NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
2.1.1 Tôm thẻ chân trắng ( Litopenaeus vannamei )
Nghiên cứu này sử dụng tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) được cung cấp từ cơ sở nuôi tôm tại Từ Sơn, Bắc Ninh, với tuổi thọ 30 ngày và trọng lượng từ 1,2 đến 1,5 g Tôm được chọn lựa đồng đều về kích thước và trọng lượng Trước khi tiến hành thí nghiệm, tôm được nuôi trong phòng thí nghiệm với các điều kiện tối ưu, bao gồm nhiệt độ từ 26-28°C, pH 7,5-8,5 và độ mặn 16‰.
Chủng vi khuẩn B aquimaris SH6, được phân lập từ ruột tôm thẻ chân trắng theo nghiên cứu của Ngo và cộng sự năm 2016, nổi bật với bào tử có màu vàng cam đặc trưng nhờ khả năng sản sinh carotenoid.
Hình 2.1: Bào tử B aquimaris SH6.
A - Bột bào tử B aquimaris SH6 (3 × 10 11 CFU/g) màu đỏ cam B - Hình ảnh hiển vi quang học bào tử B aquimaris SH6 [48].
Thức ăn cho tôm thẻ chân trắng trong nghiên cứu này được sản xuất bởi hãng Tomboy - Sketting tại Việt Nam, với kích thước phù hợp cho từng độ tuổi và kích thước của tôm (Hình 2.2).
Hình 2.2: Thức ăn cho tôm thẻ chân trắng.
A - Thức ăn chưa trộn bào tử B - Thức ăn đã trộn bào tử và bao dầu
2.1.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm:
- LB (Luria Bertani) dạng lỏng, pH 7,5-8,5: Peptone (15 g/l), cao nấm men (5 g/l), NaCl (5 g/l) (Trung Quốc).
- LB (Luria Bertani) dạng rắn, pH 7,5-8.5: Peptone (15 g/l), cao nấm men (5 g/l), NaCl (5 g/l), thạch (16-18 g/l) (Trung Quốc).
- MRS dạng rắn, pH 5,6 ± 0,2 (Oxoid, Anh): 56 g/l
Môi trường sinh bào tử:
- DSM (Difco Sporulation medium), pH 7,5-8,5: Nutrien Broth (8 g/l) (Merck, Đức); KCl (1 g/l); MgSO4.7H2O (0,25 g/l); Ca(NO3)2 1M (1 ml/l); MnCl2
0,01M (1 ml/l); FeSO4 1 mM (1 ml/l) (Trung Quốc).
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật và hóa sinh học phải đạt tiêu chuẩn chất lượng cao, được cung cấp bởi các hãng uy tín như Merck (Đức), BioBasic (Canada), Enzynomics (Hàn Quốc) và Quiagen (Đức) Các hóa chất này đặc biệt quan trọng trong việc xác định hoạt tính enzyme và thực hiện các thí nghiệm sinh học phân tử Dưới đây là danh sách một số hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu.
Hóa chất, thành phần phản ứng tạo cDNA, PCR và Real-time PCR:
- Phản ứng tạo cDNA sử dụng enzyme phiờn mó ngược M-MLV, V = 20 àl
Thành phần phản ứng Thể tích
M-MLV Reverse Transcriptase 1 àl dNTP: 2 àl
Khuụn DNA/cDNA (100-150 ng/àl): 2 àl
Thành phần phản ứng Thể tích
10X nTaq buffer: 2 àl nTaq DNA polymerase: 0,2 àl dNTP (2mM): 2 àl
Khuụn DNA/cDNA (50-100 ng/àl): 2 àl
- Phản ứng Real-time PCR , V = 20 àl
Thành phần phản ứng SYBR
Taq-man Probe TOPreal TM qPCR 2X PreMIX (SYBR Green): 10 àl
TOPreal TM One-step 4X RT qPCR Kit (TaqMan Probe): 5 àl
Fw (5 pmol/àl): 1 àl 1 àl
Rv (5 pmol/àl): 1 àl 1 àl
Nước khử RNA: 6 àl 9,8 àl
Khuụn DNA/cDNA (50-100 ng/àl): 2 àl 2 àl
Hóa chất cho đánh giá hoạt tính enzyme PO (Phenoloxydase) [30]:
- Đệm cacodylate: 0,01M Natri cacodylate; 0,45M NaCl; 0,01M CaCl 2 ; 0,26M MgCl2, pH 7,0.
- Trypsin: 100 àg/ml trong đệm cacodylate
- L-DOPA (L-3-4-dyhydroxyphenylalanine): 3 mg/ml trong đệm cacodylate
Hóa chất cho đánh giá hoạt tính enzyme SOD (Superoxidase dimutase) [46]:
- Đệm phosphate: Dung dịch đệm K 2 HPO4 216 mM, pH 7,8
- Pha hỗn hợp dung dịch phản ứng đo hoạt tính enzyme SOD: Đệm phosphate (K2HPO4 216 mM, pH 7,8); EDTA 10,7 mM pH 8,5; Cytochrome C 1,1 mM; xanthin 0,108 mM; xanthin oxidase (XOD).
