NGÔ THỊ DUYÊN xây DỰNG PHƢƠNG PHÁP sắc ký LỎNG KHỐI PHỔ để xác ĐỊNH một số CHẤT cấm TRONG mỹ PHẨM LUẬN văn THẠC sĩ dƣợc học

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ QUI ĐỊNH QUẢN LÝ MỸ PHẨM

1.1.1 Quản lý mỹ phẩm trên thế giới

Mỹ phẩm tại Mỹ được quản lý bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (USFDA), tuy nhiên, USFDA không yêu cầu phê duyệt trước cho các sản phẩm và thành phần của chúng, ngoại trừ chất phụ gia màu cần được phê duyệt mục đích sử dụng Dù vậy, USFDA vẫn thiết lập một số quy định quản lý mỹ phẩm để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

- Phải ghi nhãn mác đúng quy định

- Thông tin về sản phẩm rõ ràng, có hướng dẫn sử dụng

- Sản phẩm có chứa các thành phần có thể gây kích ứng da cần phải được kiểm tra sơ bộ theo hướng dẫn kèm theo

- Sản phẩm không được chứa chất độc hại, chất gây ô nhiễm hoặc phân hủy gây dị ứng cho người sử dụng

Các quốc gia châu Âu tuân thủ Chỉ thị quản lý mỹ phẩm của Liên minh Châu Âu, được phê duyệt từ năm 1976, trong đó bao gồm các phụ lục quan trọng.

- Phụ lục I: Danh mục 20 nhóm sản phẩm

- Phụ lục II: Danh mục các chất bị cấm: 1132 chất và nhóm chất

- Phụ lục III: Danh mục các chất có giới hạn về hàm lượng, nồng độ và điều kiện sử dụng: 396 chất

- Phụ lục IV: Danh mục các chất màu được phép sử dụng

- Phụ lục VI: Danh mục các chất bảo quản

- Phụ lục VII: Danh mục các chất lọc tia UV

Châu Âu yêu cầu mọi sản phẩm mỹ phẩm được bán trên thị trường phải đăng ký thông tin trên cổng thông tin sản phẩm Nhà sản xuất có trách nhiệm đảm bảo sự an toàn cho các sản phẩm của mình.

Nhật Bản quản lý mỹ phẩm theo luật Quản lý Dược – PAL (Pharmaceutical Affairs Law) được phê duyệt lần đầu tiên vào năm 1943, có sửa đổi vào những năm

Vào năm 2001, luật về mỹ phẩm đã trải qua nhiều thay đổi quan trọng, bãi bỏ yêu cầu phê duyệt hoặc cấp phép trước khi sản phẩm được đưa ra thị trường Theo quy định mới, các nhà sản xuất và nhà phân phối có trách nhiệm đảm bảo tính an toàn cho sản phẩm của mình Họ cũng phải thông báo tên sản phẩm trước khi sản xuất hoặc nhập khẩu, giúp các cơ quan chức năng xác định đặc điểm của từng sản phẩm.

Năm 2003, các nước ASEAN đã thông qua và cam kết thực hiện "Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm" Hướng dẫn mỹ phẩm ASEAN (ACD) dựa trên quy định của Liên minh Châu Âu, bao gồm các danh mục quan trọng như: danh mục các chất bị cấm (Phụ lục II), các chất được sử dụng có giới hạn về hàm lượng và nồng độ (Phụ lục III), các chất màu (Phụ lục IV), chất bảo quản (Phụ lục VI) và chất lọc tia UV (Phụ lục VII).

* Tóm tắt những quy định chính về mỹ phẩm của Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản và ASEAN [8], [23] được thể hiện ở bảng 1.1:

Bảng 1.1 Một số nội dung quản lý mỹ phẩm của Châu Âu, Mỹ, Nhật và ASEAN

Nội dung quản lý Châu Âu Mỹ Nhật ASEAN

Thông tin sản phẩm Có Không bắt buộc

Kiểm tra trên thị trường Có Có Có Có

An toàn sản phẩm (nhà sản xuất chịu trách nhiệm)

Danh mục chất cấm Có Có Có Có

Danh mục chất màu Có Có Có Có

Danh mục chất bảo quản Có Không Có Có

Danh mục chất lọc tia UV Có Có Có Có

Danh pháp quốc tế thành phần mỹ phẩm

1.1.2 Quản lý mỹ phẩm ở Việt Nam

Vào ngày 02/09/2003, chính phủ Việt Nam đã ký kết “Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm” Hiệp định này đánh dấu sự cam kết của 10 nước ASEAN trong việc thực hiện tiến trình hòa hợp, chính thức có hiệu lực từ ngày 01/01/2008.

Vào ngày 20/1/2011, Bộ Y tế đã ban hành thông tư số 06/2011/TT-BYT quy định về quản lý mỹ phẩm, bao gồm 11 chương và 53 điều Thông tư này áp dụng cho cả sản phẩm mỹ phẩm sản xuất trong nước và mỹ phẩm nhập khẩu lưu thông tại Việt Nam Nó quy định các vấn đề như công bố sản phẩm, hồ sơ thông tin, yêu cầu an toàn, ghi nhãn, quảng cáo, xuất nhập khẩu mỹ phẩm, lấy mẫu kiểm tra chất lượng, cũng như trách nhiệm của các tổ chức, cá nhân liên quan đến sản xuất và buôn bán mỹ phẩm, nhằm đảm bảo tuân thủ các quy định quản lý mỹ phẩm.

TỔNG QUAN VỀ NHÓM CHẤT GLUCOCORTICOID

1.2.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa

- Các glucocorticoid (GC) có chung khung cấu trúc steroid như hình 1.1

Hình 1.1 C ng thức cấu tạo chung của GC

- Công thức cấu tạo của 12 GC nghiên cứu với các nhóm thế ở vị trí R6, R9,

R 11 , R 16, vàR 21 được trình bày cụ thể ở bảng 1.2:

Bảng 1.2 C ng thức cấu tạo của 12 GC nghiên cứu

Công thức phân tử và tính chất lý hóa [15] của các GC nghiên cứu được liệt kê ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Tính chất lý hóa của các GC nghiên cứu

CTPT Khối lƣợng phân tử

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, đa hình

Không tan trong nước, khó tan trong EtOH 96 % và methylen clorid

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng

Không tan trong nước, hơi tan trong EtOH khan, khó tan trong methylen clorid

Không tan trong nước, dễ tan trong methylen clorid, tan trong dioxan, hơi tan trong aceton, khó tan trong EtOH 96 % và MeOH HCTA C 23 H 32 O 6 404,5

Không tan trong nước, hơi tan trong EtOH khan và methylen clorid

Không tan trong nước, hơi tan trong EtOH 96 %

Không tan trong nước, dễ tan trong EtOH 96 %, khó tan trong methylen clorid FLA C24H30F2O6 452,5

Tan trong aceton và EtOH, không tan trong nước

Không tan trong nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong EtOH 96 %

Không tan trong nước, dễ tan trong aceton và methylen clorid, tan trong EtOH 96 %

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng Không tan trong nước, dễ tan trong aceton và methylen clorid, hơi tan trong EtOH 96 %

Không tan trong nước, tan trong aceton và methylen clorid, khó tan trong EtOH

Các GC không tan trong nước nhưng có khả năng hòa tan trong các dung môi như ethanol, aceton và methanol Điều này là yếu tố quan trọng trong việc lựa chọn dung môi để chiết xuất các GC trong quá trình xử lý mẫu mỹ phẩm.

