NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN SAPONIN của THÂN rễ sâm vũ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM ) TRỒNG ở SA PA LUẬN văn THẠC sĩ dƣợc học hà nội 2018

TỔNG QUAN

Tổng quan về sâm vũ diệp

1.2.1 Tên khoa học, tên đồng danh

Sâm vũ diệp, còn được biết đến với nhiều tên gọi như vũ diệp tam thất, hoa diệp tam thất, và trúc tiết nhân sâm, là một loại thảo dược quý hiếm Ngoài ra, nó còn mang các tên khác như tam thất lá xẻ, sâm hai lần xẻ, phan xiết (Dao), hoàng liên thất, nữu tử thất, tam thất lá lông chim, và hương sơn tam thất (Trung Quốc) Tên khoa học của loài này là một phần quan trọng trong việc xác định và nghiên cứu giá trị của nó.

Một số tên đồng danh của SVD:

Aralia bipinnatifida and various forms of Panax, including Panax pseudoginseng and Panax japonicus, are significant species in the Araliaceae family Notable varieties include Aralia quinquefolia var major and var elegantior, as well as Panax pseudoginseng var bipinnatifidus and var major These plants exhibit diverse characteristics and adaptations, contributing to their importance in herbal medicine and ecological studies Understanding their taxonomy and variations is essential for further research and application in traditional practices.

1.2.2 Đặc điểm thực vật, bộ phận dùng

Cây thân thảo sống lâu năm, ưa bóng và ẩm ướt, có thân rễ dài với nhiều đốt và vết sẹo do thân rụng hàng năm Thân khí sinh cao từ 20-30 cm, thường mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc và thường lụi vào mùa đông, sau đó mọc chồi mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 Lá cây có hình chân vịt, gồm 2-3 lá mọc vòng, với lá chét 5-7 cái (ít khi 3), dài từ 2,5-14 cm và rộng 1,5-4 cm, có gốc tròn, đầu nhọn, xẻ thùy không đều, mép răng cưa và có lông.

Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5-10 cm; cụm hoa có từ 20-

Hoa có cuống dài từ 1-1,5 cm, màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở ngọn thân với 5 cánh hoa và bầu 2-3 ô Quả mọng hình cầu hơi dẹt, đường kính từ 0,6-1,2 cm, khi chín có màu đỏ và chấm đen lớn ở đầu, chứa 1-2 hạt Hạt có hình cầu hoặc gần cầu, màu xám trắng, với vỏ cứng và có rốn hạt.

1.2.3 Đặc điểm phân bố ở Việt Nam

Sâm vũ diệp là một loài sâm quý hiếm, mọc tự nhiên ở dãy núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, với độ cao từ 1800 đến 2400 m Gần đây, loài này đã được thuần hóa và bắt đầu được trồng thử nghiệm tại một số địa phương như huyện Sa Pa, huyện Bát Xát (Lào Cai) và huyện Than Uyên (Lai Châu) Tuy nhiên, Sâm vũ diệp đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng cao tại Việt Nam.

1.2.4 Tác dụng dƣợc lý Ở Việt Nam và trên thế giới, tra cứu tài liệu thấy rằng có rất ít nghiên cứu về tác dụng sinh học của Sâm vũ diệp

Năm 2016, một nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư từ 57 loại cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc Trong số đó, Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) nổi bật với khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

Sâm vũ diệp có khả năng ức chế sự tập trung tiểu cầu in vitro với các phân đoạn khác nhau và mức liều cụ thể Cụ thể, phân đoạn tổng, n-butanol và ethylacetat cho thấy hiệu quả ở các mức liều 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL và 5 mg/mL, trong khi phân đoạn ether có tác dụng ở các mức liều 1, 2 và 5 mg/mL.

Sâm vũ diệp, theo đông y, có tác dụng bổ dưỡng, chữa thiếu máu, và cải thiện tình trạng xanh xao, gầy yếu, đặc biệt là ở phụ nữ sau sinh Ngoài ra, sâm vũ diệp còn được sử dụng để cầm máu, tán ứ, và tiêu sưng Khi sử dụng ngoài, rễ phơi khô được tán thành bột mịn có thể rắc lên vết thương để chữa chảy máu và giúp vết thương mau lành Rễ cây cũng có thể ngâm rượu và chiết xuất thành tinh sâm, mang lại hiệu quả tốt trong việc kích thích sinh dục Thêm vào đó, người dân ở khu vực trồng sâm còn sử dụng thân và lá để nấu cao, cao này có thể pha với nước hoặc rượu để uống.

Sâm vũ diệp, được biết đến với tác dụng như rễ, được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị các bệnh như hư lao, thổ huyết, chảy máu cam và tổn thương do đòn ngã Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa có nghiên cứu nào được công bố tại Việt Nam và trên thế giới chứng minh các tác dụng sinh học của sâm vũ diệp cho những công dụng này.