Hóa chất tách chiết carotenoid: Methanol và chloroform [34]
2.1.6 Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ: Bình tam giác (dung tích 50 ml, 200 ml, 1l), đĩa petri, que cấy, pipet, cuvet, đĩa 96 giếng, ống falcon (15 ml, 50 ml), ống eppendoft (1,5 ml, 2 ml), ống PCR,…
Trong nghiên cứu vi sinh vật, các thiết bị quan trọng bao gồm tủ nuôi cấy vi sinh vật, tủ an toàn sinh học, nồi hấp khử trùng, và lò vi sóng Ngoài ra, bể ổn nhiệt, máy lắc, máy ly tâm, máy PCR, và máy Real-time PCR cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình thí nghiệm Các thiết bị quang phổ như máy quang phổ UV-Vis và máy quang phổ Nano DropOne Microvolume UV-Vis hỗ trợ phân tích mẫu hiệu quả Cuối cùng, các loại tủ lạnh (4°C, -20°C, -80°C) là cần thiết để bảo quản mẫu và hóa chất trong điều kiện tối ưu.
Phương pháp
2.2.1 Chuẩn bị bào tử B aquimaris SH6 và tách chiết carotenoid
Bào tử B aquimaris SH6 được tạo ra từ chủng vi khuẩn phân lập từ ruột tôm thẻ chân trắng Quy trình tạo bào tử bắt đầu bằng việc cấy tế bào sinh dưỡng B aquimaris SH6 trên đĩa thạch LB và ủ ở 35°C trong 16 giờ Sau đó, khuẩn lạc màu vàng cam được cấy vào môi trường LB lỏng và nuôi lắc để tạo giống cấp 1, tiếp tục cấy chuyển để tạo giống cấp 2, và cuối cùng là nuôi trong môi trường DSM lỏng để tạo bào tử Sau 48 giờ nuôi lắc, hiệu suất hình thành bào tử được kiểm tra bằng kính hiển vi cho đến khi đạt trên 95% Bào tử sau đó được ly tâm, rửa bằng dung dịch NaCl 0,9%, và bảo quản ở -20°C Để xác định nồng độ bào tử, mẫu bào tử được pha loãng và cấy trên đĩa thạch để đếm số khuẩn lạc hình thành, từ đó tính toán nồng độ bào tử (CFU/ml).
- CFU/ml: số tế bào vi khuẩn trong 1ml mẫu
- C: Tổng số tế bào vi khuẩn đếm được trên mỗi đĩa ở độ pha loãng tương ứng (25-250 khuẩn lạc)
- ni: Số đĩa petri cấy tại độ pha loãng tương ứng
- di: Hệ số pha loãng tương ứng
- vi: Thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa tại độ pha loãng tương ứng
Môi trường nuôi cấy cùng với các dụng cụ và thiết bị được khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút, nhằm loại bỏ hoàn toàn vi sinh vật nhiễm từ môi trường bên ngoài.
Để tách chiết carotenoid từ tế bào SH6, các tế bào sinh dưỡng B aquimaris SH6 được cấy trên đĩa thạch LB và ủ ở 35°C trong 16 giờ Sau đó, các khuẩn lạc màu vàng cam được chuyển vào môi trường LB lỏng để nuôi cấy tạo giống cấp 1, tiếp theo là giống cấp 2 Quá trình nuôi cấy diễn ra ở nhiệt độ 33-35°C và sau 24 giờ, sinh khối được thu bằng ly tâm Phương pháp tách chiết carotenoid tham khảo từ các nghiên cứu trước, tuy nhiên, để tránh độc tính cho tôm, dung môi tách chiết được sử dụng là dầu gan cá thay vì hỗn hợp methanol:chloroform Sinh khối SH6 được đông lạnh ở -80°C, sau đó được phá tế bào bằng máy Sonicator Nồng độ astaxanthin trong dịch chiết carotenoid được xác định qua quang phổ ở bước sóng 480 nm và dịch chiết được bảo quản ở -20°C cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 2.3: Đường chuẩn nồng độ Astaxanthin.