Glucocorticoid là loại thuốc có nhiều tác dụng dược lý quan trọng, bao gồm chống viêm, chống dị ứng và ức chế miễn dịch, được chỉ định trong nhiều tình huống y khoa khác nhau Một trong những ứng dụng của glucocorticoid là sử dụng tại chỗ để kiểm soát các tình trạng viêm da như viêm da cơ địa và eczema.

1.2.3 Tác dụng không mong muốn

Các glucocorticoid (GC) có thể gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn như loét dạ dày, phù, tăng huyết áp, tăng đường huyết, loãng xương, và hội chứng Cushing Đặc biệt, việc sử dụng corticoid tại chỗ trong điều trị các bệnh về da hoặc trong mỹ phẩm trong thời gian dài có thể dẫn đến nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng.

- Rạn da (nách, háng, bẹn)

- Rậm lông, lông mọc dài ra

- Viêm da quanh miệng, trứng cá đỏ do GC

- Khi ngừng GC tại chỗ có thể gây ra các tổn thương như:

+ Da đỏ, bừng, nóng (viêm da so GC hoặc chứng phụ thuộc GC)

+ Viêm da sẩn, mụn mủ (trứng cá đỏ do GC, viêm da quanh miệng, viêm da quanh mắt)

Theo Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN, GC được liệt kê trong danh mục các chất cấm sử dụng trong mỹ phẩm, cụ thể là nhóm chất số 300 tại Phụ lục II.

1.2.4 Một số phương pháp định tính và định lượng GC trong mỹ phẩm

Hiện nay, đã có nhiều phương pháp như phương pháp TLC [7], [10], phương pháp HPLC với detector UV- VIS [5], [10], phương pháp LC – MS/MS [16], [19],

[21], [22] đã được sử dụng để định tính và định lượng GC trong mỹ phẩm

Tóm tắt một số phương pháp định tính, định lượng GC được trình bày trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số phương pháp định tính và định lượng GC

PP PP xử lý mẫu KTT

Thời gian phân tích (phút)

TLC - Mẫu kem: chiết mẫu với

MeOH bằng cách để trên cách thủy ấm, ly tâm, để lạnh → lấy lớp dịch trong bay hơi và hòa tan cắn trong

- Mẫu lỏng: chiết mẫu với ethyl acetat → bay hơi trên cách thủy → hòa tan cắn trong MeOH

TLC 5g chế phẩm được chiết với

MeOH → Đặt trên cách thủy → làm lạnh trong nước đá 1 giờ → Lọc, bốc hơi cách thủy tới khô → Hòa lại cắn trong 5 ml MeOH

HPLC Mẫu được chiết với HH dicloromethan-MeOH (9:1)

→ đặt trên cách thủy ấm → làm lạnh trong nước đá →

Bốc hơi đến khô → Hòa tan cắn trong HH ACN-MeOH-

LC-MS Mẫu được phân tán trong

THF → lắc siêu âm → pha loãng với HH acid formic

Mẫu được chiết với ACN 0,1-10 1,4-2,4

Mẫu được chiết với ACN → ly tâm → lọc

1 g mẫu được chiết với 20 ml MeOH có chứa 1 ml acid formic 0,1 %, lắc siêu âm

30 phút → ly tâm ở 2000 vòng trong 10 phút → lọc

Phương pháp TLC (Thin Layer Chromatography) là một kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp, và dễ dàng so sánh kết quả trên cùng một bản mỏng Tuy nhiên, độ đặc hiệu của phương pháp này còn hạn chế, và giới hạn phát hiện thường cao Để khẳng định kết quả, cần tiến hành thử nghiệm trên nhiều hệ dung môi khác nhau với các phương pháp phát hiện khác nhau Do đó, TLC thường chỉ được sử dụng cho việc sàng lọc sơ bộ và kiểm tra nhanh.

Phương pháp HPLC có độ đặc hiệu cao hơn so với PP TLC, nhưng vẫn gặp phải hạn chế về thời gian phân tích kéo dài, cũng như giới hạn phát hiện và định lượng còn tương đối cao.

Việc định lượng các chất cấm trong mỹ phẩm gặp nhiều khó khăn do chúng thường xuất hiện với hàm lượng nhỏ Hơn nữa, cấu trúc phức tạp của mẫu mỹ phẩm làm cho quá trình tách các chất ra khỏi nền mẫu trở nên thách thức.

Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm với giới hạn phát hiện và định lượng thấp, khoảng tuyến tính rộng, và khả năng cung cấp thông tin cấu trúc các chất, rất phù hợp cho việc phân tích các chất cấm trong mỹ phẩm Tuy nhiên, thời gian phân tích của phương pháp này theo nghiên cứu của Fiori, Nam Sook Kim, và Yun Sik Nam còn tương đối dài.

TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là một phương pháp phân tích tiên tiến, kết hợp khả năng tách biệt các chất của hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với khả năng phân tích khối lượng Kỹ thuật này cho phép xác định và định lượng các hợp chất trong mẫu một cách chính xác và hiệu quả.

Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với đầu dò khối phổ ba tứ cực và bộ ion hóa kiểu phun điện (ESI) trong LC-MS mang lại độ đặc hiệu và độ nhạy cao, cho phép phân tích chính xác các hợp chất.

Sơ đồ khối của một máy khối phổ được miêu tả như trong hình 1.2

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ

Bộ phận nạp mẫu trong thiết bị khối phổ sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa Đối với LC-MS, mẫu được nạp vào máy khối phổ một cách gián tiếp thông qua hệ thống HPLC.

1.3.2 Nguồn ion hóa kiểu phun sương điện (ESI – Electro spray ionization)

Nguồn ion hóa là nơi chuyển đổi các hoạt chất thành ion ở pha khí thông qua kỹ thuật ion hóa như phun sương điện (ESI) Tại đầu ống dẫn mao quản, dưới điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện Nhiệt năng từ khí và môi trường làm bay hơi dung môi, tăng mật độ điện tích trên bề mặt hạt sương Khi mật độ điện tích đạt đến giới hạn ổn định Rayleigh, lực đẩy vượt qua sức căng bề mặt, chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn Quá trình này lặp lại, tạo ra các hạt rất nhỏ chứa tiểu phân mang điện Các ion phân tích từ những hạt này được chuyển vào thể khí và đi vào bộ phận phân tích khối, trong khi các tiểu phân không ion hóa bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không.

1.3.3 Bộ phận phân tích khối ghép nối ba tứ cực

Bộ phân tích khối sẽ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng loại riêng biệt nhờ tác dụng của điện trường

Liquid chromatograph Mass Detector analyser Ion source

Bộ phận phân tích khối kiểu ghép nối ba tứ cực bao gồm ba tứ cực Q1, Q2 và Q3 được nối tiếp Mỗi tứ cực được cấu tạo từ bốn thanh kim loại đặt song song và gần nhau, tạo thành hai cặp điện cực.