1.2.6 Tổng quan các nghiên cứu về thành phần hóa học SVD Ở Việt Nam và trên thế giới, tra cứu tài liệu thấy rằng có rất ít nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này

Năm 1989, một nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố việc phân lập 13 saponin từ lá khô của cây Panax japonicus var bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng, thu hái tại dải núi Tần Lĩnh, Thiểm Tây Trong số này, có 2 saponin mới được phát hiện là bipinnatifidusosid F1 và F2, cùng với 11 saponin đã được biết đến, bao gồm ginsenosid F, F2 và F3.

Rg 2 , Re, Rd, Rb 1 , Rb 3 , 24(S)-pseudoginsenosid F 11 , panasenosid và majorosid F 1

Năm 2011, một nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập thành công 10 saponin khung oleanan từ dịch chiết methanol của rễ SVD thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam Trong số này, có 3 chất mới được phát hiện là bifinosid A-C và 7 hợp chất đã biết, bao gồm narcissiflorin methyl este và chikusetsusaponin IVa.

(5), pseudoginsenosid RP 1 methyl este (6), stipuleanosid R 1 (7), pseudoginsenosid

RT 1 methyl este (8), momordin IIe (9) và stipuleanosid R 2 methyl este (10) Ở Việt Nam, nghiên cứu về TPHH của SVD còn khá mới mẻ Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2002, kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin Đồng thời bằng cách thủy phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu đƣợc acid oleanolic [13], [14] Đỗ Văn Hào năm 2017, đã phân lập và xác định đƣợc cấu trúc hóa học 3 hợp chất β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol từ phân đoạn ethyl acetat thân rễ

Me : methyl Ara(f) : -L-arabinofuranosyl Ara(p) : -L-arabinopuranosyl Glc : -D-glucopyranosyl Xyl : -D-xylopyranosyl

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của 10 saponin tách được từ rễ SVD [56]

Bảng 1.6 Các hợp chất saponin đã phân lập từ SVD

Nhƣ vậy, tổng cộng có 23 hợp chất saponin đã đƣợc xác định từ các phần của cây sâm vũ diệp

Nhận xét: Các kết qủa nghiên cứu bước đầu chỉ ra rằng saponin là thành

14 phần chính của sâm vũ diệp, trong đó saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lƣợng thấp hơn [1], [6],

Đề tài nghiên cứu thành phần hóa học của thân rễ SVD trồng ở Sa Pa tập trung vào saponin nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng dược liệu SVD tại Việt Nam.

1.2.7 Tổng quan một số nghiên cứu về phân tích định tính và định lƣợng thành phần hóa học trong SVD

Tổng quan về chất đánh dấu hóa học trong công tác kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu SVD

Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của chi Panax chủ yếu tập trung vào thành phần saponin, bao gồm cả cao chiết tổng, phân đoạn làm giàu và chất tinh khiết Tuy nhiên, so với các loài khác như tam thất (P notoginseng) và sâm Việt Nam (P vietnamensis), việc sử dụng dược liệu SVD trong y học cổ truyền vẫn gặp nhiều khó khăn do thiếu thông tin đầy đủ về thành phần hoạt chất và hoạt tính sinh học Hơn nữa, Dược điển Việt Nam IV chưa có tiêu chí định tính, định lượng cho việc kiểm nghiệm dược liệu này Vì vậy, việc xác định chất đánh dấu cho dược liệu SVD là cần thiết để xây dựng tiêu chí kiểm tra chất lượng và đảm bảo hiệu quả sử dụng.

Chất đánh dấu cho dược liệu có thể là các hợp chất sinh học quan trọng, chiếm hàm lượng cao hoặc có ý nghĩa sinh nguyên học và hóa phân loại học Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều chất đánh dấu đã được áp dụng trong kiểm nghiệm dược liệu, như hoạt chất majonosid R2 từ sâm Ngọc Linh (P vietnamensis), tanshinon IIA từ đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), và ent-18-acetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-on từ khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.) Nghiên cứu trong luận văn này tập trung vào việc xác định hợp chất saponin chính từ thân rễ SVD, xây dựng chất đối chiếu, và phát triển phương pháp định lượng HPLC cho hợp chất chính, đây là những đóng góp mới và quan trọng của nghiên cứu.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu

Cây Sâm vũ diệp, trồng tại huyện Sa Pa, Lào Cai, đã được thu hoạch vào ngày 15/07/2016 khi đạt 6 năm tuổi Mẫu cây này được xác định có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), và đã được giám định bởi ThS Nguyễn Quỳnh Nga từ Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản (DL -150716) hiện đang được lưu giữ tại Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu.

