Tổng quan về Aflatoxin
Lịch sử phát triển
- 1924: Shofiel và cộng sự phát hiện ra một loại độc tố được sản sinh ra từ nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc.
Vào năm 1960, một dịch bệnh lớn đã xảy ra, dẫn đến cái chết hàng loạt của gà tây tại Anh Chỉ sau một thời gian ngắn, các nhà khoa học đã xác định được nguyên nhân gây ra dịch bệnh này là một chất độc có màu xanh da trời, được gọi là Aflatoxin.
- 1961: Người ta tìm ra bản chất hóa học của chất độc này.
- Aflatoxin là tinh thể trắng, bền nhiệt, không bị phân hủy ở nhiệt độ thông thường (trên
Ở nhiệt độ 120 độ C, sau 30 phút đun trong môi trường kiềm, chất độc này mới mất tác dụng, cho thấy nó có thể tồn tại trong thực phẩm mà không cần nấm mốc tương ứng và vẫn bền vững với men tiêu hóa.
- Không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại nên việc khử độc có nhiều biện pháp hơn.
Hiện nay, có 18 loại Aflatoxin được phát hiện, trong đó 4 loại chính thường gặp là AFB1 (B1), AFB2 (B2), AFG1 (G1) và AFG2 (G2) Aflatoxin B1 là loại phổ biến nhất trong nông sản, gây ra tác hại lớn nhất, dẫn đến ngộ độc nhanh chóng và thường gặp nhất.
Nguồn gốc
Aflatoxin được sinh ra chủ yếu bởi 2 loại nấm: Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus
Nấm mốc màu xanh vàng xuất hiện trên môi trường nuôi cấy, tương tự như các giống Aspergillus khác, chúng tạo ra bào tử đính Các tế bào bào tử này bám trên các túi, dẫn đến sự hình thành nấm đính.
- Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus đều sinh độc tố Aflatoxin, chỉ 73% có khả năng sinh độc tố, trong đó 23% sản sinh Aflatoxin ở mức cao.
- Một số loài nấm mốc khác có khả năng sinh Aflatoxin với lượng rất ít như :
Penicillium puberulum Bai, Aspergillus tamariikita, Aspergillus niger tiegh, Aspergillus ostiamis wehmen, Aspergillus ruper…
- Khả năng sinh độc tố Aflatoxin phụ thuộc vào các yêu tố như chủng nấm mốc, nhiệt độ, cơ chất, độ ẩm của cơ chất và môi trường.
Nhiệt độ lý tưởng cho sự phát triển và sản sinh Aflatoxin của các chủng nấm mốc là từ 25-28 độ C Tuy nhiên, khi nuôi cấy Aspergillus flavus ở nhiệt độ 45 độ C, khả năng sản sinh Aflatoxin sẽ bị ức chế.
- Độc tính Aflatoxin cao gấp 10 lần acid hydroxyanic (HCN) và gấp 68 lần Arsen (As). Bảng : Các sản phẩm có thể nhiễm Aflatoxin
Các hạt ngũ cốc Ngô,thóc,gạo,lúa mì.
Hạt có dầu Lạc,dừa,đậu tương,hướng dương
Sữa Sữa tươi,pho mat…
Sản phẩm lên men Bia,nước giải khát,rượu vang…
Các Aflatoxin có khả năng phát huỳnh quang và hấp thụ tia tử ngoại ở mức độ khác nhau
- Aflatoxin G1 và G2: màu xanh lục
Cục quản lý Thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ qui định hàm lượng tối đa Aflatoxin trong thức ăn gia súc như sau:
• Bò giống, heo giống, gà trưởng thành không quá 100 ppb
• Heo thịt giai đoạn vỗ béo: 200 ppb
• Bò sữa và gia súc non: 20 ppb
Quy định của Việt Nam-giới hạn tối đa (ML)
+ 1 kg thức ăn chỉ cần nhiễm 2 miligam (với lượng chỉ đủ dính trên đầu móng tay) cũng đã đủ làm hỏng gan.
Theo PGS.TS Đinh Duy Kháng, thông tin về Aflatoxin cần được xem xét lại Aflatoxin là một trong những chất độc hại nhất, và nồng độ của nó được đo bằng microgam, tương đương với 1 phần triệu gam Chỉ cần 2 miligam Aflatoxin trên 1 kg thực phẩm cũng đã là một mức độ rất nguy hiểm.