Hình 1.3 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối ghép nối ba tứ cực

Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được áp dụng vào các cặp đối diện của tứ cực, tạo ra một điện trường trong lòng ống điện cực Dưới tác động của điện trường này, các ion với số khối khác nhau di chuyển với tốc độ và quỹ đạo khác nhau; ion có số khối nhỏ di chuyển nhanh hơn so với ion có số khối lớn.

Các hợp chất có cấu trúc khác nhau sẽ tạo ra tỷ số m/z khác nhau cho ion mẹ, cùng với các cơ chế phân mảnh và hình thành ion con với số khối đa dạng Do đó, phương pháp LC-MS/MS có thể được sử dụng để định tính và định lượng các hoạt chất cần phân tích.

1.3.4 Bộ phận phát hiện (detector)

Sau khi rời khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được chuyển đến bộ phận phát hiện ion ở cuối thiết bị khối phổ Tại đây, tín hiệu của các ion sẽ được phát hiện và khuếch đại theo số lượng Tín hiệu này sau đó được gửi đến máy tính, tạo ra hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ.

TỔNG QUAN THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHẤT CẤM

Thẩm định phương pháp là yếu tố thiết yếu trong phân tích, đặc biệt là trong lĩnh vực mỹ phẩm Mục tiêu của việc thẩm định là đảm bảo rằng phương pháp được sử dụng có độ đặc hiệu, độ tin cậy và khả năng lặp lại cao, nhằm phục vụ cho việc phân tích các mẫu thực tế một cách chính xác.

Theo hướng dẫn của USFDA [25] các chỉ tiêu tối thiểu cần thực hiện khi thẩm định phương pháp phân tích chất cấm trong mỹ phẩm gồm: Độ đặc hiệu -

13 chọn lọc, giới hạn phát hiện, xác định tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả và khẳng định định tính (confirmation of identity)

1.4.1 Tính đặc hiệu - chọn lọc

Tính đặc hiệu - chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt chất phân tích với các thành phần khác trong mẫu Trong phân tích định tính, cần chứng minh kết quả dương tính khi có mặt chất phân tích và âm tính khi không có, đồng thời cũng phải âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc tương tự Đối với phân tích định lượng, tính đặc hiệu đảm bảo xác định chính xác chất phân tích trong mẫu, bất chấp sự ảnh hưởng của các yếu tố khác, nhằm đạt được kết quả chính xác nhất.

+ Phân tích mẫu trắng (mẫu placebo), lặp lại tối thiểu 6 lần Mẫu trắng phải không có tín hiệu của chất phân tích

+ Phân tích mẫu tự tạo ở nồng độ/hàm lượng gần LOQ, lặp lại tối thiểu 6 lần

So sánh với mẫu placebo, phải cho tín hiệu của chất phân tích

+ Phân tích mẫu chuẩn, các chất phân tích phải được nhận diện rõ ràng và không bị ảnh hưởng bởi các chất khác

- Với phương pháp LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật MRM, độ chọn lọc đạt yêu cầu khi:

+ Có 2 ion con đặc trưng và tỷ lệ cường độ tuyệt đối so với mẫu chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện không chênh lệch quá 10 % [24]

+ Hoặc ít nhất 3 ion con đặc trưng và tỷ lệ cường độ ion tuyệt đối so với mẫu chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện không chênh lệch quá 20 % [24]

1.4.2 Giới hạn phát hiện (LOD)

- Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được

- Để xác định LOD, có thể thực hiện theo nhiều cách:

Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N), việc phân tích mẫu chuẩn hoặc mẫu tự tạo ở các nồng độ khác nhau là rất quan trọng Điều này giúp xác định tỷ lệ giữa tín hiệu chiều cao pic, từ đó nâng cao độ chính xác trong các kết quả phân tích.

Để xác định nồng độ chất cần phân tích, cần xem xét 14 chất và cường độ nhiễu nền tại khu vực lân cận Khi tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) đạt khoảng 3, nồng độ chất đó được coi là giới hạn phát hiện (LOD) [9].

+ Dựa trên đường chuẩn: LOD được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo [9]

Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu a: Độ dốc của đường chuẩn

1.4.3 Giới hạn định lƣợng (LOQ)

LOQ (Limit of Quantitation) là nồng độ tối thiểu của một chất có thể được định lượng trong mẫu thử thông qua phương pháp khảo sát, đảm bảo kết quả đạt độ chính xác mong muốn.

- LOQ cũng có thể xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu, dựa vào đường chuẩn hoặc dựa vào công thức: LOQ = 3,3 x LOD

1.4.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ mà tại đó tín hiệu đo được có mối quan hệ tuyến tính với nồng độ của chất phân tích Để xác định khoảng tuyến tính, cần ít nhất 6 nồng độ khác nhau, bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc ở giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất).

Đường chuẩn là biểu thức thể hiện mối quan hệ giữa tín hiệu đo từ thiết bị và nồng độ của chất phân tích trong mẫu Để xây dựng đường chuẩn, có thể sử dụng chuẩn tinh khiết, mẫu placebo kèm theo chuẩn, hoặc mẫu thử kết hợp với chuẩn.

- Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:

+ Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ r ≤ 1

Độ chệch của các điểm nồng độ sử dụng để xây dựng đường chuẩn không được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, trong khi đối với nồng độ LOQ, giới hạn có thể chấp nhận là ± 20% Các giá trị độ chệch được tính theo công thức quy định.

Trong đó: ∆i: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

C t : Nồng độ xác định được từ đường chuẩn của các điểm chuẩn

C c : Nồng độ lý thuyết của các điểm chuẩn

1.4.5 Độ chính xác Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ chính xác trung gian

Độ lặp lại được xác định bằng cách phân tích tại ít nhất 3 nồng độ khác nhau, với mỗi nồng độ thực hiện ít nhất 6 lần lặp lại nếu sử dụng 1 nền mẫu, và ít nhất 2 lần nếu sử dụng 3 nền mẫu Giá trị RSD của các kết quả phân tích cần phải đáp ứng yêu cầu của USFDA.

- Độ chính xác trung gian được tiến hành tương tự độ lặp lại nhưng khác ngày và khác kiểm nghiệm viên

1.4.6 Độ đúng Độ đúng có thể được đánh giá qua việc xác định qua độ thu hồi, bằng cách thêm chuẩn vào nền mẫu không chứa chất phân tích ở ít nhất 3 mức nồng độ là mức thấp, mức trung bình và mức cao (tương ứng với 0,5 lần, 1 lần và 2 lần giới hạn cho phép), làm lặp lại 6 lần, tính độ thu hồi theo công thức:

R (%) = C tt /C c x 100 Trong đó: R (%): Độ thu hồi, %

Cc: Nồng độ chuẩn thêm vào (lý thuyết)

C tt : Nồng độ chất phân tích trong mẫu nền thêm chuẩn (thực tế) Kết quả độ thu hồi phải đạt yêu cầu của USFDA [25]

1.4.7 Xác định tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả

Theo hướng dẫn của USFDA, việc phân tích định tính yêu cầu xác định tỷ lệ dương tính giả (FP) và âm tính giả (FN) của phương pháp Để xác định tỷ lệ FP, cần kiểm tra sự có mặt của các chất phân tích trong các mẫu đã được xác nhận là âm tính Ngược lại, để xác định tỷ lệ FN, cần kiểm tra sự không có mặt của các chất phân tích trong các mẫu đã được xác nhận là dương tính.