Thân rễ Sâm vũ diệp là đối tượng nghiên cứu chính, có đặc điểm nhiều đốt và vết sẹo, với hình dáng cong ngoằn ngoèo, dài từ 10-12 cm và đường kính 1,2-1,8 cm Chất liệu của thân rễ này cứng chắc, giòn và dễ bẻ, bề mặt khi bẻ có kết cấu lởm chởm, màu sắc vàng nâu nhạt Sâm vũ diệp tỏa ra mùi thơm nhẹ, vị đắng và hơi ngọt.

- Thân rễ SVD đƣợc rửa sạch, cắt miếng mỏng, sấy khô ở 50 o C, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát

Hình 2.1 Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem ) trồng tại

Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị và dụng cụ đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, cũng như tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức)

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, Cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai

- Cân xác định độ ẩm Prescisa HA 60

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000 mL

- Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc)

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ)

- Bình chạy sắc kí lớp mỏng

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 366 nm

- Cột sắc ký các loại kích cỡ

- Máy đo năng suất quay cực DIP-360 digital polarimeter (Jasco, Nhật)

- Máy đo phổ khối lƣợng ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) AGILENT

1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ)

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân JEOL ECX 400 NMR (400 MHz, Nhật Bản) và BRUKER-AM-500 FT-NMR (500 MHz, Đức) là những thiết bị hiện đại sử dụng dung môi trong phân tích.

CD 3 OD, chất nội chuẩn là tetramethylsilan (TMS)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động

Dụng cụ thủy tinh là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm, bao gồm bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, bình cầu với dung tích từ 50-2000 mL, màng lọc 0,45 µm, ống nghiệm, pipet chính xác, phễu chiết phân lớp và tủ hốt Những dụng cụ này hỗ trợ hiệu quả trong việc thực hiện các thí nghiệm và phân tích hóa học.

Dùng cho chiết xuất và phân lập

Ethanol (EtOH) 70%, methanol (MeOH), dicloromethan (CH 2 Cl 2 ), cloroform (CHCl 3 ), ether, ethylacetat (EtOAc), n-butanol (BuOH)

Hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu và phân tích đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi dùng

Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel (0,040 - 0,063 mm, Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50μm, YMC Co Ltd., Nhật);

18 dùng trong SKLM là bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel

60 F 254, pha đảo Silica gel 60 RP-18 F 254 S (Merck, Damstadt, Đức)

Thuốc thử dung dịch H 2 SO 4 10 % trong EtOH

Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, Acetonitril, Acid acetic) của

Merck, Đức, nước cất 2 lần dùng cho phân tích HPLC.

Nội dung nghiên cứu

- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học 2-3 saponin chính của thân rễ SVD trồng ở Sa Pa

Khảo sát các điều kiện sắc ký HPLC là cần thiết để tách hoàn toàn các hợp chất saponin chính trong mẫu thử thân rễ SVD, đồng thời phân tách chúng với các hợp chất khác.

Đánh giá tổng hợp mẫu hợp chất chính được phân lập và tinh chế bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích nhằm kiểm tra khả năng sử dụng của chúng như chất đối chiếu.

- Xây dựng dấu vân tay sắc ký HPLC dƣợc liệu SVD

Thẩm định điều kiện định lượng saponin chính trong thân rễ SVD bằng phương pháp HPLC sử dụng chất đối chiếu đã được xác định cấu trúc Đồng thời, xác định tổng tạp chất thông qua phương pháp chuẩn hóa diện tích.

- Xác định hàm lƣợng chất saponin chính trong mẫu dƣợc liệu SVD trồng ở Sa

Pa bằng phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết xuất SVD

Nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp cho thấy saponin là thành phần chính Để xác định phương pháp chiết xuất phù hợp nhất cho mẫu thân rễ SVD, cần tham khảo tài liệu về chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu.

- Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70%

- Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng - lỏng

Quy trình chiết xuất thân rễ SVD bao gồm các bước rửa sạch, phơi khô và thái nhỏ Sau đó, thân rễ được chiết hồi lưu bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 70°C trong ba lần Cuối cùng, bã dược liệu được lọc bỏ, và dịch chiết ethanol được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất để thu được sản phẩm tinh khiết.

Dưới áp suất giảm, cao ethanol được thu được từ 19 môi, sau đó phân tán trong nước và lắc với các dung môi có độ phân cực tăng dần như ether, ethyl acetat và n-butanol theo tỷ lệ 1:1, lặp lại 3 lần Các phân đoạn ether, ethyl acetat và n-butanol được cất quay chân không để thu hồi dung môi, sau đó sấy dưới áp suất giảm để thu được 3 cắn tương ứng với từng phân đoạn.

2.3.2 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hóa học

Để tiến hành phân lập, lựa chọn phân đoạn n-butanol và sử dụng phương pháp sắc ký cột pha thường cùng với sắc ký cột pha đảo Quá trình phân lập các hợp chất được theo dõi thông qua sắc ký lớp mỏng.

