QUAN
BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
1.1.1 Định nghĩa đái tháo đường ĐTĐ là bệnh rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết về tiết insulin của tế bào bêta tụy, về tác động của insulin tại các mô cơ quan, hoặc cả hai Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa đường, protit, lipit, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim ,mạch máu, thận, mắt và thần kinh [3].
1.1.2 Phân loại đái tháo đường
Bệnh tiểu đường (ĐTĐ) được phân loại thành nhiều loại, bao gồm ĐTĐ T1, ĐTĐ T2, ĐTĐ thai kỳ và một số típ khác Đặc biệt, ĐTĐ T2, thường được gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin, chiếm hơn 90% tổng số bệnh nhân ĐTĐ Đặc điểm chính của ĐTĐ T2 là kháng insulin, dẫn đến tình trạng thiếu hụt insulin tương đối và giảm sản xuất insulin.
1.1.3 Dịch tễ học đái tháo đường
Theo Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF), năm 2015 có 415 triệu người trong độ tuổi 20-79 mắc bệnh đái tháo đường, và dự báo con số này sẽ tăng lên 642 triệu vào năm 2040 Sự gia tăng này chủ yếu do chế độ dinh dưỡng và lối sống không hợp lý, khiến bệnh đái tháo đường typ 2 trở thành một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng.
Tại Việt Nam, tỷ lệ đái tháo đường (ĐTĐ) đã có sự biến đổi qua các năm, cụ thể năm 1990, tỷ lệ ĐTĐ ở Hà Nội là 1,1%, TP Hồ Chí Minh là 2,25% và Huế là 0,96% Đến năm 2003, tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose trên toàn quốc đạt 7,3%, trong khi rối loạn đường huyết lúc đói là 1,9% Nghiên cứu năm 2012 của Bệnh viện Nội tiết Trung Ương cho thấy tỷ lệ mắc ĐTĐ ở người trưởng thành là 5,42%, trong đó 63,6% chưa được chẩn đoán Theo điều tra STEPwise của Bộ Y tế năm 2015, tỷ lệ ĐTĐ toàn quốc ở nhóm tuổi từ 18-69 là 4,1%, và tiền ĐTĐ là 3,6%.
1.1.4 Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường típ 2
Đặc điểm chính của bệnh tiểu đường type 2 (ĐTĐ T2) là kháng insulin, dẫn đến thiếu hụt insulin tương đối và giảm sản xuất insulin Insulin, hormone do tế bào bêta của tuyến tụy tiết ra, giúp duy trì cân bằng glucose trong máu Kháng insulin là tình trạng giảm phản ứng trao đổi chất của tế bào đối với insulin, làm giảm hiệu quả hạ đường huyết của insulin trong cơ thể Quá trình truyền tín hiệu insulin rất phức tạp, liên quan đến nhiều enzyme và protein điều hòa; bất kỳ khiếm khuyết nào trong chức năng của các tác nhân này có thể dẫn đến kháng insulin trong các mô ngoại biên Nghiên cứu của Czech MP (2017) đã đề xuất mô hình tiếp nhận tín hiệu insulin qua thụ thể insulin trên bề mặt tế bào, kích hoạt các tín hiệu nội bào và sử dụng kênh GLUT.
Các yếu tố liên quan đến việc hoạt hóa và ức chế quá trình chuyển hóa glucose tại cơ xương và mô mỡ có vai trò quan trọng trong việc giảm glucose huyết Cụ thể, quá trình ức chế gluconeogenesis tại gan giúp duy trì khả năng điều hòa tín hiệu insulin, từ đó góp phần cải thiện tình trạng đường huyết.
Kháng insulin trong tế bào gan dẫn đến tăng mức glucose huyết tương do giảm tổng hợp glycogen, đồng thời làm giảm khả năng hấp thụ glucose của cơ xương và tế bào mỡ Mặc dù cơ chế chính xác của kháng insulin vẫn chưa rõ ràng, nhưng có nhiều khiếm khuyết trong quá trình truyền tín hiệu insulin đóng vai trò quan trọng, bao gồm: điều chỉnh Protein‐Tyrosine Phosphatase 1B (PTP1B), các phản ứng viêm và adipokine, quá tải gốc tự do, khiếm khuyết phosphoryl hóa serine của IRS-1, rối loạn chức năng ty thể, giảm hoạt động của thụ thể insulin, đột biến GLUT 4, và căng thẳng trong mạng lưới nội chất.
Hình 1.1 Mô hình tiếp nhân tín hiệu insulin trong giảm nồng độ glucose máu
Sự liên kết của insulin với thụ thể của nó kích hoạt enzyme tyrosine kinaza, dẫn đến photphoryl hóa các axit amin tyrosine của protein IRS Các tyrosin này trở thành vị trí neo cho tiểu đơn vị p85 của enzyme kinaza p85/p110 PI-3, tạo ra phức hệ PtdIns3,4,5P 3 từ PtdIns 4,5 P 2 trên màng tế bào Quá trình này cho phép protein kinaza PDK1 tương tác với Akt, dẫn đến photphoryl hóa tại threonine 308 của Akt Sự hoạt hóa hoàn toàn của Akt còn cần sự photphoryl hóa bởi enzyme mTORC2 Khi Akt được hoạt hóa, nó điều hòa cân bằng nội môi glucose bằng cách vận chuyển glucose vào tế bào mỡ và cơ xương, ức chế tái tạo glucose tại gan, và kích thích sinh tổng hợp lipit tại gan.