+ Xác định tỷ lệ FP: tiến hành phân tích các mẫu không chứa chất phân tích cần nghiên cứu (các mẫu nền - mẫu âm tính)

+ Xác định tỷ lệ FN: tiến hành phân tích các mẫu tự tạo ở nồng độ LOD (mẫu dương tính)

Số lượng mẫu cần phân tích phụ thuộc vào độ tin cậy và tỷ lệ FP, FN cần đạt

Bảng 1.5 Số lượng mẫu cần phân tích để xác định FP, FN Độ tin cậy

Tỷ lệ FP hoặc FN 80 % 90 % 95 % 99 %

Để đạt được tỷ lệ dương tính giả (FP) và âm tính giả (FN) với độ tin cậy như trong bảng 1.5, tất cả các mẫu xác định tỷ lệ FP cần phải cho kết quả âm tính, trong khi tất cả các mẫu xác định tỷ lệ FN phải cho kết quả dương tính [25].

1.4.8 Khẳng định định tính Để khẳng định định tính, cần phân tích đặc điểm đặc trưng và cung cấp được thông tin cấu trúc hóa học của chất phân tích trong phạm vi của phương pháp [14],

Với phương pháp LC-MS/MS, USFDA [25] đưa ra hướng dẫn để khẳng định định tính các chất như sau:

Trong sắc ký, yêu cầu tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) phải đạt tối thiểu 3:1, đồng thời thời gian lưu của pic từ mẫu thử không được chênh lệch quá 5% so với pic từ mẫu chuẩn.

Kỹ thuật full scan yêu cầu phổ khối phải có tối thiểu 3 ion đặc trưng, và phổ thu được cần phải tương thích với phổ của chất chuẩn trong cùng điều kiện.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Mẫu nền là các sản phẩm kem mỹ phẩm không chứa các thành phần GC cần nghiên cứu, được phát triển bởi khoa Nghiên cứu và Phát triển của viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương Công thức bào chế các mẫu nền này dựa trên công thức của ba mẫu kem đã được xác định trước đó.

+ Kem dưỡng ẩm Cetaphil moisturizing cream

+ Kem dưỡng trắng và giảm nếp nhăn Rebirth

+ Kem dưỡng trắng và giảm thâm nám ban đêm Za true white ex night cream

- Mẫu tự tạo: là mẫu nền có chứa chuẩn GC bằng cách thêm các chuẩn này vào mẫu nền với các nồng độ khác nhau

- Chế phẩm thử: Một số mẫu mỹ phẩm có mặt trên thị trường (Thông tin chi tiết được thể hiện ở phụ lục 1).

NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất

- Chất chuẩn: Thông tin các chất chuẩn sử dụng trong quá trình nghiên cứu được thể hiện ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Th ng tin chất chuẩn sử dụng

Tên chất chuẩn Nguồn gốc Số lô Hàm lƣợng

PRS VKNTTW WS.0217235.02 99,19 (nguyên trạng)

DXM VKNTTW WS.0217025.02 99,59 (nguyên trạng)

TAA VKNTTW WS.0116086.01 98,35 (nguyên trạng)

CBP VKNTTW WS.0212170.02 (07.12) 99,60 (nguyên trạng)

MTF USP IOL395 99,7 (nguyên trạng)

- Dung môi, hóa chất: Methanol (Merck), acetonitril (Merck), acid formic (Fisher), amoniacetat (Fisher), nước RO đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC và LC-MS

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích

Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Xevo TQD được trang bị khối phổ kiểu ghép nối ba tứ cực, kết hợp với nguồn ion hóa kiểu phun sương điện tử ESI của Water.

- Cân phân tích Mettler Toledo MS 105 (d = 0,01 mg)

- Máy li tâm Sigma 4 – 16 KS

- Máy lắc xoáy IKA MS3 basic

- Bình định mức, pipet thủy tinh class A,…

Tại khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, tất cả thiết bị phân tích đều được kiểm tra và hiệu chuẩn định kỳ, đảm bảo tuân thủ các tiêu chuẩn GLP và ISO/IEC 17025.

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

2.3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định các GC nghiên cứu và chuẩn nội

Sử dụng hệ thống LC – MS/MS với nguồn ion hóa kiểu ESI, tiến hành thực nghiệm như sau:

- Tối ưu hóa điều kiện cho Betamethason valerat (BMV):

Tiêm dung dịch chuẩn BMV vào hỗn hợp MeOH:H2O (9:1) với nồng độ khoảng 1 µg/mL vào nguồn ESI của thiết bị Tiến hành phân tích phổ khối lượng bằng chế độ quét toàn phổ và quét chọn lọc ion để xác định mảnh phổ tương ứng với ion ban đầu của BMV.

Sau khi xác định số khối của ion mẹ, cần tối ưu hóa các điều kiện nguồn ion hóa như điện thế, nhiệt độ, và tốc độ khí nitơ cung cấp cho nguồn ion nhằm bay hơi dung môi pha động trong sắc ký Đồng thời, điện thế của bộ phận tập trung dòng ion cũng cần được điều chỉnh để cải thiện quá trình ion hóa BMV tại nguồn ESI.

Dựa trên kết quả khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn các điều kiện của nguồn ESI nhằm tối ưu hóa việc đưa ion mẹ vào bộ phận phân tích khối với cường độ tín hiệu cao và ổn định Nghiên cứu quá trình phân mảnh ion mẹ ở tứ cực thứ hai của thiết bị MS với các mức năng lượng khác nhau, từ thấp đến cao, giúp xác định cơ chế phân mảnh ban đầu, số khối của các ion tạo thành, cũng như số khối của ion con đặc trưng cho quá trình phân mảnh Những thông tin này sẽ hỗ trợ trong việc định tính và định lượng BMV trong phương pháp phân tích, đồng thời xác định mức năng lượng tối ưu cho quá trình phân mảnh ion mẹ.

- Tối ưu hóa điều kiện khối phổ cho các GC còn lại: Tiến hành tương tự như tối ưu hóa điều kiện khối phổ BMV

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa các GC cần nghiên cứu trong tỷ lệ MeOH : H2O (9:1) Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên các cột C18 hoặc C8 với kích thước 100 x 2,1 mm; 1,7 µm, 50 x 2,1 mm; 1,7 µm và 150 x 4,6 mm; 5 µm từ các hãng khác nhau Sử dụng các hệ pha động gồm dung môi hữu cơ (ACN hoặc MeOH) kết hợp với dung dịch đệm (acid formic 0,001%; amoni format 2 mM) theo các tỷ lệ khác nhau, cùng với các chương trình rửa giải khác nhau như đẳng dòng hoặc gradient.