Quá trình lây nhiễm Aflatoxin
Trong điều kiện khí hậu nóng ẩm, nấm mốc có khả năng phát triển và sản sinh ra độc tố vi nấm, gây nhiễm độc cho thực phẩm Khi con người và gia súc tiêu thụ thực phẩm chứa Aflatoxin, họ có thể gặp phải các triệu chứng nhiễm độc cấp tính hoặc mãn tính.
- Việc nhiễm Aflatoxin phụ thuộc rất nhiều vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh dưỡng, mức độ và tần số tiếp xúc.
Các giai đoạn mà nấm có thể nhiễm vào thực phẩm:
Nhiễm bệnh ngoài đồng trong giai đoạn thu hoạch thường xảy ra khi bắp chín khô nhưng chưa được thu hoạch, gặp phải mưa và độ ẩm cao Trong điều kiện này, các loại nấm mốc từ đất có thể tấn công nông sản Để khắc phục tình trạng này, cần có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.
ML (microgam/kg) Tiêu chí
5 Đối với Aflatoxin B 1 trong thực phẩm nói chung
15 Đối với Aflatoxin B 1 , B 2 , G 1 , G 2 trong thực phẩm nói chung
0.5 Đối với Aflatoxin M 1 trong sữa và các sản phẩm sữa phục tình trạng này cần phải thu hoạch kịp thời, không nên để lâu ngoài đồng Sau khi thu hoạch phải phơi sấy ngay cho khô đến khi độ ẩm còn 13% mới đem bảo quản.
• Nhiễm trong kho khi dự trữ thức ăn:
Nguyên nhân chính gây ra sự phát triển của nấm mốc trong thực phẩm là độ ẩm cao trong thức ăn (>14%) và độ ẩm không khí trong kho cũng ở mức cao, dẫn đến việc nguyên liệu hấp thu độ ẩm trở lại Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm tạo ra hiện tượng ngưng tụ nước trên bề mặt thực phẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển Tại các khu vực Trung Đông, ngay cả những silo dự trữ bắp hiện đại cũng không tránh khỏi nấm mốc do nhiệt độ ban ngày có thể lên tới 40°C, làm nước trong nguyên liệu bay hơi và bão hòa không khí trong silo Khi nhiệt độ giảm vào ban đêm, hơi nước ngưng tụ ở lớp bắp ngoài cùng, khiến nó bị nhiễm nấm độc Để khắc phục tình trạng này, cần thường xuyên hút ẩm và thông thoáng trong kho.
• Nhiễm trùng chuồng nuôi gia súc, gia cầm:
Trong quá trình chăn nuôi gia súc gia cầm, việc thức ăn rơi vãi trên nền chuồng hoặc ẩm ướt tích tụ lâu ngày trong máng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc.
• Nhiễm vào thực phẩm để dành trong gia đình với thời gian dài.
Độc tính của Aflatoxin
Các triệu chứng nhiễm độc Aflatoxin được nghiên cứu thông qua các vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thử nghiệm trên động vật.
Aflatoxin ở mức 100-400 ppb có thể gây hại nghiêm trọng cho lợn, bắt đầu từ việc phá hủy gan và sau đó ảnh hưởng đến các cơ quan khác Sự hiện diện của aflatoxin cũng làm giảm tốc độ tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn.
• Lợn con: rất nhạy cảm với Aflatoxin, phá hủy gan, rối loạn tuần hoàn máu và chế (nếu vượt quá 400 ppb).
• Lợn nái: sẩy thai hoặc thai chết.
Aflatoxin là một chất độc nguy hiểm, làm thay đổi về mặt sinh học, phá hủy hệ thống miễn dịch Trong đó Aflatoxin B1 là mạnh nhất, sau đó đến G1, B2, G2.
Aflatoxin được vận chuyển nhanh chóng trong cơ thể động vật nhiễm độc, với 85% lượng Aflatoxin được chuyển hóa trong sữa và bài tiết qua nước tiểu chỉ sau 48 giờ sau khi cho ăn liều 0,50 mg/kg Sau 4 ngày, không còn phát hiện Aflatoxin trong sữa và sau 6 ngày trong phân và nước tiểu Ở người, nhiễm độc cấp tính có thể gây ra các triệu chứng như nôn ói, đau bụng, sưng phổi, co giật, hôn mê, và có thể dẫn đến tử vong do phù não, cũng như tổn thương ở tim, gan và thận.
