch chiết lá tươi và khô bằng nước và cồn, bao gồm lá tươi chiết nước (FWE), lá khô chiết nước (DWE), lá tươi chiết cồn (FEE) và lá khô chiết cồn (DEE) Kết quả cho thấy FEE có tác dụng tốt nhất với các liều IC10, IC20, IC50 lần lượt là 199 ± 7,21 (μg/ml), 216 ± 6,84 (μg/ml) và 260 ± 7,04 (μg/ml) sau 24 giờ Mặc dù liều IC50 khá cao, khó áp dụng trong điều trị lâm sàng, nhưng nghiên cứu này mở ra khả năng kết hợp dịch chiết FEE với thuốc điều trị ung thư.
Dịch chiết ethanol từ lá cấy Hoàn ngọc trắng cho thấy khả năng gây độc mạnh đối với các dòng tế bào ung thư ruột kết HTC15, SW48 và SW480, với nồng độ IC50 lần lượt là 508,98 ± 26,87 μg/ml; 500,39 ± 28,47 μg/ml; và 511,74 ± 31,21 μg/ml.
1.3 Một số nghiên cứu về cây Hoàn ngọc (Pseuderanthemum bracteatum Imlay):
Trong y học cổ truyền, cây Hoàn ngọc đã được sử dụng phổ biến, tuy nhiên, nghiên cứu về cây này vẫn còn hạn chế Năm 2008, tác giả Nguyễn Hữu Thọ đã công bố một số thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Hoàn ngọc.
Phần trên mặt đất của cây Hoàn ngọc chứa nhiều thành phần hóa học quan trọng như Flavonoid, Saponin, đường khử, acid hữu cơ, Sterol và tanin Cụ thể, hàm lượng Flavonoid toàn phần trong dịch chiết EtOAc đạt 0,64 ± 0,05 %, trong khi hàm lượng Saponin toàn phần trong dịch chiết n-Butanol là 0,74 ± 0,04 %.
Hoàn ngọc có tác dụng giảm thời gian đông máu ngoại sinh và giảm chảy máu ở chuột, cả khi sử dụng đường uống và tại chỗ Cụ thể, thời gian đông máu của nhóm chuột được điều trị với dịch chiết nước nồng độ 20 mg/ml là 16,07 ± 0,42 giây và nồng độ 50 mg/ml là 17,07 ± 0,51 giây, thấp hơn đáng kể so với nhóm chứng (17,8 ± 0,46 giây) Trong thí nghiệm chảy máu, chuột uống dịch chiết có thời gian chảy máu trung bình là 73,1 ± 7,7 giây, giảm 42,24% so với nhóm không sử dụng (126,9 ± 18,6 giây) Khi sử dụng tại chỗ với nồng độ 0,2% và 0,5%, thời gian chảy máu lần lượt là 50,6 ± 5,5 giây và 52,8 ± 4,2 giây, đều thấp hơn so với nhóm chứng sử dụng nước cất (88,7 ± 10,0 giây).
Hoàn ngọc dưới dạng dịch sắc dược liệu (1:1); dịch chiết cồn (1:1), (5:1); dịch chiết Ethyl acetat (5:1) đều có tác dụng kháng khuẩn với kết quả vòng vô khuẩn tương đương
11 với kháng sinh chuẩn Benzathin peniclin G Dịch chiết Ethyl acetat (5:1) có tác dụng trên nhiều chủng vi sinh vật kiểm định nhất là các chủng: Bacillus subtilis, Bacillus pumilus,
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Cây Hoàn ngọc được thu hái tại xã Phương Định, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định, Việt Nam vào tháng 9 năm 2019 Sau khi thu hái, dược liệu được rửa sạch, sấy khô và bảo quản trong túi nilong kín ở nơi khô ráo.
Nguyên liệu
Phân tích TLC được thực hiện với bản mỏng silica gel 60 GF 254, sử dụng bức xạ UV ở các bước sóng 254 và 365 nm để phát hiện vết Ngoài ra, phương pháp này còn áp dụng phun tẩm với dung dịch Vanilin 1% kết hợp H2SO4 để tăng cường khả năng phát hiện.