Bảng 1.1 Cơ chế phân tử của kháng insulin [117]
Cơ chế phân tử Vai trò trong kháng insulin
Tăng cường hoạt tính của enzyme PTP1B
Phosphatase 1B đảo ngược quá trình phosphoryl hóa axit amin tyrosin trên phân tử IRS-1 (Insulin Receptor Substrate-1) khi có sự liên kết với insulin, từ đó làm suy yếu khả năng truyền tín hiệu insulin.
Phản ứng viêm và adipokine
Kích hoạt các con đường IKKβ/NF-κB và JNK dẫn đến việc phosphoryl hóa IRS-1 tại serin 307, làm giảm biểu hiện GLUT-4 Đồng thời, sự giảm biểu hiện IRS-1 thông qua ERK1/2 và sự phân hủy IRS-1 qua cơ chế phụ thuộc vào SOCS1 và SOCS3 cũng diễn ra.
Quá tải gốc tự do
Kích hoạt các con đường kinaza serine threonine như IKKβ/NF B và JNK dẫn đến phân hủy IRS, ức chế biểu hiện và định vị GLUT 4 trên màng tế bào Điều này làm giảm sự dịch chuyển của IRS-1 và PIP-kinase, cũng như phosphoryl hóa serine tại vị trí 307 của IRS-1, từ đó kích hoạt các phản ứng viêm.
Khiếm khuyết trong photphoryl hóa serine của IRS ‐ 1
Giảm photphoryl hóa thụ thể insulin, phosphoryl hóa serine tại vị trí 307, ngăn chặn tín hiệu insulin dẫn đến ngăn chặn tín hiệu insulin.
Béo phì Hoạt hóa các kinaza serine threonine,gây viêm và làm suy yếu tín hiệu insulin.
Rối loạn chức năng ty thể gây ra căng thẳng oxy hóa và làm suy yếu khả năng tín hiệu insulin, dẫn đến giảm hoạt động liên kết của thụ thể insulin.
Giảm số lượng và chức năng của thụ thể insulin, cùng với sự hiện diện của tự miễn kháng thể chống thụ thể insulin, có thể dẫn đến các vấn đề về chuyển hóa glucose Đột biến điểm của GLUT 4 cũng gây cản trở quá trình glucose đi vào các tế bào phụ thuộc, làm suy yếu các đường dẫn tín hiệu tiếp theo, ảnh hưởng đến khả năng sử dụng glucose trong cơ thể.
Căng thẳng ER Phá vỡ sự cuộn gấp thích hợp dẫn đến sự tích tụ của protein bị sai lệch.
Suy giảm chức năng tế bào beta của tụy
Hai loại tế bào chủ yếu trong tuyến tụy là tế bào alpha và beta, đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh lượng đường huyết Tế bào beta tiết ra insulin, trong khi tế bào alpha sản xuất glucagon, giúp duy trì mức đường huyết ổn định thông qua việc điều chỉnh quá trình hấp thu glucose và phân hủy glycogen.
Hình 1.2 Hoạt động của các tế bào tại đảo tụy trong duy trì nồng độ glucose huyết
Các đảo nhỏ tụy chứa tế bào alpha và beta, có chức năng tiết ra glucagon và insulin để điều chỉnh lượng đường trong máu Insulin giúp hạ glucose bằng cách kích thích sự hấp thu glucose ở cơ xương, ức chế sản xuất glucose tại gan và làm tan mỡ Ngược lại, glucagon tăng nồng độ glucose trong máu thông qua việc tăng gluconeogenesis và lipolysis.
TẾ BÀO GỐC
1.2.1 Định nghĩa tế bào gốc
Tế bào gốc, lần đầu tiên được đề cập trong tài liệu khoa học vào năm 1868 bởi nhà sinh vật học Ernst Haecker, là những tế bào chưa chuyên hóa có khả năng tự phân chia và biệt hóa thành các tế bào chuyên biệt với chức năng sinh lý cụ thể Khi tế bào gốc phân chia, mỗi tế bào mới có thể duy trì tính gốc hoặc trở thành một tế bào khác với chức năng cụ thể hơn, như các tế bào gốc tạo máu trong tủy xương có thể biệt hóa thành hồng cầu, bạch cầu, và tiểu cầu Tế bào gốc cũng đóng vai trò quan trọng trong việc sửa chữa và duy trì cân bằng nội mô của các mô, như việc thay thế các tế bào sừng ở lớp biểu bì da Trong số các dòng tế bào gốc, dòng tế bào gốc trung mô là dòng tế bào nổi bật nhất với nhiều ứng dụng thực tiễn.