Sắc ký cột (SKC) sử dụng chất hấp phụ là silica gel pha thường silica gel 60 (0,04 - 0,063 nm, Nacalai Tesque, Inc., Nhật) và pha đảo YMC ODS-A (50àm, YMC Co Ltd, Nhật) Quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM).

- Sắc ký lớp mỏng (SKLM): đƣợc thực hiện trên bản mỏng Silicagel 60 F254

Silicagel RP-18 F 254 S (Merk) đã được kích hoạt ở nhiệt độ 105°C trong 1 giờ Để phát hiện chất, có thể sử dụng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng dung dịch H2SO4 10% trong Ethanol 96% Sau khi phun đều dung dịch lên bản mỏng, cần sấy khô và hơ nóng trên bếp điện từ từ cho đến khi xuất hiện màu.

Tinh chế chất phân lập bằng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi thích hợp

Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập bằng sắc ký lớp mỏng

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

Các phương pháp phổ như phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) được sử dụng để xác định cấu trúc của các chất phân lập Bằng cách so sánh dữ liệu phổ thu được với các tài liệu tham khảo đã công bố, quá trình biện giải cấu trúc trở nên chính xác và đáng tin cậy hơn.

2.3.4 Phương pháp phân tích định tính, định lượng saponin chính trong thân rễ SVD bằng HPLC

This article analyzes high-performance liquid chromatography (HPLC) using the Agilent 1260 Infinity Series system from Agilent Technologies, USA It features a DAD detector and an automatic sample injection system, highlighting the efficiency and precision of this advanced chromatography technology.

2.3.4.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Khảo sát các tài liệu và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm là bước quan trọng để xác định các yếu tố như bước sóng, thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, thể tích bơm mẫu Việc lựa chọn các điều kiện sắc ký phù hợp sẽ giúp đảm bảo quá trình phân tích định tính và định lượng thành phần saponin trong thân rễ SVD đạt hiệu quả cao.

2.3.4.2 Nhận dạng các pic trên sắc ký đồ và xác định độ tinh khiết của các chất phân lập được từ thân rễ SVD

Tiến hành sắc ký HPLC để phân lập mẫu chất và mẫu cao BuOH theo điều kiện đã chọn Nhận dạng các pic trên sắc ký đồ dựa vào thời gian lưu tương ứng của mẫu thử, từ đó xác định hợp chất saponin chính trong dược liệu thông qua sự tương quan diện tích pic Độ tinh khiết của hợp chất chính được đánh giá bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích tổng tạp.

Yêu cầu về chất sử dụng làm chất đối chiếu là diện tích pic chính phải lớn hơn 95,0%, trong khi tổng diện tích các pic phụ không được vượt quá 5,0% so với tổng diện tích pic trên sắc ký đồ tính theo nguyên trạng Đồng thời, cần loại bỏ các pic của pha động và những pic có tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) nhỏ hơn 2/1.

Saponin chính trong thân rễ SVD được tinh chế đạt độ tinh khiết cần thiết, nhằm làm chất đối chiếu hóa học trong phân tích định tính và kiểm nghiệm dược liệu SVD.

2.3.4.3 Xây dựng dấu vân tay sắc ký HPLC của dược liệu Sâm vũ diệp

Phân tích các đặc điểm hóa học đặc trưng của SVD bằng phương pháp HPLC cho phép xác định dấu vân tay sắc ký của dược liệu Qua sắc ký đồ, các đặc điểm đặc trưng được lựa chọn để xây dựng dấu vân tay sắc ký cho SVD Các bước thực hiện bao gồm thu thập dữ liệu sắc ký và phân tích các thành phần hóa học của dược liệu.

Chọn điều kiện chiết mẫu và sắc ký phù hợp như cột, pha động và detector thích hợp cho các thành phần hóa học của dược liệu Tiến hành sắc ký nhiều lần trên mẫu thử và mẫu đối chiếu để đánh giá độ lặp lại, độ tinh khiết và ổn định của các pic trên sắc ký đồ Cuối cùng, lựa chọn các pic đặc trưng cho dược liệu, đảm bảo đáp ứng các yêu cầu cần thiết.

- Pic phải xuất hiện ổn định

- RSD của thời gian lưu 95,0%)

- Diện tích pic tương đối lớn (thông thường phải >1% tổng diện tích các pic chính)

- Độ phân giải với các pic cạnh không nhỏ hơn 1,0

Trong quá trình phân tích sắc ký, cần chọn một pic đặc trưng làm pic đánh dấu, thường là pic của chất đối chiếu Sau đó, tính toán thời gian lưu tương đối (RRT) của các pic còn lại so với pic đánh dấu và lập bảng dữ liệu về các pic đặc trưng trong sắc ký đồ của dược liệu Bảng dữ liệu này, kết hợp với sắc ký đồ chuẩn, sẽ tạo thành dấu vân tay HPLC của dược liệu theo các điều kiện sắc ký đã được quy định Thời gian lưu tương đối của mỗi pic được tính dựa trên thời gian lưu của pic đánh dấu theo công thức đã xác định.