Mức độ nhiễm độc Aflatoxin ở vật thử nghiệm thay đổi theo thời gian, phụ thuộc vào tính mẫn cảm của từng loại Gan của những vật bị nhiễm thường có màu nhợt và sưng to.
Hoại tử mô gan và chảy máu ở gia cầm có thể xảy ra, trong khi hiện tượng tụ máu ở phổi và sự tăng sinh tế bào biểu mô của ống dẫn mật cũng có thể được quan sát thấy ở mức độ nhẹ hơn Nhiễm độc mãn tính là một vấn đề cần lưu ý trong chăn nuôi gia cầm.
- Thể hiện đầu tiên: chán ăn, chậm lớn, sụt cân…
- Có tính di truyền theo 3 kiểu: gây ung thư, quái thai, gây đột biến.
Aflatoxin B1 có độc tính cao đối với gan và được coi là một trong những tác nhân gây ung thư gan ở cả người và động vật Với trọng lượng phân tử thấp, Aflatoxin B1 dễ dàng hấp thu qua thành ruột sau khi tiêu thụ Khi vào ruột non, chất này nhanh chóng được hấp thu vào tĩnh mạch và tập trung chủ yếu tại gan.
Aflatoxin có tác động bệnh lý cộng hưởng với các yếu tố khác như virus viêm gan B (HBV) và các độc tố di truyền Nghiên cứu cho thấy việc đồng phơi nhiễm với HBV làm tăng nguy cơ ung thư gan lên hơn 60 lần so với chỉ phơi nhiễm với HBV một mình.
- GS dịch tễ học Pauline Jolly và cộng sự phát hiện rằng aflatoxin làm tăng đáng kể lượng HIV trong máu của bệnh nhân.
Nghiên cứu trên 314 trường hợp dương tính với HIV cho thấy sự phân chia thành 4 nhóm dựa trên mức độ phơi nhiễm aflatoxin Kết quả chỉ ra rằng nhóm có mức độ nhiễm aflatoxin cao nhất có nguy cơ phát triển HIV cao gấp 2,6 lần so với nhóm có mức độ nhiễm aflatoxin thấp nhất.
Gan nhiễm mỡ xơ gan
Ngoài gan, các cơ quan như phổi, thận, túi mật và hệ thống thần kinh cũng chịu ảnh hưởng nghiêm trọng, dẫn đến viêm sưng nặng nề và có thể gây hoại tử các tổ chức cũng như nội tạng.
Nghiên cứu của Elis và Dipaolo năm 1976 đã chỉ ra rằng việc tiêm Aflatoxin B1 vào chuột qua đường ổ bụng với liều 4 mg/kg thể trọng có thể dẫn đến dị tật thai hoặc thai chết.
Phơi nhiễm Aflatoxin B1 có liên quan đến sự đột biến gen ở bệnh nhân, đặc biệt là đột biến gen p53, một gen quan trọng trong việc kiểm soát quá trình chết tế bào Khi gen p53 bị đột biến, số lượng tế bào có thể gia tăng, dẫn đến nguy cơ tế bào trở thành ác tính.
Năm 1961, tại Anh, một thí nghiệm trên chuột cống đã được thực hiện với chế độ ăn chứa 20% bột lạc thối nhiễm mốc Sau 6 tháng, kết quả cho thấy chuột phát triển ung thư gan.
Robinsơn đã tiến hành nghiên cứu trên trẻ em ở Ấn Độ bị xơ gan và phát hiện Aflatoxin trong nước tiểu của những trẻ này, cũng như trong sữa của các bà mẹ có con bị xơ gan Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa xơ gan và Aflatoxin.
Năm 1986, Payet và cộng sự đã nghiên cứu hai trẻ em mắc suy dinh dưỡng Kwashiorkor, được cho ăn bột lạc bổ sung đạm nhưng không may bột lạc này bị nhiễm Aflatoxin Hai trẻ tiêu thụ 70-100g bột lạc nhiễm Aflatoxin với nồng độ 0,5-1 ppm trong suốt 10 tháng Khi trẻ được 4 tuổi, các triệu chứng rối loạn chức năng gan đã xuất hiện, và sinh thiết gan cho thấy có hiện tượng loét mô gan ở cả hai trẻ.
Khả năng tác động lên tác động lên tế bào gan của Aflatoxin trải qua 5 giai đoạn :
• Ức chế các polymerase chịu trách nhiệm tổng hợp AND và ARN.