2.3.1.3 Khảo sát dung m i pha mẫu

Dựa trên tính chất hóa lý của hoạt chất cần phân tích và các tài liệu tham khảo, việc khảo sát dung môi pha mẫu được thực hiện với các lựa chọn như MeOH, hỗn hợp MeOH:H2O với tỷ lệ 9:1 hoặc 1:1, và ACN.

Kết quả khảo sát cho thấy việc lựa chọn dung môi pha mẫu là rất quan trọng, giúp chiết xuất các hợp chất GC với độ thu hồi cao và ổn định, đồng thời không gây ảnh hưởng đến nền mẫu trong quá trình phân tích.

2.3.1.4 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội

Để lựa chọn chuẩn nội cho phương pháp phân tích, cần dựa vào cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của các chất Chuẩn nội phải đảm bảo tính bền vững và có khả năng tham gia vào quá trình chiết tách và phân tích sắc ký Các chất chuẩn nội được dự kiến lựa chọn bao gồm glibenclamid, telmisartan, cloramphenicol và pyridoxin hydrochlorid.

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích các chất cấm nhóm GC bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng dẫn của USFDA về thẩm định phương pháp phân tích trong mỹ phẩm Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm độ đặc hiệu và chọn lọc, giới hạn phát hiện và định lượng, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, độ chính xác trung gian, cùng tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả.

Tiến hành thẩm định trên các mẫu chuẩn được pha trong dung dịch nền của mỹ phẩm và các mẫu tự tạo chứa chuẩn GC với nồng độ phù hợp Các mẫu để thẩm định được chuẩn bị một cách cẩn thận nhằm đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả.

Cân khoảng 5 g nền mẫu vào cốc có mỏ 100 ml, thêm khoảng 50 ml DMPM dùng đũa thủy tinh phân tán đều kem trong cốc, đặt trên cách thủy ở 50 - 60 0 C trong

Sau 10 phút khuấy đều, chuyển hỗn hợp vào bình định mức 500 ml và tráng rửa cốc bằng DMPM Để hỗn hợp nguội, sau đó thêm DMPM cho đến vạch định mức, lắc đều và đặt vào nước đá để làm lạnh.

30 phút, ly tâm ở 10000 vòng trong 10 phút, hút lấy lớp dịch trong

Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn vào bình định mức 100 ml, sau đó hòa tan và điều chỉnh thể tích bằng MeOH Tiếp theo, hút chính xác 0,1 ml dung dịch đã pha vào bình định mức.

100 ml, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ 100 ng/ml

Cân chính xác khoảng 25,0 mg mỗi chất chuẩn GC vào mỗi bình định mức

To prepare stock standard solutions for each GC in methanol (MeOH) with a concentration of approximately 100 µg/ml, dissolve 250 ml of the compound and add the appropriate amount of MeOH From these stock solutions, dilute with methanol to achieve a mixed stock solution containing the following concentrations: cortisone acetate at 200 ng/ml, betamethasone valerate at 300 ng/ml, betamethasone dipropionate at 400 ng/ml, clobetasol propionate at 600 ng/ml, and prednisolone, dexamethasone, prednisolone acetate, hydrocortisone acetate, triamcinolone acetonide, and fluocinolone acetonide at 1000 ng/ml, with dexamethasone acetate at 1500 ng/ml and mometasone furoate at 3000 ng/ml.

Pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc trong dung dịch nền mẫu có chứa chuẩn nội để thu được đường chuẩn theo bảng 2.2

Bảng 2.2 Nồng độ dãy đường chuẩn của các GC

Hoạt chất Mẫu (ng/ml)

- Chuẩn bị các mẫu tự tạo để thẩm định độ đúng và độ lặp lại:

Các mẫu tự tạo được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc, không phụ thuộc vào mẫu chuẩn Quá trình chuẩn bị các mẫu tự tạo được thực hiện ở ba nồng độ khác nhau: nồng độ thấp (LOQ), nồng độ trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC).

+ Mẫu tự tạo LOQ: Cân khoảng 0,2 g nền mẫu vào cốc có mỏ 20 ml; thêm 0,1 ml dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc và 1,0 ml dung dịch chuẩn nội gốc

+ Mẫu tự tạo MQC: Cân khoảng 0,2 g nền mẫu vào cốc có mỏ 20 ml; thêm 1,0 ml dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc và 1,0 ml dung dịch chuẩn nội gốc

+ Mẫu tự tạo HQC: Cân khoảng 0,2 g nền mẫu vào cốc có mỏ 20 ml; thêm 2,0 ml dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc và 1,0 ml dung dịch chuẩn nội gốc

- Chuẩn bị các mẫu để xác định tỷ lệ dương tính giả (FP), âm tính giả (FN):

+ Mẫu xác định FP: là các mẫu nền (mẫu âm tính)

+ Mẫu xác định FN: Cân khoảng 0,2 g nền mẫu vào cốc có mỏ 20 ml; thêm

40 àl dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc (mẫu dương tớnh)

2.3.3.1 Độ đặc hiệu/chọn lọc

- Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu nền, mẫu chuẩn và mẫu tự tạo ở nồng độ gần LOQ

Mẫu trắng và mẫu nền cần phải không có tín hiệu của chất phân tích Mẫu tự tạo phải thể hiện tín hiệu rõ ràng của chất phân tích, bao gồm giá trị thời gian lưu, số ion mẹ và ion con Tỷ lệ cường độ ion trong mẫu tự tạo cần phải tương ứng với mẫu chuẩn được thực hiện trong cùng điều kiện.

2.3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Phân tích mẫu chuẩn trong nền mẫu với nồng độ giảm dần cho phép xác định giá trị LOD tại nồng độ có tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) tối thiểu là 3, trong khi giá trị LOQ được xác định tại nồng độ có S/N tối thiểu là 10.

2.3.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính của 12 GC với nồng độ thấp nhất là LOQ, nồng độ cao nhất khoảng 10 – 20 lần LOQ

- Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:

+ Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ r ≤ 1

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định các GC

3.1.1.1 Điều kiện khối phổ cho BMV

* Ion hóa BMV và phổ khối MS:

Phân tích phổ khối trên thiết bị LC-MS/MS với chế độ phân tích khối 1 lần cho thấy, khi sử dụng kỹ thuật ghi toàn phổ tại tứ cực Q1, dung dịch chuẩn BMV 1 àg/ml ở chế độ ESI (+) xuất hiện vạch phổ với tỷ số m/z = 477,24, phù hợp với cấu trúc phân tử BMV ([BMV+H]+) Ngược lại, ở chế độ ESI (-), vạch phổ có tỷ số m/z = 475,15 tương ứng với ion BMV mất một proton ([BMV-H]-) Tuy nhiên, tín hiệu ở chế độ ESI (+) mạnh và ổn định hơn, do đó mảnh khối m/z = 477,24 được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.