RRT= Thời gian lưu của pic so sánh/ thời gian lưu của pic đánh dấu

2.3.4.4 Thẩm định phương pháp HPLC dùng định lượng saponin chính

Phương pháp xử lý số liệu – đánh giá kết quả

Các thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp thống kê sinh học với ba lần lặp lại để tính giá trị trung bình Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) được tính toán bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007.

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

Chiết xuất và phân lập các hợp chất saponin từ thân rễ sâm vũ diệp

Cân 500 g thân rễ SVD với độ ẩm 7,81% và chiết xuất bằng phương pháp hồi lưu ở 70°C với dung môi ethanol 70% trong 3 giờ (3 lần, mỗi lần 1500 ml) Dịch chiết ethanol được lọc qua giấy lọc, thu được 95,9 g cao chiết tổng Cao chiết hòa tan trong 500 ml nước cất và tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng với các dung môi ether, ethyl acetat và n-butanol (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 ml) Dịch chiết phân đoạn được cất thu hồi dung môi và sấy dưới áp suất giảm, thu được 3 cắn tương ứng: ether (5,82 g), ethyl acetat (2,70 g) và n-butanol (21,70 g) Quá trình chiết xuất được mô tả trong hình 3.1.

Hiệu suất của cắn 3 phân đoạn so với cắn toàn phần và so với nguyên liệu khô đƣợc trình bày trong bảng 3.1

STT Phân đoạn Khối lƣợng dƣợc liệu (g)

% so với nguyên liệu khô

Bảng 3.1 Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ Sâm vũ diệp

Trong nghiên cứu, phân đoạn n-butanol đã cho khối lượng cắn cao nhất, chiếm 4,71% so với nguyên liệu khô Trong khi đó, khối lượng cắn thu được từ phân đoạn ether và ethyl acetat lần lượt chỉ đạt 1,26% và 0,59%.

Phân lập các chất trong phân đoạn BuOH có thể thực hiện bằng phương pháp sắc ký cột Để bắt đầu, cột sắc ký cần được làm sạch và lót một lớp bông mỏng ở đáy Sau đó, tiến hành nhồi cột bằng phương pháp nhồi cột để chuẩn bị cho quá trình tách biệt các thành phần.

Thân rễ SVD sau sơ chế (500 g)

Chiết hồi lưu (3 lần x 1500 ml/ lần x 3 h/ lần)

3 Cất quay áp suất giảm

Cất quay áp suất giảm, sấy

Ethyl acetat, lắc, gạn Cất quay áp suất giảm, sấy

Dịch còn lại n-butanol, lắc, gạn

Cất quay áp suất giảm, sấy

Hình 3.1 Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng

26 ướt với chất nhồi cột silica gel pha thường hay silica gel pha đảo Ổn định cột trong 24h

Tiến hành phân lập sắc ký bằng cột nhồi silica gel (Φ85 mm × 80 mm) với dung môi rửa giải CH2Cl2 - MeOH theo gradient nồng độ từ tỷ lệ 5:1 đến 0:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL Các dịch rửa giải được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, sau đó dồn các ống có cùng thành phần lại và loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 4 phân đoạn ký hiệu B1, B2, B3, B4.

Phân đoạn B4 (5,1 g) được xử lý bằng sắc ký cột pha đảo RP18 (Φ50 mm x 350 mm) với quá trình rửa giải đẳng dòng sử dụng hệ pha động MeOH-H2O (1:1, v/v, 1600 mL), thu được hợp chất số 1 với khối lượng 180 mg.

Phân đoạn B2 (4,3 g) được phân lập bằng sắc ký cột pha thuận silica gel (Φ 45 mm x 350 mm) với dung môi rửa giải là CHCl3 - MeOH - H2O (3:1:0,1, v/v/v, 1500 mL) Thành phần của dịch rửa giải được kiểm tra bằng SKLM để gộp các ống có cùng thành phần, sau đó loại dung môi dưới áp suất giảm đã thu được 4 phân đoạn nhỏ.

Tiếp theo từ phân đoạn B2.2 (920 mg), quá trình phân lập sử dụng sắc ký cột pha đảo RP18 (Φ50 mm x 350 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (1:1, v/v, 1400 mL) Thành phần của dịch rửa giải được kiểm tra bằng SKLM để gộp các ống có cùng thành phần Sau đó, loại dung môi dưới áp suất giảm thu được hợp chất số 2 (100 mg) Quy trình phân lập được trình bày tóm tắt trong hình 3.2.