• Ngừng hẳn hoặc giảm tổng hợp AND.
• Ngăn cản cơ chế sinh tổng hợp ARN truyền tin.
• Biến đổi hình dạng nhân tế bào.
• Hạn chế quá trình sinh tổng hợp protein.
Hậu quả : gây ung thư biểu mô tế bào gan.
Bệnh do độc tố nấm thường gặp ở những người có đời sống thấp, chủ yếu tiêu thụ ngũ cốc và thực phẩm thực vật giàu chất béo không được bảo quản đúng cách Ngoài ra, khí hậu nóng ẩm và tình trạng vệ sinh kém cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc, dẫn đến việc sinh ra độc tố và gây bệnh.
Hiện nay thuốc chữa bệnh đặc hiệu không có, vì vậy biện pháp phòng bệnh là quan trọng.
“BỆNH LẠ” Ở BA TƠ-QUẢNG NGÃI: HỘI CHỨNG VIÊM DA DÀY SỪNG BÀN TAY BÀN CHÂN (4-2012)
Triệu chứng suy đa phủ tạng ở bệnh nhân chiếm hơn 80% trong quá trình khám sàng lọc, với biểu hiện dày sừng, nứt nẻ ở bàn tay và chân, đặc biệt là vùng quanh móng tay Da ở bàn tay, bàn chân và kẽ ngón chân trở nên dày sừng, thâm đen, không ngứa, không đau, cùng với chỉ số men gan tăng cao, có trường hợp tăng từ 4-5 lần đến 10-20 lần mức bình thường, dẫn đến tổn thương gan Nhóm tuổi thường mắc bệnh chủ yếu từ 15-29 tuổi, đã ghi nhận 19 ca tử vong Nguyên nhân được xác định có liên quan đến việc tiêu thụ gạo nấm mốc chứa aflatoxin, một độc tố vi nấm có khả năng gây ung thư gan.
** Hiện nay aflatoxin tinh khiết được sản xuất- đóng vai trò chất nội chuẩn để kiểm tra sự nhiễm bẩn aflatoxin trên thực phẩm.
Một số biện pháp phòng ngừa aflatoxin trong thực phẩm
Thực hiện giáo dục truyền thông cho người nông dân
Thực hành sản xuất nông nghiệp tốt bao gồm việc chọn giống chất lượng, chuẩn bị đất kỹ lưỡng, bón phân hợp lý, sử dụng chất bảo vệ thực vật đúng cách và thu hoạch đúng thời điểm Những yếu tố này không chỉ đảm bảo năng suất cao mà còn bảo vệ môi trường và sức khỏe người tiêu dùng.
Nông sản sau khi thu hoạch phải được xử lý, phân loại hoặc phơi sấy khô để đảm bảo có điều kiện bảo quản tốt nhất.
Không nên sử dụng thực phẩm nhiễm mốc cho con người và gia súc Việc cho gia súc ăn thức ăn bị mốc có thể dẫn đến tích tụ độc tố trong cơ thể chúng, và khi con người tiêu thụ sản phẩm từ gia súc đó, chúng ta cũng sẽ bị nhiễm độc tố nấm mốc Do đó, việc lựa chọn thức ăn an toàn cho vật nuôi là rất quan trọng để phòng ngừa nguy cơ nhiễm độc.
Khảo sát kiến thức của người sản xuất nông nghiệp về tác động độc hại của sản phẩm nông nghiệp nhiễm nấm mốc cho thấy sự thiếu hiểu biết về ảnh hưởng đến sức khỏe con người Việc nâng cao nhận thức và giáo dục cho nông dân về các rủi ro này là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng và đảm bảo an toàn thực phẩm.
Phòng chống nấm mốc cho lương thực trong quá trình bảo quản
Nước ta thuộc vùng nhiệt đới nóng ẩm, do đó cần chú trọng đến việc đảm bảo an toàn chất lượng sản phẩm, đặc biệt là độc tố vi nấm A.favus có khả năng nhiễm bệnh cao và sản sinh aflatoxin, điều này gây khó khăn trong việc kiểm tra và xử lý kịp thời.
Phòng nhiễm aflatoxin theo: tránh làm hỏng sản phẩm khi thu hoạch và ngăn ngừa sự phát triển của nấm mốc trong quá trình bảo quản:
-Xử lý trên củ: dùng diclofluanit và diflolatan, captan, oxinat và fantan.