Hình 3.1.Phổ khối MS dung dịch chuẩn BMV với chế độ ESI (+)

BETAMETHASON VALERAT1 SCAN 1 1617 (3.233) MS2 ES+

Tiến hành tối ưu hóa điện thế tập trung ion (Cone voltage), để các ion

Ion [BMV+H]+ được hình thành tại nguồn ESI và tập trung trước khi vào bộ phận phân tích khối với số lượng lớn trong thời gian ngắn Giản đồ mối quan hệ giữa điện thế tập trung ion và tỷ lệ tương đối số lượng ion có số khối 477,24 Da cho thấy rằng tại mức điện thế 24 V, các ion [BMV+H]+ có sự gia tăng đáng kể trong bộ phận phân tích khối.

“tập trung” đi vào bộ phận phân tích khối là tối ưu nhất

Hình 3.2 Giản đồ tối ưu điện thế tập trung ion có số khối 477,24 Da

Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ:

Khảo sát đã được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của điện thế, nhiệt độ và tốc độ khí nitơ cung cấp tại nguồn ESI, theo các nội dung đã trình bày ở mục 2.3.1.1 Kết quả khảo sát cho thấy những yếu tố này có tác động đáng kể đến quá trình nghiên cứu.

Khi điện thế đầu phun vượt quá 3 kV, cường độ vạch phổ 477,24 Da gia tăng, nhưng đồng thời nhiễu đường nền cũng tăng theo Hiện tượng này có thể do sự gia tăng số lượng phần tử tích điện, bao gồm cả BMV và tạp chất, dẫn đến dòng ion mẹ vào bộ phận phân tích khối tăng lên Ngược lại, khi điện thế dưới 2,5 kV, cường độ vạch phổ 477,24 Da giảm, làm giảm độ nhạy của phương pháp phân tích.

Khi tăng nhiệt độ đầu phun, cường độ tín hiệu cũng tăng theo, và ngược lại Tuy nhiên, nếu nhiệt độ vượt quá 500 độ C hoặc giảm xuống dưới 300 độ C, cường độ tín hiệu sẽ bị ảnh hưởng.

26 hiệu thu được đều thấp và không ổn định

Khi tốc độ dòng khí hóa hơi dưới 900 l/h, hiện tượng ngưng tụ hơi nước ở đầu phun dẫn đến cường độ tín hiệu thấp và không ổn định Tăng áp suất dòng khí giúp giảm hiện tượng ngưng tụ và tăng cường độ tín hiệu Tuy nhiên, khi tốc độ dòng khí vượt quá 900 l/h, cường độ tín hiệu của ion mẹ giảm do một phần ion mẹ bị thổi qua đường thải cùng với dung môi pha động, làm giảm lượng ion mẹ vào bộ phận phân tích khối.

Các thông số tối ưu của nguồn ESI (+) cho phân tích BMV được xác định từ kết quả thực nghiệm bao gồm: điện thế đầu phun 2,75 kV, nhiệt độ đầu phun 500 °C và tốc độ khí hóa hơi 900 l/h.

* Phân mảnh ion ban đầu và phổ khối MS/MS của BMV

Sau khi phân mảnh ion mẹ, phân tích khối lần thứ hai được thực hiện tại tứ cực Q3 bằng chế độ ghi toàn phổ MS/MS, nhằm xác định số khối của các ion con được tạo thành.

Hình 3.3 Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [BMV + H] +

Trên phổ đồ phân mảnh ion [BMV+H] + (hình 3.3) trong số các ion con tạo thành, hai ion có tỷ số m/z = 355,14 và 337,13 có cường độ cao nhất, ổn định, lặp

Quá trình phân mảnh BMV được đặc trưng bởi các ion với tỷ số m/z cụ thể Vạch phổ 355,14 tương ứng với cấu trúc ion mẹ [BMV+ H]+, trong khi ion con có m/z = 337,13 được hình thành từ việc mất một phân tử H2O Các cặp ion m/z = 477,24 - 355,14 và 477,24 - 337,13 đã được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo Sự hình thành các ion con từ ion ban đầu m/z = 477,24 phụ thuộc vào mức năng lượng cung cấp trong quá trình phân mảnh.

Hình 3.4 Giản đồ năng lượng phân mảnh ion m/z 477,24 → 355,14

Hình 3.5 Giản đồ năng lượng phân mảnh ion m/z 477,24 → 337,13

Hình 3.4 và 3.5 thể hiện sự phụ thuộc giữa số lượng ion m/z = 355,14 và m/z = 337,13 với mức năng lượng phân mảnh từ ion [BMV+H] + ban đầu Kết quả cho thấy mức năng lượng tối ưu để phân mảnh ion [BMV+H] + thành ion con có số khối 355,14 và 337,13 Da là 10 V Trong hai ion con này, ion m/z = 355,14 có cường độ cao và ổn định hơn, do đó được chọn làm ion định lượng.

Kết quả thực nghiệm cho thấy điều kiện khối phổ MS/MS để phân tích BMV bao gồm các cặp ion đặc trưng với số khối 477,24 Da (ion mẹ), 355,14 Da và 337,13 Da (các ion con) Điện thế tập trung ion mẹ được thiết lập ở mức 24 V, trong khi năng lượng phân mảnh ion mẹ là 10 V.

3.1.1.2 Điều kiện khối phổ cho các GC còn lại

Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ của các GC còn lại tương tự như BMV thu được kết quả như bảng 3.2, mục 3.1.5

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

- Khảo sỏt trờn cỏc cột Sunfire C18 (125 mm x 2,1 mm; 3,5 àm), Phenomenex C18 (150 mm x 4,6 mm; 5 àm), Acquity UPLC BEH C18 hoặc C8

Cột Acquity UPLC BEH C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,7 àm) cho kết quả pic cõn đối và pic cao hơn, đồng thời thời gian phân tích cũng phù hợp hơn so với các cột khác, như thể hiện trong hình 3.6 và hình 3.7.

Khảo sát hệ pha động bao gồm dung môi hữu cơ (ACN hoặc MeOH) và dung dịch đệm (acid formic 0,1%, amoni format 2mM hoặc amoni acetat 10 mM) cho thấy hệ pha động MeOH và acid formic 0,1% tạo ra pic GC có hình dáng cân đối hơn Khi thay đổi tỷ lệ MeOH và acid formic 0,1%, ở chế độ đẳng dòng, tỷ lệ 75:25 cho tín hiệu cao nhưng pic không cân đối; tỷ lệ 70:30 cho pic rửa giải muộn; và tỷ lệ 72:28 cho hình dáng cân đối nhưng cường độ tín hiệu thấp Trong khi đó, chế độ gradient mang lại pic có hình dáng cân đối và cường độ tín hiệu cao hơn so với chế độ đẳng dòng Do đó, chương trình gradient được chọn để tiếp tục nghiên cứu.