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất số 1, 2 từ phân đoạn n-butanol

3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập đƣợc bằng SKLM

Chất số 1 và số 2 sau khi phân lập đƣợc kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM

Silicagel RP-18 F 254 S trên cùng một bản mỏng, triển khai với hệ dung môi Methanol:H 2 O =2:1, thu đƣợc sắc ký đồ nhƣ hình 3.3

Hình 3.3 Sắc ký đồ của chất số 1 và số 2 phân lập được sau khi phun

Sắc ký cột Silica gel (Φ85 mm × 80 mm)

CH 2 Cl 2 -MeOH (5:1 0:1, v/v, 600 mL/PĐ)

SKC pha đảo C18 (Φ50 mm × 350 mm) MeOH-H2O

Sau khi tiến hành phun thuốc thử, cả hai hợp chất đều xuất hiện vết màu hồng đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen với hệ số Rf lần lượt là 0,30 và 0,34 Điều này cho thấy hai hợp chất phân lập được là những chất tinh khiết.

Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập đƣợc

Thể chất: Bột màu trắng

Phổ ESI-MS: m/z 1087 [M-H] - tươngứng với khối lượng phân tử là M88

Phổ 1 H-NMR (CD 3 OD; 500 MHz) và 13 C-NMR (CD 3 OD; 125 MHz), DEPT: xem bảng 3.2

Bảng 3.2 Số liệu phổ 1 H và 13 C-NMR, DEPT của hợp chất số 1

* c của chất stipuleanosid R 2 đo trong CD 3 OD [40]; a Đo trong CD 3 OD, b 125 MHz, c500 MHz

Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng bột màu trắng, năng suất quay cực riêng

Hợp chất này, với công thức hóa học là + 7,5 (c 0,2, MeOH), phản ứng với H2SO4 10% khi được đun nóng, tạo ra màu hồng đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen Phân tích từ phổ 13C NMR và DEPT cho thấy có 7 nhóm CH3 trong cấu trúc của hợp chất.

Trong nghiên cứu về saponin từ sâm vũ diệp, phổ 13C NMR cho thấy sự xuất hiện của 30 tín hiệu carbon, cho thấy cấu trúc của saponin này bao gồm 10 nhóm CH, 6 nhóm CH và 6 nguyên tử carbon bậc 4, cùng với một nhóm COOR Phân tích cho thấy phần aglycon của saponin này có cấu trúc triterpene thuộc khung oleanan, đã được công bố trong tài liệu trước đó.

1H NMR xuất hiện 7 tín hiệu singlet của của các nhóm methyl bậc ba tại δ 0,81,

Trong phân tích phổ NMR, các tín hiệu tại 0,85, 0,93, 0,95, 0,96, 1,05 và 1,17 cho thấy sự hiện diện của các nhóm CH3, trong đó có một nối đôi ở C-12/C-13 với tín hiệu tại δ 5,27 (1H, br s, H-12) Bên cạnh đó, các tín hiệu cộng hưởng trong vùng δ 3,0-4,0 chỉ ra sự có mặt của các nhóm oxymetin và oxymethylen từ bốn phân tử đường, bao gồm một đơn vị glucorunic acid (GluA), hai đơn vị glucose (Glc) và một arabifuranose [Ara(f)] Các tín hiệu proton anomeric tại δ 4,01 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-1ʹ), 4,92 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1ʹʹ) và 5,19 giúp nhận diện các phân tử này.

Trên phổ 13C NMR, xuất hiện 53 tín hiệu nguyên tử cacbon, bao gồm 23 tín hiệu thuộc bốn đơn vị đường [GluA, 2 Glc và Ara(f)] và 30 tín hiệu còn lại thuộc phần aglycon oleanolic acid Đặc biệt, tín hiệu của một oxymethin được ghi nhận tại δ 91,03 (C-3), cùng với nối đôi đặc trưng C-5,40 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1ʹʹʹʹ).

12/C-13 tại δ 123,8 và 144,7 ppm cùng với một nhóm carbonyl acid carboxylic tại δ 178,1 (C-28) [56], [42] Hơn nữa, phổ khối ESI-MS của 1 xuất hiện pic ion tại 1087

M-H có công thức phân tử C53H84O23 (M = 1088), và thông qua các dữ liệu phổ kết hợp với so sánh số liệu phổ NMR đã được công bố, cấu trúc hóa học của hợp chất 1 được xác định là stipuleanosid R2, một saponin chưa từng được công bố từ sâm vũ diệp Đáng chú ý, dạng methyl ester của stipuleanosid R2 đã được ghi nhận trong một nghiên cứu trước đây liên quan đến sâm vũ diệp.