-Thiabendazol với liều lượng 30 mg/ml ức chế được A.flavus.
Sự sản sinh aflatoxin bị ức chế khi độ ẩm tương đối đạt 80% và nồng độ CO2 là 20% ở nhiệt độ 17°C, cũng như ở 40% CO2 tại nhiệt độ 25°C Tăng nồng độ CO2 trong điều kiện nhiệt độ ổn định sẽ giúp giảm sự sản sinh aflatoxin.
- Ngăn ngừa côn trùng, bụi bẩn.
- Giảm nhiệt độ, độ ẩm, mức oxy hoá trong kho.
-Với lương thực như gạo, ngô, mì: giữ khô, thoáng mát.
-Thực phẩm khô như lạc, vừng, cà phê…thực phẩm hút ẩm: phơi khô, bảo quản trong thiết bị sạch kín, độ ẩm hạt dưới 15%.
Điều trị khi bị nhiễm độc
Con người sử dụng chất chống ung thư như Oltipraz để ngăn chặn sự gia tăng DNA- aflatoxin.
Chlorophyllin có khả năng giảm nồng độ aflatoxin bằng cách ngăn chặn sự hấp thu của hợp chất này trong hệ tiêu hóa Việc tiêu thụ chlorophyllin qua đường uống hoặc ăn các loại rau xanh giàu chlorophyllin có thể giúp giảm nguy cơ mắc ung thư gan.
Vật nuôi nhiễm aflatoxin cần thay đổi thức ăn.
Bentonite, NovaSil, zeolite, and aluminosilicate, particularly HSCAS at a dosage of 10 kg per ton, effectively mitigate the harmful effects of aflatoxin in certain livestock by binding aflatoxin and preventing its absorption This physical method offers a reliable solution for enhancing animal health and safety.
Aflatoxin có khả năng bền vững với nhiệt độ, nhưng sẽ bị phân hủy khi đạt đến 250 độ C Việc khử aflatoxin bằng nhiệt độ cao trong thời gian dài có thể thực hiện được, tuy nhiên, phương pháp này dễ làm thay đổi tính chất của sản phẩm Nếu nhiệt độ không đạt yêu cầu, việc khử aflatoxin sẽ không hiệu quả và có thể dẫn đến nhiều ảnh hưởng tiêu cực khác.
Tia γ có hiệu quả tiêu diệt nấm mốc khi hàm lượng nước trong cơ chất khoảng 22%, cần sử dụng liều lượng 1 Mrad để đạt kết quả tốt Nếu liều lượng thấp hơn, đặc biệt dưới 200 krad, có thể làm tăng lượng aflatoxin sinh ra Ngược lại, khi chiếu xạ với liều lượng cao hơn, khả năng tạo aflatoxin sẽ giảm xuống.
Dưới tác dụng của tia tử ngoại, aflatoxin đôi khi tạo thành các sản phẩm suy thoái, một số vẫn bền vững. b Phương pháp hoá học:
Nhiều hoá chất như chlorine, ozon, acid hydrochloric, peroxit benzoic, ammoniac, natri hydrochlorit và etanolamin có khả năng phá huỷ aflatoxin tinh khiết cũng như aflatoxin có trong nguyên liệu nhiễm tự nhiên Các hoá chất này cần đáp ứng các tiêu chuẩn nhất định để hiệu quả trong việc khử độc tố aflatoxin.
• Phải phá huỷ hay khử aflatoxin.
• Không được tạo hoặc giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc hay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng.
• Phải phá huỷ các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi, chúng có thể tái nhiễm lại ở sản phẩm.
• Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban đầu.
Chiết xuất aflatoxin từ thực phẩm thường được thực hiện bằng cách sử dụng các dung môi như methanol (trong môi trường nước), aceton và izopropanol, với nhiệt độ chiết xuất đạt 60 độ C.
Phương pháp biến đổi phân tử là một trong những kỹ thuật hóa học chủ yếu để loại bỏ độc tính của aflatoxin, tập trung vào việc oxy hóa hoặc hydroxyl hóa phân tử aflatoxin và phá vỡ các nối đôi trong cấu trúc furan Các chất như hydrogen peroxide, natri hydroxit và natri hypoclorit đã chứng minh khả năng hiệu quả trong việc khử aflatoxin từ các sản phẩm giàu protein Đối với các loại hạt có dầu hoặc ngô, dimetylamin, metylamin và ammoniac có thể được áp dụng để loại bỏ độc tố.