Hình 3.6 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C 8 (2,1 x 100 mm,

1,7 àm), pha động MeOH : acid formic 0,1 % (70:30)

Hình 3.7 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C 18 (2,1 x 50 mm,

1,7 àm), pha động MeOH : acid formic 0,1 % (70:30)

Hình 3.8 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng pha động MeOH : acid formic 0,1 % (72:28)

Hình 3.9 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng chương trình gradient

Trong quá trình khảo sát tốc độ dòng của chương trình pha động và cột sắc ký đã chọn, nhận thấy rằng khi tốc độ dòng nhỏ hơn 0,2 ml/phút, thời gian lưu của các pic lớn và thời gian phân tích một mẫu kéo dài hơn 15 phút Ngược lại, khi tốc độ dòng lớn hơn 0,2 ml/phút, áp suất của cột tăng cao Tại tốc độ 0,2 ml/phút, các pic GC có hình dạng cân đối và thời gian phân tích chỉ còn 10 phút, phù hợp cho việc phân tích đồng thời 12 GC trong mỹ phẩm.

3.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Dựa trên các đặc điểm lý hóa của các GC và nền mẫu mỹ phẩm, cùng với việc tham khảo tài liệu, chúng tôi đã tiến hành khảo sát để lựa chọn dung môi và quy trình xử lý mẫu phù hợp.

KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.2.1 Sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn S4 theo bảng 2.2, mục 2.3.2 Ghi nhận SKĐ và xác định các thông số đặc trưng cho từng pic, bao gồm tỷ lệ diện tích giữa các pic hoạt chất so với pic chuẩn nội và tỷ lệ diện tích của hai ion con.

Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống sắc ký được trình bày trong bảng 3.4 (Kết quả chi tiết được trình bày ở phụ lục 2)

Bảng 3.4 Sự phù hợp hệ thống LC-MS/MS

Diện tích pic ion con 1 (RSD (%), n=6)

Diện tích pic ion con 2 (RSD (%), n=6)

Tỷ lệ diện tích pic (RSD (%), n=6)

Tỷ lệ cường độ ion (TB ± SD, n = 6)

Kết quả nghiên cứu cho thấy hệ thống LC-MS/MS có độ ổn định cao, với thời gian lưu, diện tích pic, tỷ lệ diện tích và tỷ lệ ion của tất cả các chất đều có mức độ lặp lại tốt (RSD < 6%) Điều này chứng tỏ rằng hệ thống này phù hợp cho việc định tính và định lượng đồng thời 12 GC trong mỹ phẩm.

3.2.2 Độ đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp

Tiến hành phân tích 6 lần mẫu trắng, mẫu nền, mẫu chuẩn và mẫu tự tạo được chuẩn bị theo hướng dẫn trong mục 2.3.2 Mẫu chuẩn và mẫu tự tạo có nồng độ các chất như sau: CTA khoảng 1 ng/ml, BMV khoảng 1,5 ng/ml, BMD khoảng 2 ng/ml, CBP 3 ng/ml, PRS, DXM, PRA, HCTA, TAA và FLA khoảng 5 ng/ml, DXA khoảng 7,5 ng/ml, và MTF khoảng 15 ng/ml.

Ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng pic, tỷ lệ cường độ ion, ảnh hưởng của mẫu trắng và nền mẫu đến kết quả phân tích

- Thời gian lưu của pic:

Kết quả thực nghiệm cho thấy, sắc ký đồ của mẫu tự tạo cho phép nhận diện rõ ràng các pic, với thời gian lưu tương ứng với các chất thu được từ mẫu chuẩn, như được thể hiện trong bảng 3.5.

Bảng 3.5 So sánh thời gian lưu của pic thu được từ mẫu tự tạo và mẫu chuẩn

Thời gian lưu- Mẫu tự tạo (phút) (TB ± SD) (n=6)

Khoảng giá trị thời gian lưu cho phép (phút)

Chênh lệch thời gian lưu cho phép [25]

- Số ion theo dõi MRM và tỷ lệ cường độ ion của các chất:

Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng các ion theo dõi MRM của từng chất trên SKĐ mẫu tự tạo đều tạo ra tín hiệu rõ ràng, tương ứng với mẫu chuẩn.

+ Tỷ lệ cường độ ion con thu được từ mẫu tự tạo so với mẫu chuẩn đạt yêu cầu của FDA Kết quả thể hiện ở bảng 3.6

Bảng 3.6 Tỷ lệ cường độ ion của các pic thu được từ mẫu tự tạo và mẫu chuẩn

Tỷ lệ cường độ ion-

Tỷ lệ cường độ ion - Mẫu tự tạo (TB ± SD) (n=6)

Khoảng giá trị tỷ lệ cường độ ion cho phép (so với giá trị TB trên mẫu chuẩn)

- Ảnh hưởng của mẫu trắng và nền mẫu:

Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng trên sắc ký đồ nền mẫu, tại các thời điểm trùng với thời gian lưu của các pic GC và pic IS trong các mẫu chuẩn, không xuất hiện các pic có mảnh phổ khối của 12 GC nghiên cứu Trong khi đó, trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu tự tạo, các pic GC được nhận diện rõ ràng.

Như vậy, phương pháp đặc hiệu và chọn lọc đối với 12 GC cần nghiên cứu

Hình 3.11 SKĐ đại diện của độ đặc hiệu a)- SKĐ mẫu nền; b)- SKĐ mẫu chuẩn; c), d), e), f)- SKĐ mẫu tự tạo và mẫu nền của 1 số chất đại diện

BLANK 4-1 12: MRM of 1 Channel ES+

3.2.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng

Để xác định giá trị LOD và LOQ, mẫu chuẩn được pha trong dung dịch nền mẫu với các nồng độ giảm dần Giá trị LOD được xác định khi tỷ lệ giữa tín hiệu chiều cao pic của các chất và cường độ nhiễu nền tại lân cận pic đạt ít nhất bằng 3 Trong khi đó, giá trị LOQ được xác định tại nồng độ có tỷ lệ này đạt ít nhất bằng 10.

Giá trị LOD (giới hạn phát hiện) của các chất được xác định như sau: CTA là 0,4 ng/ml, BMV 0,6 ng/ml, BMD 0,8 ng/ml, CBP 1,2 ng/ml, PRS, DXM, PRA, HCTA, TAA và FLA đều là 2,0 ng/ml, DXA 3,1 ng/ml, và MTF 6,0 ng/ml.

Giá trị LOQ (Limit of Quantitation) của các chất được xác định như sau: CTA là 1,1 ng/ml, BMV 1,5 ng/ml, BMD 2,0 ng/ml, CBP 3,1 ng/ml, trong khi PRS, DXM, PRA, HCTA, TAA và FLA có giá trị 5,0 ng/ml Ngoài ra, DXA có giá trị LOQ là 7,7 ng/ml và MTF là 15,1 ng/ml.

Giá trị S/N trên SKĐ của một số GC được thể hiện ở hình 3.12, hình 3.13

Hình 3.12 Giá trị S/N tại LOD của một số chất đại diện

LOD1-1 1: MRM of 2 Channels ES+

LOD-1 10: MRM of 2 Channels ES+

Hình 3.13 Giá trị S/N tại LOQ của một số chất đại diện 3.2.3.2 Thực nghiệm xác nhận sự phù hợp của giá trị LOD, LOQ

Tiến hành phân tích mẫu tự tạo ở nồng độ LOD, LOQ Ghi lại sắc ký đồ Kết quả phân tích mẫu ở LOD được trình ở bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả phân tích mẫu ở LOD

Tên chất Thời gian lưu (phút)

Diện tích pic ion 1 (counts)

Diện tích pic ion 2 (counts)

Tỷ lệ cường độ ion

LOQ-1 1: MRM of 2 Channels ES+

Kết quả phân tích các mẫu LOQ cho thấy, khi sử dụng đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện, độ thu hồi trung bình của hoạt chất dao động từ 84,1% đến 104,9%, nằm trong khoảng cho phép từ 80% đến 110% Độ chính xác được xác định với giá trị RSD ≤ 11%.