10 % (1:1) sau đó làm nóng bằng súng nhiệt
Việc tinh chế bằng sắc ký cột được thực hiện bằng hạt silica gel 60 Mesh, cỡ hạt 0,063 – 0,2 mm, Sephadex LH-20 kớch cỡ hạt 25-100 àm
Các hóa chất được sử dụng bao gồm các dung môi hữu cơ: n-hexan, CH2Cl2, Aceton, MeOH, EtOAc, cồn và nước
Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng
STT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
5 Ethyl acetat Trung Quốc DĐVN V
Thuốc thử phản ứng định tính
• HCl 10%, đậm đặc H2SO4 đậm đặc
• Thuốc thử định tính alkaloid
• Dung dịch gelatin 1% chứa muối NaCl 10%
• Cột sắc kí với đường kính 2,5 cm; 2 cm; 1,5 cm
• Dụng cụ thủy tinh: Cốc có mỏ, pipet, phễu, ống nghiệm, ống đong, bình cầu 1 l, 500 ml, 100 ml, 50 ml, 25 ml, bình nón
• Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thụy Sĩ)
• Máy cất quay và một số thiết bị khác.
Nội dung nghiên cứu
• Chiết xuất dịch chiết toàn phần và dịch chiết phân đoạn lá cây Hoàn ngọc
• Định tính một số nhóm chất trong dịch chiết cồn
• Phân lập một số thành phần từ dịch chiết phân đoạn lá cây Hoàn ngọc
• Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp ngâm lạnh 3 lần với dung môi là EtOH 80%, cất thu hồi dung môi lấy cắn chiết
Sau khi phân tán, cắn được chiết vào nước và tiếp tục chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan, CH2Cl2 và EtOAc Các phân đoạn dịch chiết thu được sẽ được cô lại để lấy cắn.
2.4.2 Định tính một số thành phần hóa học trong dịch chiết ethanol:
Lấy 5 ml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm bốc hơi đến cắn Hòa tan cắn vào 4 ml acid hydrochloric 5% Dung dịch acid vào 3 ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid bằng thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff
- Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans:
Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết cồn lên một miếng giấy lọc, bay hơi cồn cho tới khô, nhỏ lên vết dịch 1-2 giọt dung dịch KOH 10% trong cồn và sấy nhẹ cho tới khô Che một nửa vết dịch chiết bằng một miếng kim loại và soi dưới đèn tử ngoại 365 nm Sau vài phút, lấy miếng kim loại ra quan sát
- Phản ứng mở đóng vòng lacton:
Dịch chiết cồn được chia vào hai ống nghiệm, mỗi ống 1ml Ống thứ nhất được thêm 1ml NaOH 10% và cả hai ống được đun cách thủy Sau khi đun, thêm 5ml nước cất vào mỗi ống để pha loãng, sau đó cho thêm 1ml HCl vào cả hai ống nghiệm Cuối cùng, quan sát các hiện tượng xảy ra.
Để định tính vòng lacton 5 cạnh, đầu tiên lấy 5 ml dịch chiết cồn và cho vào chén sứ để bốc hơi đến cắn Sau đó, hòa tan cắn vào 2 ml cồn và gạn cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ Tiếp theo, thêm 2-3 giọt dung dịch m-dinitrobezen 1% trong cồn 96 độ, rồi cho thêm 3 giọt KOH 5%.
Để định tính đường 2-desoxy, đầu tiên lấy 5 ml dịch cồn cho vào chén sứ và bốc hơi đến cắn Sau đó, hòa tan cắn với 5 ml thuốc thử xanthydrol và khuấy cho tan hoàn toàn Cuối cùng, đậy ống nghiệm bằng nút bông và đun cách thủy trong 5 phút.