1.2.2 Tế bào gốc trung mô
Tế bào gốc trung mô (MSC) là loại tế bào gốc đa năng có mặt trong nhiều mô như tủy xương, mô mỡ, dây rốn và tủy răng sữa MSC nổi bật với khả năng tự làm mới và giữ được tính đa tiềm năng, vì vậy chúng đang được ứng dụng rộng rãi trong liệu pháp tế bào.
Hình1.4 Nguồntếbàogốc trungmôtrưởngthành vàcác loạitếbàomàchúngcóthểbiệt hóa [78]
Các tế bào gốc trung mô (MSC) có nguồn gốc từ nhiều nguồn khác nhau như buồng trứng, nhau thai, màng ối, dây rốn, tủy xương, tủy răng sữa, hạ bì và sữa Chúng có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm xương, mỡ, tế bào máu, nội mô, sụn, ống thận và tế bào thần kinh.
Kể từ khi Friedenstein phát hiện tế bào gốc trung mô từ tủy xương (BM-MSC) vào năm 1976, nghiên cứu về MSC đã gia tăng nhanh chóng nhờ vào khả năng tăng sinh mạnh mẽ, điều hòa miễn dịch, và khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau như xương, sụn, và mô liên kết MSC không chỉ có khả năng biệt hóa in vitro mà còn in vivo, làm cho chúng trở thành một mô hình hấp dẫn cho nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc và ứng dụng trong liệu pháp tế bào cũng như liệu pháp gen Hơn nữa, tế bào trung mô từ nhiều mô khác nhau cho thấy tính mềm dẻo cao, có khả năng chuyển đổi thành các tế bào thuộc các dòng khác không thuộc trung mô.
Hình 1.5 Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô (TRENDS in
1.2.3 Tế bào gốc trung mô từ tủy xương
Từ những năm 1950, tủy xương được công nhận là nguồn phong phú tế bào gốc tạo máu và các tế bào hỗ trợ cho quá trình sản xuất máu Đến thập niên 1960, các nhà khoa học nổi tiếng Ernest A McCulloch và James E Till đã thực hiện thí nghiệm nuôi cấy dung dịch tủy xương, qua đó chứng minh khả năng tạo cụm của các tế bào trong tủy xương.
Thí nghiệm của Friedenstein vào những năm 70 đã chứng minh khả năng tăng sinh của tế bào tủy xương khi nuôi cấy ex vivo Nhiều thí nghiệm sau đó đã xác nhận khả năng biệt hóa của tế bào tủy xương thành các tế bào đặc hữu như tế bào xương, sụn và mỡ Kết quả này đã dẫn đến sự ra đời của khái niệm tế bào gốc trung mô, hay còn gọi là Mesenchymal stem cells (MSCs).
Tế bào gốc trung mô trong tủy xương chiếm tỉ lệ rất nhỏ, từ 0.001 đến 0.01% số lượng tế bào đơn nhân, nhưng chúng có khả năng tăng sinh và biệt hóa tốt dưới điều kiện nuôi cấy thích hợp Tế bào gốc trung mô đã được chứng minh là đa năng, có khả năng biệt hóa thành các tế bào thuộc lớp trung mô như xương, sụn và mỡ, cũng như có khả năng biệt hóa thành tế bào gan, tế bào tim và tế bào thần kinh, mặc dù tỉ lệ thành công thấp Để tăng khả năng phân lập tế bào gốc trung mô, phương pháp ly tâm tỉ trọng Ficoll là một kỹ thuật phổ biến, giúp phân tách các loại tế bào trong tủy xương dựa trên tỉ trọng Sau khi ly tâm, tế bào gốc trung mô sẽ nằm ở lớp giữa giữa Ficoll và huyết tương, được gọi là lớp Buffy coat Trong giai đoạn đầu nuôi cấy, tế bào gốc trung mô có hình thái giống nguyên bào sợi và khả năng tăng sinh chậm, nhưng sẽ đồng nhất và tăng sinh nhanh hơn qua các lần cấy chuyển Tùy thuộc vào bản chất của tế bào và tình trạng người hiến, tế bào gốc trung mô có thể được cấy chuyển từ 10 đến 20 lần.
ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TÍP 2
1.3.1 Cơ sở lý luận của phương pháp ghép tế bào gốc trên bệnh nhân đái tháo đường típ 2
Tế bào gốc đã được ứng dụng rộng rãi trong y học tái tạo để điều trị nhiều bệnh lý, bao gồm bệnh tiểu đường, xơ gan, tái tạo biểu mô và chấn thương chỉnh hình như sửa chữa xương, sụn, dây chằng, gân Đặc biệt, tế bào gốc đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh tự miễn như viêm khớp tự miễn và bệnh Crohn Trong số các loại tế bào gốc, tế bào gốc trung mô nổi bật với khả năng điều hòa miễn dịch mạnh mẽ, đã được chứng minh qua các nghiên cứu trên động vật và thử nghiệm lâm sàng ở người Hơn nữa, tế bào gốc trung mô có khả năng nuôi cấy và tăng sinh tốt trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Cơ chế tác động của MSC bao gồm khả năng biệt hóa thành tế bào tụy (IPC), từ đó tăng cường tiết insulin và cải thiện chức năng tế bào bêta tụy MSC cũng thúc đẩy tái tạo tế bào tuyến tụy thông qua việc tiết cytokine và yếu tố tăng trưởng như VEGF, IGF-1, PDGF-BB, và angiopoietin-1, giúp phục hồi tế bào bêta và chuyển đổi tế bào alpha thành tế bào beta Bên cạnh đó, MSC cải thiện kháng insulin thông qua việc kích hoạt con đường tín hiệu IRS-1/PI3K, chuyển đổi đại thực bào gây viêm M1 thành đại thực bào kháng viêm M2, đồng thời giảm các cytokine và chemokine gây viêm Nhờ vào khả năng điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa và tăng cường tự thực bào, MSC hỗ trợ bảo vệ tế bào tụy nội sinh.
Hình 1.6 Cơ sở lý luận của phương pháp ghép tế bào gốc trên bệnh nhân đái tháo đường típ [118]
Khả năng biệt hóa thành tế bào tụy (IPC)
Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô (MSC) thành tế bào sản xuất insulin (IPC) được coi là cơ chế chính giúp cải thiện tình trạng tăng đường huyết trong bệnh tiểu đường type 2 Sự biệt hóa này được điều chỉnh bởi các yếu tố phiên mã quan trọng như Pdx-1, Ngn-3, NeuroD1, Pax4 và Pax6 Nghiên cứu của Chen và cộng sự đã chỉ ra rằng IPC biệt hóa không hoàn toàn có thể đạt được bằng cách nuôi cấy tế bào BM-MSC trong môi trường không có huyết thanh với nồng độ glucose cao Các nghiên cứu sau đó đã áp dụng nhiều tác nhân kích thích khác nhau để cải thiện hiệu quả biệt hóa Mortiscot và cộng sự đã thành công trong việc biệt hóa tế bào BM-MSC của con người thành IPC bằng adenovirus, trong khi Xie phát triển quy trình ba bước với Activin A, cho phép IPC giải phóng insulin phụ thuộc vào glucose Tế bào gốc trung mô từ dây rốn (UC-MSC) cho thấy tiềm năng biệt hóa vượt trội so với BM-MSC, với Chao và cộng sự chứng minh rằng WJ-MSC có thể biệt hóa thành IPC và thể hiện chức năng tế bào beta điển hình Tuy nhiên, thời gian tồn tại của các tế bào biệt hóa và các yếu tố kích thích đã hạn chế khả năng ứng dụng trong tái tạo đảo tụy Do đó, việc ghép trực tiếp MSC được xem là phương pháp an toàn hơn để tránh các tác dụng phụ không mong muốn Nghiên cứu trên chuột đã chỉ ra rằng khi MSC được truyền vào mô tụy bị tổn thương, chỉ một phần nhỏ tế bào dương tính với insulin được tìm thấy, không đủ để giải thích sự tái tạo của tế bào đảo tụy Ianus và cộng sự đã quan sát sự tái sinh đáng kể của tế bào beta trưởng thành ở chuột mắc bệnh tiểu đường sau khi cấy BM-MSC.
Nghiên cứu của Lecher và cộng sự (2003) cho thấy chỉ có 2 trên 100.000 tế bào beta có nguồn gốc từ tế bào gốc tủy xương (BM-MSC), cho thấy sự biệt hóa của BM-MSC thành tế bào beta là không đáng kể Trong khi đó, Choi và cộng sự (2003) đã phát hiện tế bào được dán nhãn GFP trong các đảo tụy sau khi ghép tủy xương, nhưng không có tế bào nào trong số này biểu hiện insulin Những dữ liệu này cho thấy nguồn gốc của tế bào tụy vẫn còn mơ hồ, và việc tái tạo tụy từ MSC vẫn là một chủ đề gây tranh cãi.
Ngoài khả năng tái tạo, tế bào gốc trung mô (MSC) còn có khả năng điều hòa miễn dịch, được gọi là các tế bào đặc quyền miễn dịch nhờ biểu hiện phức hệ hòa hợp miễn dịch (MHC) thấp và các phân tử đồng kích thích Tế bào lympho T, với vai trò chính trong đáp ứng miễn dịch thích ứng, rất quan trọng trong các bệnh tự miễn và thải ghép Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng MSC có thể ức chế sự tăng sinh của tế bào lympho T bằng cách tác động vào chuyển hóa năng lượng của chúng, thúc đẩy sự dung nạp tế bào T hoặc tăng cường sự phát triển của tế bào T điều tiết Thêm vào đó, MSC cũng ức chế sự tăng sinh của các tế bào miễn dịch khác.