-Cạnh tranh giữa các loài nấm.
-Các chuyển hoá sinh học
giờ phần lớn aflatoxin đã bị phá huỷ Phương pháp này hữu ích trên khô lạc, sữa, dầu chưa lọc, lúa mì
Phương pháp xác định độc tố Aflatoxin
Phương pháp sắc kí lớp mỏng đã trở thành công cụ phổ biến trong việc xác định hàm lượng Aflatoxin từ những năm 1960 Kỹ thuật này sử dụng bản mỏng được tráng silicagel để phân tích và xác định sự hiện diện của aflatoxin một cách hiệu quả.
Dung môi được sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng bao gồm chlorofom: methanol và chlorofom: aceton Việc bổ sung nước vào hệ thống dung môi sẽ cải thiện khả năng hòa tan aflatoxin.
Hệ dung môi gồm nước, aceton và chloroform (tỷ lệ 1.5, 12, 88) được xác định là có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất Các bản mỏng sau khi được xử lý bằng dung môi sẽ được chiếu sáng bằng đèn tử ngoại (UV) 365nm, tạo ra các vết mẫu phân tích với màu huỳnh quang xanh da trời hoặc xanh lá cây Độ dài Rf của các vết này được so sánh với các vết aflatoxin tiêu chuẩn, cho phép xác định lượng aflatoxin với độ nhạy từ 3-4.10^-4 micromet (0.3-0.4 mg).
Phương pháp sắc ký lớp mỏng một chiều có nhược điểm là phụ thuộc vào kỹ năng của người phân tích, dẫn đến khả năng sai lệch kết quả khi so sánh giữa các mẫu và vết độc tố chuẩn, có thể lên đến 20-30%.
Chấm một giọt dung dịch thử từ 10 àl đến 20 àl lên tấm sắc ký lớp mỏng đã được làm sạch Sau đó, đặt tấm sắc ký vào hộp chứa dung môi sắc ký một chiều và tiến hành cho hiện sắc ký cho đến khi dung môi đạt chiều cao khoảng 10 cm.
Lấy tấm sắc ký ra khỏi hộp và để khô trong không khí Sử dụng đèn UV ở bước sóng 365 nm hoặc máy đo mật độ quang để đọc cường độ huỳnh quang của các điểm chấm So sánh cường độ huỳnh quang của mẫu thử với dung dịch chuẩn AFM1 và các điểm phát sáng cận kề.
Tính hàm lượng AFM1 trong phần mẩu thử.
Nếu huỳnh quang của điểm chấm mẫu thử mạnh hơn huỳnh quang của dung dịch chuẩn AFM1 cao nhất, thì có thể ước tính mức độ nhiễm bẩn Dựa vào mức nhiễm này, cần pha loãng mẫu thử với dung dịch toluen/acetonitril phù hợp Sau đó, lặp lại quy trình với mẫu thử đã được tinh sạch và pha loãng.
Nếu phát hiện sự nhiễu hoặc vạch xuất hiện gần các điểm huỳnh quang trên tấm sắc ký, hãy tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng hai chiều Chấm mẫu lên tấm sắc ký lớp mỏng 20.
Để thực hiện quá trình sắc ký, AFM1 được chạy theo hướng 1, trong khi các điểm chấm 5 của dung dịch làm việc AFM1 chạy theo hướng 2 Đầu tiên, đặt tấm sắc ký vào hộp TLC chứa dung dịch TLC một chiều và cho hiện sắc ký diễn ra theo hướng 1 cho đến khi dung môi đạt chiều cao khoảng 7cm Cuối cùng, lấy tấm sắc ký ra khỏi hộp và để khô tự nhiên trong không khí.
Để thực hiện quy trình sắc ký, đầu tiên, làm nóng tấm sắc ký khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50 o C trong 5 phút Sau đó, để tấm nguội và đặt theo hướng thứ hai vào hộp TLC khác có chứa dung dịch TLC hai chiều Tiến hành cho tấm sắc ký này trong hướng thứ hai cho đến khi dung môi đạt chiều cao khoảng 7 cm.
Lấy tấm sắc ký ra khỏi hộp và để khô trong không khí Sử dụng đèn UV ở bước sóng 365 nm hoặc máy đo mật độ quang để đọc các điểm chấm thu được So sánh cường độ huỳnh quang của điểm chấm mẫu thử với cường độ huỳnh quang của các điểm chấm dung dịch chuẩn AFM1 và các điểm phát sáng cận kề.