Lấy 15 ml dịch chiết cồn chia làm 3 ống nghiệm và thực hiện các phản ứng sau:
Phản ứng Cyanidin.: thêm vào dịch chiết một ít bột kim loại magnesi và 0,5 ml HCl đậm đặc Đun trên bếp cách thủy trong vài phút
Phản ứng với thuốc thử NaOH 10%: thêm vào dịch chiết vài giọt NaOH 10%
Phản ứng với thuốc thử FeCl 3 5%: thêm vài giọt FeCl3 5% vào dịch chiết
Lấy dịch chiết cồn vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1 ml và thực hiện các phản ứng:
Phản ứng với thuốc thử FeCl 3 5%: thêm vài giọt FeCl3 5% vào dịch chiết
Phản ứng với dung dịch gelatin muối: thêm vào dịch chiết 5 giọt dung dịch gelatin 1
% với NaCl 10 %, lắc đều, so sánh với dung dịch chứa dịch chiết ban đầu
Lấy 5 ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ cô trên bếp cách thủy đến cắn, hòa tan cắn vào 5 ml nước, lọc vào trong một ống nghiệm to và lắc mạnh theo chiều dọc trong 5 phút Quan sát hiện tượng
2.4.2.4 Định tính các đường khử
Lấy 2 ml dịch cồn cho vào chén sứ cô đến cắn hòa tan vào 2 ml nước, lọc vào trong ống nghiệm Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 ml dung dịch Fehling
2.4.2.5 Định tính các acid hữu cơ
Lấy 2 ml dịch chiết cồn cho vào một ống nghiệm Pha loãng với 1 ml nước và thêm vào dung dịch một ít tinh thể Na2CO3 Quan sát hiện tượng
Lấy 5 ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn Hòa tan cắn vào 0,5 ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml CHCl3 Thêm 1 ml H2SO4 đặc dọc theo thành ống nghiệm Quan sát hiện tượng
2.4.3 Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của hợp chất hóa học:
• Sử dụng phương pháp sắc kí cột với chất hấp phụ là silica gel và sephadex LH-20 để phân lập các hợp chất:
Phân lập hợp chất HN-1
Cắn n-hexan và CH2Cl2 được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột với silica gel pha thuận làm chất hấp phụ Để thực hiện, n-hexan và CH2Cl2 được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu và hấp phụ trên silica gel Sau đó, dung môi được bốc hơi để thu được bột khô tơi Cột sắc ký có đường kính 2,5 cm cần được làm sạch, khô và cố định thẳng đứng trên giá, với một lớp bông lót dưới đáy cột Lượng silica gel sử dụng để nạp cột phải gấp 50-60 lần so với lượng mẫu.
Rửa giải bằng hệ dung môi n-Hexan và EtOAc với tỷ lệ 10:1 đã thu được hai phân đoạn HN1.1 và HN1.2 Khi thay đổi tỷ lệ dung môi thành n-Hexan: EtOAc ở tỷ lệ 8:1, hai phân đoạn tiếp theo HN1.3 và HN1.4 được thu nhận.
Trong quá trình nghiên cứu, phân đoạn HN 1.4 đã xuất hiện chất kết tủa trong dung môi MeOH Để thu hồi, tủa được lọc rửa bằng MeOH trên giấy lọc, kết quả thu được hợp chất HN-1 với khối lượng 10 mg.
Quy trình phân lập hợp chất từ cắn chiết n-Hexan và CH2Cl2 được mô tả trong sơ đồ 2.1:
Thay đổi hệ dung môi n-hexan: EtOAc 8:1
Cắn n-Hexan và CH 2 Cl 2 9 g
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ phân lập hợp chất HN-1
Phân lập hợp chất HN-2:
Cắn EtOAc được phân lập thông qua phương pháp sắc ký cột sử dụng silica gel pha thuận làm chất hấp phụ Đầu tiên, cắn EtOAc được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu và hấp phụ lên silica gel Sau đó, dung môi được bốc hơi để thu được bột khô Cột sắc ký có đường kính 2,5 cm được làm sạch và cố định thẳng đứng, với một lớp bông lót ở đáy cột Lượng silica gel sử dụng để nạp cột gấp 50-60 lần so với lượng mẫu.
Rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2: MeOH: H2O theo tỷ lệ (10:1:0,1) cho ra hai phân đoạn HN2.1 và HN2.2 Khi thay đổi tỷ lệ dung môi thành CH2Cl2: MeOH: H2O với tỷ lệ (5:1:0,1), thu được ba phân đoạn tiếp theo là HN2.3, HN2.4 và HN2.5.