Từ các kết quả thực nghiệm, xác định được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp như bảng 3.8:

Bảng 3.8 LOD và LOQ của phương pháp

Giới hạn phát hiện Giới hạn định lƣợng Trong dung dịch

Trong dung dịch (ng/ml)

3.2.4 Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Tiến hành pha chế dãy dung dịch chuẩn với nồng độ các chất theo bảng 2.2 trong mục 2.3.2 Tiến hành phân tích theo quy trình đã thiết lập và xác định mối tương quan giữa nồng độ các chất trong mẫu và tỷ lệ diện tích pic thông qua phương pháp hồi quy tuyến tính.

Kết quả xác định mối tương quan tuyến tính được thể hiện trong bảng 3.9, bảng 3.10 và bảng 3.11

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát đường chuẩn của PRS, DXM, PRA, CTA

Nồng độ (ng/ml) Độ chệch (%)

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát đường chuẩn của HCTA, TAA, DXA, FLA

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát đường chuẩn của CBP, BMV, BMD, MTF

Kết quả thực nghiệm cho thấy có mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ các chất và tỷ lệ diện tích của các pic với hệ số tương quan lớn hơn 0,995 trong khoảng nồng độ khảo sát Nồng độ của 12 GC được xác định lại từ đường chuẩn so với giá trị lý thuyết đều nằm trong giới hạn cho phép, với sai số ± 15% cho tất cả các điểm của đường chuẩn và ± 20% tại nồng độ LOQ.

3.2.5 Độ đúng, độ lặp lại của phương pháp

Thẩm định độ đúng và độ lặp lại của phương pháp được thực hiện trên các mẫu tự tạo với ba mức nồng độ: thấp (LOQ), trung bình (MQC) và cao (HQC) Tại mỗi mức nồng độ, tiến hành phân tích 6 mẫu độc lập để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

Kết quả độ đúng, độ lặp lại được thể hiện trong bảng 3.12 (Kết quả chi tiết được trình bày ở phụ lục 3)

Bảng 3.12 Kết quả độ đúng, độ lặp lại của phương pháp

Mẫu LOQ (%) Mẫu MQC (%) Mẫu HQC (%)

Kết quả từ bảng 3.12 cho thấy, ở các khoảng nồng độ LOQ, trung bình và cao của các mẫu tự tạo, các phương pháp phân tích đều đạt độ đúng trong khoảng cho phép từ 80% đến 110% Đặc biệt, độ lặp lại của các phương pháp này cũng đáp ứng yêu cầu quy định của USFDA với giá trị RSD không vượt quá 11%.

3.2.6 Độ chính xác trung gian của phương pháp

Kết quả độ chính xác trung gian được thể hiện trong bảng 3.13 (kết quả chi tiết được trình bày ở phụ lục 4)

Bảng 3.13 Kết quả chính xác trung gian của phương pháp

Mẫu LOQ (%) Mẫu MQC (%) Mẫu HQC (%)

PRS 101,8 ± 9,7 9,5 100,0 ± 6,3 6,3 98,5 ± 3,4 3,4 DXM 96,9 ± 9,3 9,6 98,1 ± 5,4 5,5 97,9 ± 2,8 2,8 PRA 99,0 ± 9,8 9,9 99,9 ± 5,0 5,0 98,4 ± 3,5 3,5 CTA 92,6 ± 8,4 9,1 98,2 ± 3,9 4,0 98,4 ± 2,9 2,9 HCTA 103,1 ± 10,1 9,8 99,1 ± 5,2 5,2 96,3 ± 3,1 3,2 TAA 101,6 ± 9,1 8,9 97,4 ± 4,4 4,5 96,8 ± 3,0 3,1 DXA 103,4 ± 10,2 9,9 98,1 ± 3,3 3,4 99,2 ± 3,4 3,4 FLA 96,0 ± 7,4 7,7 99,4 ± 6,3 6,3 100,3 ± 3,2 3,2 CBP 91,8 ± 8,2 9,0 98,5 ± 4,0 4,0 101,1 ± 3,2 3,1 BMV 105,0 ± 8,0 7,6 97,4 ± 4,0 4,1 98,8 ± 2,5 2,6 BMD 92,0 ± 9,7 10,5 97,5 ± 4,3 4,5 98,9 ± 2,8 2,8 MTF 89,7 ± 8,7 9,7 101,8 ± 5,8 5,7 104,2 ± 3,8 3,7

Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy ở các khoảng nồng độ thấp, trung bình và cao của các mẫu tự tạo, phương pháp có độ đúng nằm trong khoảng cho phép (80 % -

110 %), độ chính xác trung gian đạt yêu cầu quy định (giá trị RSD ≤ 8% ở nồng độ trung bình và cao, ≤ 11 % với nồng độ LOQ)

3.2.7 Xác định tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả

Để xác định tỷ lệ dương tính giả, cần tiến hành phân tích 30 mẫu âm tính được chuẩn bị theo hướng dẫn trong mục 2.3.2 Phân tích này sẽ được thực hiện trên 3 nền mẫu kem, với mỗi nền mẫu bao gồm 10 mẫu.

KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH GC TRONG CÁC MẪU MỸ PHẨM DẠNG KEM TRÊN THỊ TRƯỜNG

Phương pháp LC – MS/MS đã được áp dụng thành công để phát hiện và xác định hàm lượng các GC có mặt trái phép trong 24 mẫu mỹ phẩm dạng kem trên thị trường Sau khi xử lý theo quy trình phân tích, kết quả cho thấy 5 trong số 24 mẫu kiểm tra có chứa các GC với hàm lượng từ 0,06 đến 0,57 mg/g Các mẫu dương tính này được so sánh dựa trên thời gian lưu và số lượng ion.

48 và tỷ lệ cường độ ion con so với mẫu chuẩn tương ứng Kết quả được thể hiện ở hình 3.14 và bảng 3.14

Bảng 3.14 Kết quả phân tích GC trong một số mẫu kem mỹ phẩm

STT PRS DXM PRA CTA HCTA TAA DXA FLA CBP BMV BMD MTF

Chú thích: “-“: Không phát hiện thấy GC trong mẫu thử

Figure 3.14 illustrates the schematic diagram (SKĐ) representing various cream samples with GC, including a) the standard sample of Triamcinolone acetonide, b) the test sample containing Triamcinolone acetonide, c) the standard sample of Clobetasol propionate, and d) the test sample containing Clobetasol propionate.

BÀN LUẬN

Định dạng
Số trang	130
Dung lượng	26,02 MB