Tính hàm lượng AFM1 trong phần mẩu thử theo điều 9.
Nếu huỳnh quang từ điểm chấm của mẫu thử mạnh hơn huỳnh quang của dung dịch chuẩn AFM1, cần lặp lại quy trình với phần mẫu thử nhỏ hơn để đạt được kết quả chính xác hơn.
Sau khi thực hiện phân tích TLC, dung dịch thử đã được tinh sạch cần được bảo quản trong lọ đậy kín và đặt trong tủ đá Việc này nhằm mục đích định lượng hoặc xác nhận danh tính trong các bước tiếp theo nếu cần thiết.
• Tính toán kết quả theo công thức:
• Vs là giá trị của thể tích điểm chấm của dung dịch chuẩn làm việc AFM1 dung dich A hoặc dung dich B.
• Cs là hàm lương AFM1 của dung dịch làm việc A hoặc B.
• V1 là thể tớch của căn hũa tan (àl).
• V2 là thể tớch điểm chấm phần mẫu đó tinh sạch (àl).
• mt là thể tích hoặc khối lượng của mẫu thử (ml hoặc mg).
10.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao:
Phương pháp sắc ký lớp mỏng tự động (TLC) là hình thức nâng cao của sắc ký lớp mỏng truyền thống, giúp cải thiện độ phân giải và cho phép đo định lượng chính xác hơn Quy trình này tự động hóa các bước khác nhau, mang lại hiệu quả cao trong phân tích.
- Cân 25g mẫu thử đã đồng hoá cho vào bình trộn.
- Thêm 5g NaCl và 125ml dung môi, đồng hoá bằng máy trộn trong 2 phút ở tốc độ cao.
- Lọc hỗn hợp qua giấy lọc.(V1)
- Dùng pipet lấy 15ml dịch lọc (V2) cho vào bình nón có nắp đậy thuỷ tinh.
- Thêm 30ml H 2 O vào, đậy bình và lắc đều.
- Lọc dịch chiết đã pha loãng qua giấy lọc vi sợi thuỷ tinh (V3) rồi cho chạy sắc ký cột ái lực.
- Chuẩn bị cột miễn nhiễm IA Dùng pipet lấy 15ml dịch lọc của V3, ta được V4 cho vào trong bình chứa dung môi của cột IA.
- Cho đi qua cột tách, sau đó rửa cột và loại bỏ chất rửa giải.
- Thu lấy chất rửa giải cho vào bình định mức 2ml.
- Pha loãng bằng nước và định mức đến vạch.
- Lắc đều và tiến hành theo điều kiện vận hành của HPLC.
- Nhận biết mỗi pic aflatoxin trong sắc ký đồ của mẫu bằng cách so sánh thời gian lưu của các chất chuẩn tương ứng.
- Định lượng bằng phương pháp ngoại chuẩn, tính diện tích pic hoặc chiều cao pic Chiều cao pic liên quan đến giá trị tương ứng của chất chuẩn.
- Bơm một thể tớch 50 àl hỗn hợp chuẩn lờn vũng bơm (theo hướng dẫn )
- Rửa giải aflatoxin theo thứ tự G 2 , G 1 , B 2 , B 1 với thời gian lưu tương ứng khoảng 6 phút, 8 phút, 9 phút và 11phút và phải có đường phân giải
-Bơm 50 àl (V6) dịch chiết mẫu đó làm sạch vào vũng bơm. b Tính kết quả
-Tính khối lượng mẫu thử m t theo gam có trong dịch lọc lần 2 thu được từ cột IA theo công thức: m o : khối lượng phần mẫu thử, m o = 25g.
-Tính phần khối lượng của từng aflatoxin w i theo microgam/kg mẫu theo công thức:
V 5 : thể tích chất rửa giải m i : khối lượng của từng aflatoxin có trong thể tích bơm
Thiệt hại do Aflatoxin đối với sức khỏe cộng đồng và kinh tế là rất nghiêm trọng, vì vậy việc bảo quản lương thực an toàn và tránh sử dụng thực phẩm bị nhiễm nấm mốc là cực kỳ quan trọng để giảm nguy cơ ung thư gan Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu các phương pháp sinh học nhằm chống nhiễm Aflatoxin, mở ra hướng đi mới cho an toàn thực phẩm.