Phân đoạn HN2.4 được phân lập tiếp bằng cột sắc ký với chất hấp phụ Sephadex HL-
20, dung môi rửa giải EtOH: H2O tỷ lệ (1:1) thu được hợp chất HN-2 (8 mg)
Quá trình phân lập hợp chất HN-2 được biểu điễn trong sơ đồ 2.2:
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập HN-2
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Chiết xuất dịch chiết ethanol toàn phần và các dịch chiết phân đoạn
Lá cây Hoàn ngọc sau khi thu hái được rửa sạch, sấy khô và cắt nhỏ thành các đoạn 3-4 cm Để chiết xuất, lấy 0,6 kg dược liệu chiết với ethanol 80% bằng phương pháp chiết ngâm lạnh, thực hiện 3 lần, mỗi lần sử dụng 5 L ethanol 80% trong 24 giờ Sau đó, lọc dịch chiết qua bông và cô dịch chiết dưới áp suất giảm ở 50 o C cho đến khi thu được 15 g cắn chiết ethanol toàn phần.
Phân tán cắn được chiết xuất bằng cách hòa tan trong một lượng nước tối thiểu và sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm n-Hexan, CH2Cl2 và EtOAc Mỗi dung môi được chiết nhiều lần cho đến khi thu được lớp dung môi không màu Sau đó, các dịch chiết được gộp lại và tiến hành cất để thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, kết quả thu được là 6 g cắn chiết từ n-Hexan, 3 g từ CH2Cl2, 2 g từ EtOAc và một lớp nước.
Quy trình chiết Hoàn ngọc được trình bày cụ thể trong sơ đồ 3.1:
Dịch chiết ethanol toàn phần
- Lọc, cô dưới áp suất giảm
- Phân tán trong 500 ml nước
- Chiết phân bố với n-hexan
- Chiết phân bố CH 2 Cl 2
- Chiết phân bố ethyl acetat Thu hồi dung môi
Lớp nước Cắn chiết CH 2 Cl 2 3 g
Thu hồi dung môi Cắn chiết n-hexan 6g
- Ngâm với ethanol 80 o , 5 L/ lần * 3 lần
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất lá Hoàn ngọc
Kết quả định tính thành phần hóa học trong dịch chiết ethanol
Thực hiện các phản ứng định tính theo 2.4.2 thu được kết quả tại bảng 3.1 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong dịch chiết cồn Hoàn ngọc
TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Hiện tượng
Phản ứng với các thuốc thử:
-TT Mayer -TT Dragendorff -TT Bouchardat
- không có tủa không có tủa không có tủa
++ dung dịch chuyển màu đỏ dung dịch vàng chanh dung dịch màu xanh đen
Phản ứng mở đóng vòng lacton
Phản ứng chuyển dạng cis- trans
- hai nửa không có sự khác biệt
4 Saponin Phản ứng tạo bọt + bọt tạo thành ổn định
+ dung dịch màu xanh đen xuất hiện kết tủa bông màu trắng
Phản ứng Raymond- Marthoud Phản ứng với TT Xanthydrol
- không thấy màu xanh tím kông thấy màu hồng
7 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 + Có bọt khí nổi lên
8 Đường khử Phản ứng TT Fehling A và
Fehling B + Có kết tủa màu đỏ gạch
Burchard + có màu tím hồng tại mặt phân các, lớp CHCl3 chuyển màu xanh lục
Chú thích: (-) kết quả âm tính
Cây Hoàn ngọc chứa nhiều thành phần hóa học quan trọng như flavonoid, saponin, sterol, tanin, đường khử và acid hữu cơ, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về thành phần trong cây này cũng như trong chi Pseuderanthemum Tuy nhiên, các thành phần khác như carotenoid, chất béo và anthranoid vẫn chưa được khảo sát.
Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất
Từ cắn n-hexan và CH2Cl2 (9 g) phân lập hợp chất HN-1 (10 mg) Từ phân đoạn EtOAc (2 g) phân lập được hợp chất HN-2 (8 mg)
Hợp chất HN-1 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng
Phổ 1 H-NMR dễ dàng nhận thấy sự có mặt ba nhóm olefin proton δ H 5,33 (1H, br.s, H-6), 5,1 (1H, m, H-22) và 5,2 (1H, m, H-23) Một proton cacbinol cũng được ghi nhận tại δ H 3.41 (1H, m, H-3) (Xem bảng 3.2 và phụ lục 1)
Phổ 13 C-NMR ghi nhận sự có mặt của 29 tín hiệu cacbon kết hợp với các tín hiệu của nhóm methyl vùng trường cao trên phổ 1 H-NMR gợi ý hợp chất HN-1 là một Steroid Các tín hiệu cộng hưởng của 6 nhóm methyl đã được xác định tại δ C 11,69 (C-
18), 18,46 (C-19), 19.2 (C-21), 18.91 (C-26), 20,91 (C-27), 11,54 (C-29) và một nhóm oxymethin tại δ C 70,84 Bên cạnh đó, tín hiệu cộng hưởng của hai liên kết đôi ở vị trí
C5=C6 ( δ C 141,5 và 120,7) và vị trí C22=C23 (δ C 138,5 và 129,2) Kết hợp các dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và so sánh với dữ liệu trong tài liệu [13] kết luận hợp chất HN-
1 là Stigmasterol (xem phụ lục 2)
Bảng 3.2: Số liệu phổ 1 H và 13 C-NMR của hợp chất HN-1 đo trong dung môi
Vị trí δ H a (ppm) (độ bội, J (Hz)) δ C b (ppm) Tài liệu tham khảo [13]
Hình 3.1: Cấu trúc hợp chất HN-1
Hợp chất HN-2 thu được dưới dạng vô định hình
Phổ 1 H-NMR cho thấy sự có mặt của một vòng benzen bị thế một vị trí thông qua sự xuất hiện của 5 tín hiệu proton thơm tại δ H 7,42 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-2, H-6), 7,33 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-3, H-5) và 7,27 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-4) Ngoài ra, trên phổ 1 H- NMR còn thấy các tín hiệu cộng hưởng của một nhóm methylen tại δ H 4,66 (1H, d, J 12,0 Hz, H-7a), 4,92 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-7b) và một cấu tử đường glucose với các tín hiệu đặc trưng của proton anomeric tại δ H 4,34 (1H, d, J = 7,7 Hz), hai proton nhóm methylen tại 3,69 (1H, dd, J = 6; 12,0 Hz, H-6’a), 3,88 (1H, dd, J = 2,5; 12,0 Hz, H-6’b) và của các nhóm oxymethin nằm trong khoảng 3,24-3,35 ppm Từ kết quả phân tích hằng số tương tác của anomeric proton J=7,7 Hz xác định được cấu hình đường là β-D- glucopyranosid (xem bảng 3.3, phụ lục 3)
Dữ liệu phổ 13 C-NMR cho thấy sự hiện diện của 6 cacbon trong vòng thơm, với các tín hiệu tại δ C 129,17 (C-2, C-6), 129,25 (C-3, C-5), 128,66 (C-4), và 139,05 (C-1) Ngoài ra, có một cacbon nhóm oxymetylen tại δ C 71,7 (C-7) cùng với các tín hiệu của cấu tử đường β-D-glucopyranosid xuất hiện tại các vị trí δ C 103,28 (C-1′), 75,12 (C-2′), 78,08 (C-3′), 71,69 (C-4′), 77,98 (C-5′), và 62,8 (C-6′) (xem bảng 3.3, phụ lục 4).
Trên phổ HMBC, có sự tương tác giữa proton anomeric H-1′ (δ H 4,34 ppm) với cacbon C-7 (δ C 71,7 ppm) và các proton H-7a (δ H 4,66 ppm), H-7b (δ H 4,92 ppm) của nhóm methylen với C-1’ (δ C 103,28) của đường, cho thấy β-D-glucopyranosid được gắn vào nhóm methylen thông qua cầu ether Dựa trên các dữ liệu phổ và tài liệu tham khảo [6], hợp chất HN-2 có công thức phân tử C13H18O6 (M = 270) và được xác định là Benzyl O-β-D-glucopyranosid.
Bảng 3.3: Số liệu phổ 1 H và 13 C -NMR của hợp chất HN-2 trong dung môi MeOD
Vị trí δ H a (ppm), (độ bội, J(Hz)) δ C b , ppm Tài liệu tham khảo [6]
Hình 3.2: Cấu trúc hóa học của HN-2
BÀN LUẬN
Cây Hoàn ngọc chứa các thành phần quan trọng như flavonoid, saponin, sterol, tanin, đường khử và acid hữu cơ, phù hợp với các nghiên cứu trước đây Đặc biệt, hàm lượng flavonoid trong cây rất cao, cho thấy các tác dụng sinh học đáng kể như chống oxy hóa, chống viêm và bảo vệ tế bào gan Sự hiện diện của flavonoid có thể giải thích một phần hoạt tính của dịch chiết lá cây Hoàn ngọc Tuy nhiên, để xác định rõ ràng các tác dụng sinh học cụ thể, cần tiến hành các nghiên cứu phân lập và thử nghiệm các thành phần hóa học này.