B và MSC có khả năng ngăn chặn nhiều chức năng của hệ thống miễn dịch, bao gồm việc bài tiết cytokine và hoạt động của tế bào T cũng như tế bào giết người tự nhiên (NK) Sự ức chế miễn dịch từ MSC giúp giảm thiểu các quá trình tự miễn, từ đó giảm nguy cơ phá hủy tế bào beta trong tuyến tụy.
Nghiên cứu cho thấy tế bào gốc mesenchymal (MSC) có khả năng thúc đẩy sự sống sót của đảo tụy bằng cách chống lại tình trạng thiếu oxy và stress oxy hóa Một nghiên cứu năm 2017 của Chdravanshi và cộng sự chỉ ra rằng sau 48 giờ tiếp xúc với MSC từ thạch của Wharton, các tế bào đảo tụy có khả năng sống sót cao hơn và giảm chết theo chu trình so với điều kiện không có MSC Các tế bào đảo cũng thể hiện sự tăng cường biểu hiện của các cytokine chống viêm như TGF-β và TNF-α, đồng thời giảm các cytokine gây viêm, cho thấy MSC có tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương tế bào do stress oxy hóa Tổn thương này, do tăng đường huyết, được coi là yếu tố chính trong sự phát triển của bệnh tiểu đường Nghiên cứu thêm về khả năng chống oxy hóa của sản phẩm MSC có thể khẳng định tính hữu ích của việc ghép đồng với MSC để thúc đẩy sự sống sót của đảo tụy.
Tự thực bào (autophagy) đóng vai trò quan trọng trong nhiều bệnh lý như rối loạn thoái hóa thần kinh và bệnh tim mạch, đồng thời cần thiết để duy trì chức năng của tế bào beta đảo tụy Sự thiếu hụt và tăng cường tự thực bào đều ảnh hưởng đến cơ chế bệnh sinh của bệnh tiểu đường type 2 Một nghiên cứu của Zhao và cộng sự (2015) cho thấy việc nuôi cấy với BM-MSC đã giảm đáng kể độc tính do đường huyết cao ở tế bào INS-1, biểu hiện qua việc giảm khả năng sống, tăng apoptosis và suy giảm bài tiết insulin Nghiên cứu sau đó cũng chỉ ra rằng tác dụng bảo vệ của BM-MSC đối với tế bào INS-1 được trung gian bởi việc thúc đẩy sự hình thành tự thực bào.
Các kết quả này chứng minh rằng việc tăng cường khả năng tự trị của MSC là một chiến lược lý tưởng trong điều trị bệnh tiểu đường loại 2.
Cải thiện tình trạng kháng insulin
Rối loạn chức năng tế bào beta đảo tụy và kháng insulin (IR) thường xảy ra đồng thời trong bệnh tiểu đường type 2 (T2DM) Do đó, cơ chế điều trị T2DM không thể chỉ được giải thích qua khả năng của tế bào gốc trung mô (MSC) trong việc cải thiện chức năng tế bào beta Nghiên cứu của Si và cộng sự đã chỉ ra rằng việc cấy ghép tế bào gốc trung mô từ tủy xương (BM-MSC) có thể làm giảm mức đường huyết ở chuột bị tiểu đường do chế độ ăn nhiều chất béo, thông qua việc kích hoạt đường dẫn tín hiệu của thụ thể insulin (IRS).
1 Điều này dẫn đến tăng khả năng chuyển vị và biểu hiện của GLUT-4, cải thiện tình trạng IR qua trung gian BM-MSC trong các mô đích của insulin ngoại biên
Truyền MSC trong giai đoạn đầu của bệnh tiểu đường (7 ngày) có khả năng khôi phục chức năng tế bào, cải thiện tổn thương các đảo nhỏ tụy, thúc đẩy tế bào đến mô bị tổn thương và giảm tình trạng kháng insulin (IR) Ngược lại, truyền MSC ở giai đoạn muộn (21 ngày) chỉ cải thiện tình trạng IR mà không có tác động tích cực đến chức năng tế bào Nghiên cứu của Hughey và cộng sự cho thấy sự hấp thu glucose ở mô ngoại biên, như cơ xương và mô mỡ, tăng lên ở chuột được điều trị bằng MSC sau nhồi máu cơ tim, liên quan đến việc cải thiện tín hiệu insulin qua phosphoryl hóa Akt và biểu hiện GLUT-4 Tuy nhiên, cơ chế mà MSC cải thiện tình trạng IR vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn.