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất số 1

Thể chất: Bột màu trắng

Phổ ESI-MS: m/z 964 [M+Na] + , tươngứng với khối lượng phân tử là M = 940 Phổ 1 H-NMR (CD 3 OD; 400 MHz) và 13 C-NMR (CD 3 OD; 100 MHz): xem bảng 3.3

Bảng 3.3 Số liệu phổ 1 H và 13 C-NMR của hợp chất số 2

Vị trí C * δ C δ C a,b δ H a,c (độ bội, J= Hz) Aglycon

* c của chất aralosid A methyl ester đo trong CD 3 OD [40]; a Đo trong CD 3 OD, b 100

Hợp chất 2 được thu nhận dưới dạng bột màu trắng từ phân đoạn BuOH và phản ứng với H2SO4 10% khi hơ nóng, tạo ra màu hồng đậm sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen Phổ 13C NMR của hợp chất này cho thấy 30 carbon, chỉ ra rằng đây là một saponin với phần aglycon là triterpene khung oleanane, đã được xác nhận từ sâm vũ diệp Tương tự, phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 2 cũng mang đặc trưng của một saponin với phần aglycon là acid oleanolic, thể hiện các tín hiệu ở nối đôi tại C-12/C-13 [δ 122,2 (C-].

12), 143,2 (C-13) và 5,22 (1H, br s, H-12)], một nhóm oxymethin tại δ 89,6 (C-3) và một nhóm carbonyl carboxylic tại δ 176,4 (C-28) mà tại đó các phân tử đường

Hợp chất 2 được xác định là aralosid A methyl ester, một saponin chưa được công bố từ Sâm vũ diệp, thông qua phân tích độ dịch chuyển hóa học và phổ NMR Các tín hiệu trên phổ NMR cho thấy sự hiện diện của ba đơn vị đường: một GluA, một Ara(f) và một Glc, với các tín hiệu proton anomeric tại δ 4,35, 5,38 và 5,03 Phân tử đường GluA chứa nhóm COOCH3 tại δ 53,0 Đặc biệt, phổ khối ESI-MS của hợp chất 2 cho tín hiệu m/z 964, phù hợp với ion phân tử [M+Na]+ của C48H76O18 (M= 940), khẳng định thêm cấu trúc của aralosid A methyl ester.

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất số 2

Phân tích thành phần saponin phân lập đƣợc từ sâm vũ diệp bằng HPLC 34 1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC

Sắc ký pha đảo hiện nay là phương pháp phổ biến với nhiều ưu điểm vượt trội, đặc biệt trong việc phân tích dược liệu có thành phần hóa học phức tạp Để đạt được sự tách biệt tốt và thời gian phân tích hợp lý, chúng tôi đã tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp tách chiết và định lượng hợp chất saponin bằng HPLC Qua đó, chúng tôi tiến hành khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký thích hợp để phân tích hai saponin được phân lập từ thân rễ Sâm vũ diệp.

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity

- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)

- Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203 nm

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

- Thể thớch bơm mẫu: 20 àl

- Dung môi pha mẫu: Methanol

- Pha động: Acetonitril (kênh A) : 0,5% acid acetic/H 2 O (kênh B) với chương trình gradient nhƣ bảng 3.4

Bảng 3.4 Chương trình dung môi

Dưới các điều kiện sắc ký đã nêu, các thành phần saponin trong mẫu thử từ dịch chiết n-butanol và ethanol của thân rễ SVD được tách ra một cách hiệu quả, với các pic cân đối và thời gian lưu hợp lý.

3.3.2 Nhận dạng các pic trên sắc ký đồ và xác định độ tinh khiết sắc ký của các chất phân lập đƣợc từ thân rễ SVD

3.3.2.1 Nhận dạng các pic trên sắc ký đồ của hai saponin phân lập được

Pha mẫu chất 1 và 2 bằng cách sử dụng cân phân tích để cân chính xác khoảng 1,0 mg mỗi chất Sau đó, pha chúng thành dung dịch có nồng độ 1000 µg/mL trong methanol Tiến hành siêu âm trong 10 phút và lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm.

Pha mẫu thử: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 100,0 mg cao n-butanol

36 thân rễ Sâm vũ diệp rồi hòa tan trong methanol với nồng độ 100,0 mg/mL, siêu âm

10 phỳt, ly tõm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 àm

Tiến hành sắc ký HPLC với từng hợp chất phân lập đƣợc và so sánh với SKĐ thu đƣợc của mẫu thử Sắc ký đồ thu đƣợc nhƣ hình 3.6

Kết quả phân tích HPLC cho thấy chất 1 và chất 2 là các hợp chất thiên nhiên có trong sâm vũ diệp, với thời gian lưu tương ứng trong dung dịch cao butanol lần lượt là 15,565 và 16,577 phút, được xác định qua phương pháp tiêm đồng thời.

Hợp chất stipuleanosid R2 được phân lập từ nhiều mẫu SVD trồng tại Sa Pa, cho thấy hàm lượng cao nhất trong thân rễ sâm vũ diệp qua phân tích sắc ký HPLC Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra stipuleanosid R2 có các tác dụng sinh học quan trọng như gây độc tế bào và chống viêm Do đó, hợp chất này bước đầu đáp ứng tiêu chí làm chất đánh dấu cho dược liệu sâm vũ diệp tại Sa Pa Tiếp theo, chúng tôi sẽ kiểm tra khả năng sử dụng stipuleanosid R2 làm chất đối chiếu thông qua việc xác định độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký HPLC.

Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC của 2 saponin phân lập được, 1 (A) và 2 (B), và cao

3.3.2.2 Xác định độ tinh khiết sắc ký của stipuleanosid R 2 phân lập được Đánh giá độ tinh khiết qua tổng tạp theo phương pháp chuẩn hóa diện tích Tiến hành phõn tớch 01 dung dịch stipuleanosid R 2 nồng độ 1000 àg/mL lặp lại 06 lần Tính kết quả bằng phương pháp phần trăm diện tích pic (bỏ qua pic của pha động và pic có S/N 100 àM, cho thấy khả năng ức chế hoạt động phiền muộn NF-κB với các giá trị IC 50 lần lượt là 18,9 và 6,3 àM trên dòng tế bào HepG2, liên quan đến khả năng chống ung thư và kháng viêm Ngoài ra, hợp chất này cũng được công bố có tác dụng hạ đường huyết.

Hai hợp chất saponin được phân lập từ thân rễ SVD đã đóng góp quan trọng vào cơ sở dữ liệu hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu sâm vũ diệp Điều này cũng tạo nền tảng cho các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các đối tượng tiềm năng thuộc chi Panax.

4.2 VỀ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R 2 DÙNG LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU ĐỂ PHÂN TÍCH

Dựa trên các tiêu chí lựa chọn chất đánh dấu cho dược liệu, stipuleanosid R2 đáp ứng các yêu cầu cần thiết để trở thành chất đánh dấu cho dược liệu Sâm vũ diệp trồng.

Stipuleanosid R2 đã được phân lập từ thân rễ SVD và kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC với kết quả đạt 96,33%, đáp ứng yêu cầu làm chất đối chiếu Đây là lần đầu tiên hợp chất này được tinh chế và sử dụng trong phân tích, nhằm xây dựng tiêu chuẩn cho kiểm nghiệm dược liệu Sâm vũ diệp Mặc dù thời gian có hạn, chúng tôi tạm thời sử dụng stipuleanosid R2 làm chất đối chiếu để phát triển phương pháp Tuy nhiên, việc thiết lập chất chuẩn này cần được đánh giá thêm theo các tiêu chí của DĐVN và dược điển quốc tế.

4.3 VỀ XÂY DỰNG DẤU VÂN TAY SẮC KÝ HPLC DƢỢC LIỆU SVD

Nghiên cứu từ các loài thuộc cùng chi Panax ở Việt Nam, Sâm vũ diệp và

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M Feng) có hình thái rất giống Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grush) Hiện nay trên thị trường đang có

Dữ liệu “dấu vân tay HPLC” được xây dựng nhằm định tính và kiểm tra chất lượng dược liệu, giúp giảm thiểu sự nhầm lẫn giữa các loài Việc khảo sát động thái tích lũy và sự thay đổi thành phần hóa học theo độ tuổi là rất quan trọng để hoàn thiện dữ liệu dấu vân tay sắc ký, phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược liệu SVD.

Phương pháp phân tích định lượng saponin bằng HPLC được công nhận bởi Dược điển các nước là một phương pháp tiên tiến, vượt trội so với các phương pháp quang phổ và khối lượng hiện nay HPLC mang lại độ chính xác cao, đáp ứng tốt yêu cầu phân tích từng thành phần riêng lẻ trong mẫu, đặc biệt là đối với các mẫu phức tạp như cao chiết từ dược liệu.

Dựa trên tài liệu tham khảo và các điều kiện hiện có, chúng tôi đã lựa chọn chương trình sắc ký như mô tả trong mục 3.3.1 Với điều kiện sắc ký đã chọn, các chất nghiên cứu trong mẫu thử từ dịch chiết n-butanol và ethanol của thân rễ SVD được tách biệt tốt, với pic cân đối và thời gian lưu hợp lý, phù hợp cho việc định lượng thành phần trong thân rễ SVD.

Lần đầu tiên, phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong SVD đã được xây dựng bằng HPLC và được thẩm định về tính đặc hiệu, độ thích hợp của hệ thống, xác định tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, LOD và LOQ Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp này đáp ứng yêu cầu phân tích và có thể được sử dụng để sơ bộ xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu Sâm vũ diệp cũng như các dược liệu khác chứa thành phần này.

4.5 VỀ VIỆC XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG STIPULEANOSID R 2 TRONG MẪU SVD SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát hàm lượng thành phần stipuleanosid R 2 trong mẫu thân rễ Sâm vũ diệp, một loại dược liệu quý hiếm, được thu thập tại Sa Pa vào ngày 15/07/2016 Đây là lần đầu tiên thành phần này được nghiên cứu và phân tích cụ thể tại Việt Nam.