Nghiên cứu này đã sử dụng phương pháp sắc ký cột với silica gel pha thuận và Sephadex HL-20 kết hợp với sắc ký lớp mỏng để phân lập hai hợp chất HN-1 và HN-2 Qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân, HN-1 được xác định là Stigmasterol, một sterol thực vật đã được phân lập từ Hoàn ngọc trắng, trong khi HN-2 là Benzyl O-β-D-glucopyranosid Stigmasterol đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và chức năng của màng tế bào, đồng thời có nhiều tác dụng sinh học như chống thoái hóa xương khớp, hạ huyết áp, chống khối u, hạ đường huyết, và kháng viêm Những tác dụng này cho thấy Stigmasterol có tiềm năng ứng dụng cao và cần được nghiên cứu sâu hơn Benzyl O-β-D-glucopyranosid cũng được xác định theo danh pháp IUPAC, mở ra hướng nghiên cứu mới cho các hợp chất này.
Hợp chất 5R, 6R)-2-(hydroxymethyl)-6-phenylmethoxyoxane-3,4,5-triol, được biết đến với tên gọi HN-2, đã được phân lập từ nhiều loại cây thuốc, bao gồm A sauraujaefolia Pitard (cơm nguội sổ) và Solanum nigrum L Đây là lần đầu tiên hợp chất HN-2 được phân lập từ lá cây, mở ra những cơ hội nghiên cứu mới trong lĩnh vực dược liệu.
Pseuderanthemum bracteatum Imlay Dựa vào cấu trúc hóa học nhận thấy hợp chất HN-
Nghiên cứu của Patcharawan Sittisart và Benjamart Chitsomboon chỉ ra rằng nồng độ cao của các hợp chất phenolic có thể liên quan đến một số tác dụng sinh học của dịch chiết lá cây Hoàn ngọc trắng, bao gồm khả năng chống oxy hóa và kháng viêm Vì vậy, việc nghiên cứu tác dụng sinh học của hợp chất này là rất cần thiết.
Để làm rõ tác dụng sinh học của HN-2 và nhóm chất phenolic trong dịch chiết Hoàn ngọc, cần nghiên cứu kỹ lưỡng các cơ chế hoạt động của chúng Các nghiên cứu này sẽ giúp xác định những lợi ích sức khỏe tiềm năng mà các hợp chất phenolic mang lại, cũng như vai trò của HN-2 trong việc cải thiện chức năng sinh học.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
Sau thời gian tiến hành nghiên cứu, khóa luận đã thu được các kết quả sau:
1 Đã chiết xuất được dịch chiết ethanol toàn phần và dịch chiết phân đoạn n- hexan (6 g), CH2Cl2 (3 g), EtOAc (2 g) từ lá cây Hoàn ngọc
2 Định tính được các thành phần flavonoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, sterol trong dịch chiết ethanol
3 Phân lập và xác định cấu trúc được hoạt chất HN-1 (10 mg) là Stigmasterol, HN-2 (8 mg) là Benzyl O-β-D-glucopyranosid
Cây Hoàn ngọc là một loại thảo dược có tiềm năng lớn trong y học, nhưng hiện nay còn thiếu nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của nó Do đó, cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn để khai thác giá trị y học của cây này.
✓ Tiếp tục nghiên cứu phân lập các hoạt chất từ cây Hoàn ngọc
✓ Đánh giá tác dụng sinh học của các hợp chất đã phân lập được
Hoàng Lê Tuấn Anh, Phạm Thị Trang Thơ và các tác giả khác đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của cây Lu Lu Đực (Solanum nigrum L.) tại tỉnh Thái Bình Nghiên cứu này được trình bày tại Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 6, với nội dung từ trang 1025 đến 1031.