Tình trạng kháng insulin (IR) hiện nay được liên kết chặt chẽ với viêm mạn tính toàn thân, trong đó cytokine và chemokine như TNF-α và IL-1β từ đại thực bào mô mỡ (ATM) trong trạng thái viêm nhiễm M1 đóng vai trò quan trọng trong việc khởi phát viêm và phát triển IR Ngược lại, các đại thực bào M2 có tác dụng chống viêm đã được chứng minh có khả năng ngăn ngừa IR Nghiên cứu cho thấy MSC có tác dụng chống viêm bằng cách thúc đẩy M2 trong các vết thương và tổn thương thận Cụ thể, UC-MSC đã làm giảm tình trạng IR ở chuột T2DM bằng cách lập trình lại đại thực bào M1 thành M2, nhờ vào việc tăng cường biểu hiện IL-6, IL4R và phosphoryl hóa STAT6 Hơn nữa, môi trường từ MSC có nguồn gốc từ mô mỡ đã đảo ngược tình trạng kháng insulin trong các mô hình tế bào IR, cải thiện khả năng hấp thụ glucose thông qua tăng biểu hiện gen GLUT4 và giảm IL-6 cũng như PAI-1 Kết quả cho thấy UC-MSC cũng điều chỉnh biểu hiện NLRP3 trong các mô mục tiêu insulin ngoại biên, mở ra những hiểu biết mới về tác động của MSC đối với IR liên quan đến béo phì trong ĐTĐ T2.
1.3.2 Đặc điểm tế bào gốc trung mô trong bệnh lý đái tháo đường típ 2
Việc sử dụng tế bào gốc trung mô từ dây rốn trong ghép đồng loài đã được nghiên cứu, nhưng tính an toàn miễn dịch cho người nhận vẫn cần được xác minh Tế bào gốc tự thân từ tủy xương có sẵn và ít nguy cơ đào thải, đảm bảo an toàn cho bệnh nhân Tối ưu hóa đặc tính của BM-MSCs cụ thể cho bệnh sẽ cải thiện hiệu quả liệu pháp điều trị tiểu đường BM-MSCs từ bệnh nhân mắc các bệnh như Parkinson, ALS, ALL, HD và NHL có hình thái và khả năng biệt hóa tương tự tế bào gốc bình thường Tuy nhiên, BM-MSCs từ bệnh nhân mắc AML, suy thận mạn, rối loạn sinh tủy và viêm khớp dạng thấp cho thấy đặc tính sinh học bất thường và khả năng tăng sinh hạn chế Môi trường bệnh lý, đặc biệt là tiểu đường, làm thay đổi đặc điểm tế bào gốc, nhưng hình thái và dấu ấn bề mặt của chúng vẫn được duy trì Phân tích nhiễm sắc thể cho thấy sự ổn định, nhưng một nghiên cứu chỉ ghi nhận hơn một nửa mẫu bệnh nhân tiểu đường có thể nuôi cấy thành công, với tế bào của bệnh nhân trẻ duy trì khả năng tăng sinh ổn định đến 15 lần cấy chuyển Tính chất biệt hóa thành tế bào xương, sụn, mỡ không thay đổi trong môi trường tiểu đường.
Nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường tiểu đường đối với tế bào gốc mỡ, đặc biệt là tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (AD-MSCs), cho thấy đây là một chiến lược trị liệu hấp dẫn cho bệnh nhân tiểu đường type 2 Tuy nhiên, bệnh tiểu đường type 2 làm suy yếu các chức năng quan trọng của ASC, bao gồm khả năng sống sót, hoạt động tăng sinh, chức năng ty thể, cơ chế bảo vệ chống stress oxy hóa và khả năng bài tiết Ngoài ra, các rối loạn chuyển hóa cũng gây suy yếu cân bằng nội môi glucose và nhạy cảm insulin, thông qua việc điều hòa các mRNA và miRNA, có vai trò quan trọng trong chuyển hóa glucose và lipid.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
30 bệnh nhân được lựa chọn để tham gia nghiên cứu.
2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
Bệnh nhân tham gia nghiên cứu được lựa chọn qua quá trình khám sàng lọc tại bệnh viện Đa khoa quốc tế Vinmec, với các tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ rõ ràng.
- Tiêu chuẩn lựa chọn nhận vào giai đoạn chuẩn bị (10 tuần trước khi lấy tủy xương):
+Bệnh nhân cả nam và nữ được chẩn đoán xác định là ĐTĐ T2 theo
“Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường típ 2” của Bộ Y tế ban hành 2017.
+Bệnh nhân đang sử dụng các thuốc điều trị đái tháo đường (thuốc uống, thuốc tiêm và/hoặc Insulin) với liều lượng ổn định trong 10 tuần.
+Tại thời điểm sàng lọc HbA1C ≥ 7,5% và ≤ 9% và FPG < 10 mmol/L.
Bệnh nhân không mắc các bệnh cấp tính nặng cần điều trị và đã đồng ý sử dụng dịch vụ ghép tế bào gốc sau khi được bác sĩ giải thích về lợi ích cùng các nguy cơ, rủi ro có thể xảy ra.
- Tiêu chuẩn nhận vào truyền tế bào gốc sau giai đoạn chuẩn bị (Tuần 0):
+ Bệnh nhân tuân thủ điều trị sử dụng thuốc trong 10 tuần chuẩn bị với tỷ lệ tuân thủ điều trị từ 80%.