2 Huỳnh Kim Diệu (2008), "Khảo sát thành phần hóa học của lá Xuân hoa
(Pseuderanthemum palatiferum) ", tạp chí KHOA HỌC, tr 232-240
3 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam tập 3, Nhà Xuất Bản Trẻ, tr 67-70
4 Nguyễn Khắc Khôi, Đỗ Văn Hải, Nghiên cứu phân loại chi Xuân Hoa
(Pseuderanthemum Radlk.) thuộc họ Ô rô(Acanthaceae) Ở Việt Nam 2005
Nguyễn Hữu Thọ (2008) đã thực hiện một nghiên cứu quan trọng về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xuân Hoa Lá Hoa trong luận văn thạc sĩ Dược học tại Trường Đại học Dược Hà Nội Nghiên cứu này đóng góp vào việc hiểu rõ hơn về cây thuốc này, qua đó mở ra hướng đi mới cho các ứng dụng trong y học.
Trịnh Anh Viên (2017) đã thực hiện nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài Ardisia thuộc họ Myrsinaceae tại Việt Nam Luận văn tiến sĩ Hóa học này được trình bày tại Học viện Khoa học và Công nghệ, đóng góp quan trọng vào hiểu biết về các loài thực vật trong khu vực.
7 Bac V H., Paulsen B S., et al (2019), "Neutral Polysaccharide from the Leaves of
Pseuderanthemum carruthersii: Presence of 3-O-Methyl Galactose and Anti-
Inflammatory Activity in LPS-Stimulated RAW 264.7 Cells", Polymers (Basel), 11(7)
8 Chaudhary Jasmine, Kaur Navpreet, et al (2011), "Stigmasterol: A Comprehensive
Review", International Journal of pharmaceutical Sciences and Research, pp 2259-
9 Chayarop Kullacha, Peungvicha Penchom, et al (2011), "Pharmacognostic and
Phytochemical Investigations of Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk ex
Lindau Leaves", Pharmacognosy Journal, 3(23), pp 18-23
10 Đoàn Thị Mai Hương, Nguyễn Thị Minh Hằng, et al (2011), "Lignans and other constituents from the roots of the Vietnamese Medicinal Plant Pseuderanthemum palatiferum", Planta Med pp 951-954
11 Khonsung P., Panthong A., et al (2011), "Hypotensive effect of the water extract of the leaves of Pseuderanthemum palatiferum", J Nat Med, 65(3-4), pp 551-558
12 Komonrit P., Banjerdpongchai R (2018), "Effect of Pseuderanthemum palatiferum
(Nees) Radlk fresh leaf ethanolic extract on human breast cancer MDA-MB-231 regulated cell death", Tumour Biol, 40(9)
13 Mahato SB, AP Kundu (1994), "13C NMR Spectra of pentacyclic triterpenoids - a compilation and some salient features ", Phytochemistry 1994 (37), pp 1517-1575
14 Nguyễn Quang Vinh, Eun Jong-Bang (2013), "Antimicrobial activity of some
Vietnamese medicinal plants extracts ", Journal of Medicinal Plants Research, pp 2597-2605
15 Padee P., Nualkaew S., et al (2010), "Hypoglycemic effect of a leaf extract of
Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk in normal and streptozotocin-induced diabetic rats", J Ethnopharmacol, 132(2), pp 491-496
16 Saemphet Supap, Saemphet kanolpom (2012), "Antiproliferative effect of Moringa oleifera Lam and Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk extracts on the colon cancer cells", Journal of Medicinal Plants Research, 6(1)
17 Sittisart P., Chitsomboon B (2014), "Intracellular ROS Scavenging Activity and
Downregulation of Inflammatory Mediators in RAW264.7 Macrophage by Fresh Leaf Extracts of Pseuderanthemum palatiferum", Evid Based Complement Alternat
18 Sittisart P., Chitsomboon B., et al (2016), "Pseuderanthemum palatiferum leaf extract inhibits the proinflammatory cytokines, TNF-alpha and IL-6 expression in LPS-activated macrophages", Food Chem Toxicol, 97, pp 11-22
19 Takhtajan A (2009), flowering plants, Springer Science & Business Media, pp 559-
20 Vo Thi Nga, Nguyen Phi Linh, et al (2012), "Lignans and Triterpenes from the Root of Pseuderanthemum carruthersii var atropurpureum", pp 1125-1133.