- Bệnh nhân có một trong các tiêu chuẩn dưới đây sẽ bị loại khỏi nghiên cứu tại Tuần -10 và Tuần 0 :
+ Bệnh nhân đang nhiễm trùng cấp tính, ung thư, bệnh tim, phổi, suy thận, suy gan nặng.
Bệnh nhân mắc các bệnh lý khác hoặc có điều kiện, hoàn cảnh đặc biệt có thể gặp khó khăn trong việc tuân thủ điều trị nghiên cứu, theo đánh giá của các nghiên cứu viên.
+ Các bệnh nhân có rối loạn đông máu có ý nghĩa lâm sàng.
+ Tiền sử dị ứng với thuốc gây mê, gây tê, kháng sinh.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, nhãn mở, đơn nhóm, so sánh trước và sau điều trị.
2.2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.2.1 Địa điểm: Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec
2.2.2.2 Thời gian: Từ tháng 11/2017 đến tháng 03/2020
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu Bước 1: Thu tuyển bệnh nhân (theo quy trình lựa chọn đối tượng nghiên cứu tại mục 2.1.2) thực hiện bởi các bác sỹ điều trị
Bước 2: Thu thập mẫu tủy xương
Bệnh nhân đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu sẽ được lấy tủy xương từ gai chậu trước trên Quy trình bao gồm gây mê qua mask thanh quản và gây tê tại chỗ Phẫu thuật viên sẽ hút khoảng 30-35 ml tủy xương, được lưu trữ trong ống chuyên dụng có hòa lẫn Heparin theo tỷ lệ 1:1.
Bước 3: Phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương để thu toàn bộ các tế bào đơn nhân và nuôi cấy
Khối tế bào đơn nhân được tách ra bằng phương pháp ly tâm tỷ trọng với dung dịch Ficoll Hypaque Trong quá trình này, huyết tương sẽ nổi lên trên cùng ống Falcon, trong khi lớp hồng cầu có tỷ trọng lớn nhất sẽ lắng xuống đáy Lớp phân cách màu trắng nằm ngay dưới huyết tương được hút nhẹ nhàng bằng pipet nhựa vô trùng, tạo ra khối tế bào đơn nhân để phục vụ cho việc nuôi cấy.
Tại Phòng Tế bào gốc thuộc Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec, các chuyên viên và kỹ thuật viên đang thực hiện nghiên cứu về tế bào gốc.
Bước 4: Đánh giá chất lượng tế bào trong quá trình nuôi cấy
- Đánh giá khả năng tăng sinh
Sau khi phân lập, tế bào sẽ được nuôi cấy để đạt đủ số lượng truyền cho bệnh nhân, với liều lượng 1x10^6 tế bào/kg cân nặng Để đánh giá khả năng tăng sinh của BMMSCs, một phần tế bào sẽ được nuôi cấy riêng và đánh giá qua chỉ số "Thời gian nhân đôi tế bào" (PDT) Tế bào được nuôi cấy ổn định từ passage 3 (P3) đến passage 7 (P7) với mật độ 5000 tế bào/cm² trong các chai T25, lặp lại 3 lần cho mỗi mẫu trong điều kiện nuôi cấy 5% O2 và 37°C Khi đạt 80% độ che phủ, tế bào sẽ được thu lấy để xác định tỷ lệ sống chết và đếm số lượng tế bào.
• Số lần nhân đôi tế bào = log 10 ( tổng số tế bàothuhoạch / số tế bào gieo cấy ) log 10 2( )
Thời gian nuôi cấy Số lần nhân đôi
• Tỷ lệ tế bào sống = lượng tế số bào sống x 100(%)
- Định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương bằng phương pháp đếm tế bào qua dòng chảy
Tế bào gốc trung mô (MSC) từ tủy xương được nuôi cấy và định danh tại P3 bằng phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy sử dụng máy Navios Flow Cytometer của Beckman Coulter Ít nhất 10^6 tế bào được nhuộm với các kháng thể CD73, CD90, CD105 cùng với các kháng thể âm tính như CD34, CD45, CD11b, CD14, CD19, CD79α và HLA-DR (Human MSC Analysis Kit, BD Biosciences) Kết quả cho thấy tỷ lệ MSC với CD73, CD90, CD105 đạt trên 95%, trong khi các dấu ấn âm tính có giá trị nhỏ hơn 2%.
Thực hiện tại phòng QC, Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec
Đánh giá khả năng biệt hóa đa dòng thành tế bào sụn, xương và mỡ được thực hiện tại lần cấy chuyển thứ 4, với tế bào được nuôi cấy trong đĩa 12 giếng Môi trường biệt hóa từ Miltenyi Biotec được bổ sung cho các dòng tế bào xương, sụn và mỡ khi mức độ phủ bề mặt đạt 80% Các mẫu tế bào biệt hóa được theo dõi hàng ngày và nhuộm tế bào theo các khoảng thời gian quy định.
Sau 7-10 ngày, tế bào xương sẽ được nhuộm bằng thuốc Alizarin Red S, giúp xác định sự kết hợp chọn lọc với canxi phosphate, một thành phần chính do các tế bào xương đã biệt hóa tạo ra.
• Tế bào sụn: sau 15- 20 ngày, sử dụng thuốc nhuộm Acian blue 8GX nhạy cảm với proteoglycan và glycosaminoglycan sulface trong mẫu mô sụn tạo thành
Sau khoảng 10 đến 13 ngày, tế bào mỡ có thể được nhuộm bằng thuốc Oil red O, cho phép màng thẩm thấu vào bên trong các không bào chứa giọt mỡ đã được biệt hóa.
- Đánh giá mức độ bất thường nhiễm sắc thể bằng việc xây dựng nhiễm sắc thể đồ (Karyotyping).
Để phân tích bộ nhiễm sắc thể cho bệnh nhân, cần ít nhất 2x10^6 tế bào BM-MSCs được ủ với Colcemid để giữ các tế bào ở trạng thái phân bào Tế bào sau đó được thu thập bằng enzyme phân tách và ly tâm để thu cặn tế bào Tiếp theo, tế bào được cố định bằng dung dịch Carnoy và nhuộm nhiễm sắc thể D-Band để lập công thức NST Sau khi xử lý bằng các phương pháp như trypsin, dung dịch kiềm, nhiệt độ cao và muối, các vùng dị nhiễm sắc và nhiễm sắc thực sẽ bắt màu khác nhau, tạo nên các vùng băng đặc trưng cho từng NST Dựa vào hình thái, kích thước và vùng băng đặc hiệu, công thức NST được lập theo quy định của Hệ thống di truyền tế bào học người (ISCN) nhằm phát hiện bất thường về số lượng và cấu trúc NST.
Tại phòng Gen của Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec, bước quan trọng thứ năm là kiểm định tính an toàn của tế bào trước khi truyền cho bệnh nhân.
Xét nghiệm Mycoplasma sử dụng Kit MycoAlertTM để phát hiện Mycoplasma trong mẫu nuôi cấy tế bào, tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất Lonza, Mỹ Enzyme từ quá trình dung giải Mycoplasma xúc tác chuyển hóa ADP thành ATP, và ATP sau đó được chuyển đổi thành tín hiệu ánh sáng nhờ enzyme luciferase Việc đo mức độ ATP trước và sau khi thêm cơ chất cho phép xác định sự hiện diện của Mycoplasma Kit MycoAlertTM cho phép tính toán giá trị X = B/A, trong đó A là độ phát quang sinh học trước và B là sau khi bổ sung cơ chất Kết quả được đánh giá theo ngưỡng [0,9 – 1,2]: X < 0,9 là âm tính, 0,9 < X < 1,2 là nghi ngờ, và X > 1,2 là dương tính.
Thực hiện tại phòng QC, Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec
Xét nghiệm nội độc tố Endotoxin
Để xác định nồng độ nội độc tố (endotoxin) trong mẫu, phương pháp sử dụng phản ứng tạo màu của Limulus Amebocyte Lysate (LAL) kết hợp với đo quang phổ Kit phát hiện nội độc tố được sử dụng trên hệ thống máy kiểm tra nội độc tố của hãng Charlie River (Endosafe- PTS 100), thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Giá trị đo được được biểu thị dưới dạng chỉ số EU (endotoxin unit), đã được điều chỉnh theo độ pha loãng Đặc biệt, hàm lượng nội độc tố trong sản phẩm tế bào không được vượt quá 5 EU/kg cân nặng khi truyền qua đường tĩnh mạch ngoại vi và động mạch tụy.
Thực hiện tại phòng QC, Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec.
Xét nghiệm cấy khuẩn cấy nấm
Mẫu cấy khuẩn và cấy nấm được gửi đến Khoa xét nghiệm của Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec để thực hiện và nhận kết quả trong khoảng thời gian từ 3 đến 5 ngày.
Các sản phẩm tế bào gốc trung mô từ tủy xương của bệnh nhân đái tháo đường típ 2 cần phải đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn chất lượng trước khi được truyền.
Để đạt được liều truyền tối ưu là 1x10^6 tế bào/kg cân nặng, cần truyền với thể tích 20 ml qua đường tĩnh mạch ngoại vi và 10 ml khi truyền vào động mạch tụy.
- Tỉ lệ tế bào sống trên 70% (đánh giá bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue).
- Không nhiễm vi khuẩn, vi nấm, và mycoplasma.
- Có đánh giá các biểu hiện bề mặt đạt tiêu chuẩn của tổ chức ISCT.
- Có nồng độ nội độc tố nằm trong giới hạn cho phép truyền cho bệnh nhân (hàm lượng nội độc tố không được lớn hơn 5 EU/kg cân nặng).
- Đảm bảo sự ổn định về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể theo khuyến cáo của ISCN
Bước 6: Truyền tế bào cho bệnh nhân