2.2.2 Chuẩn bị thức ăn cho tôm Đầu tiên, thức ăn của tôm được khử trùng ở 121°C, 15 phút để diệt toàn bộ các probiotic dạng Bacillus sp có sẵn và các vi sinh vật nhiễm trong quá trình vận chuyển và bảo quản thức ăn Sau đó, tiến hành trộn thức ăn theo các nhóm thí nghiệm (theo phần Kế hoạch thí nghiệm) Nhóm “ĐC” là thức ăn tôm đã khử trùng, không bổ sung bất kỳ thành phần Carophyll hay bào tử Nhóm “Carophyll”: hòa tan 0,5 g bột Carophyll pink vào 10 ml DW (70°C), phun đều lên bề mặt 100 g thức ăn đã khử trùng để đạt nồng độ astaxanthin cuối cùng là 0,5 mg/g thức ăn Nhóm “SH6 carotenoid”: dựa vào nồng độ carotenoid đã xác định (xem phần 2.2.1) pha dịch chiết carotenoid trong 10ml dầu gan cá và phun đều lên bề mặt 100 g thức ăn đã khử trùng để đạt nồng độ carotenoid cuối cựng là 5 àg/g thức ăn Nhúm “SH6 spore”: hũa tan dịch lưu bào tử SH6 trong 10 ml DW, phun đều lên bề mặt 100 g thức ăn đã khử trùng Đối với các nhóm: “ĐC”, “Carophyll” và “SH6 spore”, thức ăn sau khi trộn với các thành phần trên sẽ được bao phủ bằng 10 ml dầu gan cá để giảm thiểu tối đa hiện tượng viên thức ăn bị tan ra trong nước nuôi tôm Riêng nhóm “SH6 carotenoid” không cần tiến hành bao dầu do đã sử dụng dầu gan cá làm dung môi chiết và pha loãng carotenoid Thức ăn đã bao dầu sẽ được mã hóa, chia nhỏ và bảo quản ở -20°C.
2.2.3 Bố trí các nhóm thi ghiệm và quy trình nuôi tôm Để đánh giá khả năng lưu trú của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm và hoạt tính probiotic của chúng đối với tôm thẻ chân trắng (L vannamei) với các chỉ số cụ thể như: tăng trọng lượng, tăng hàm lượng astaxanthin, màu sắc và các chỉ tiêu miễn dịch, chúng tôi thiết kế và thực hiện thí nghiệm với 4 nhóm thí nghiệm gồm: “ĐC”,
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng "Carophyll", "SH6 spore" và "SH6 carotenoid" trong thời gian 28 ngày, với các thời điểm thu mẫu và số lượng mẫu được mô tả chi tiết trong phần thiết kế thí nghiệm Mỗi nhóm thí nghiệm gồm 70 tôm được nuôi trong 2 bể tại phòng Sinh học Nano và Ứng dụng - Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ enzyme và protein - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, với nhiệt độ được duy trì ở 26-28°C và pH từ 7,5-8,5 Để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho tôm, bể nuôi được sục khí liên tục và nước được lọc định kỳ, thay 30% mỗi 5 ngày Quy trình kỹ thuật nuôi tôm được tham khảo từ tài liệu "Kỹ thuật nuôi tôm thẻ chân trắng" của Thái Bá Hồ và các nghiên cứu liên quan, trong khi mô hình bể nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm được thể hiện trong Hình 2.4.
Hình 2.4 : Mô hình bể nuôi tôm trong quy mô phòng thí nghiệm
Mỗi bể tôm có dung tích 45 lít, chứa 25 lít nước với độ mặn 16‰, được vận hành bởi hệ thống sục khí liên tục để đảm bảo đủ oxy hòa tan cho tôm trong suốt quá trình nuôi Hệ thống bơm tuần hoàn được lắp đặt để lọc nước trong bể nuôi tôm, loại bỏ chất cặn bã như phân tôm và thức ăn thừa, nhưng cần tắt bơm trong 1 giờ đầu khi cho tôm ăn để tránh làm mất thức ăn Tôm được cho ăn trong 28 ngày với thức ăn đã mã hóa, 3 lần/ngày, mỗi lần từ 2-3 gram Việc theo dõi tình trạng sức khỏe, vận động và khả năng ăn của tôm hàng ngày là cần thiết để kịp thời phát hiện những thay đổi về sức khỏe và có điều chỉnh phù hợp.
Hình 2.5: Bể nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm.
A - Đại diện hệ thống các bể nuôi tôm quy mô phòng thí nghiệm B - Đại diện một bể nuôi tôm có hệ thống sục khí và bơm
Phương pháp và nguyên tắc thu mẫu:
Tiến hành thu mẫu tôm ngẫu nhiên tại các thời điểm xác định, tùy thuộc vào tính chất thí nghiệm, với 03 mẫu tôm cho mỗi nhóm thí nghiệm Sử dụng bộ dụng cụ đã khử trùng như dao, kéo và kẹp để giải phẫu tôm một cách cẩn thận Các bộ phận cần thiết được cho vào ống eppendorf 2 ml vô trùng và xử lý ngay lập tức hoặc bảo quản lạnh ở -80°C để đảm bảo duy trì tính chất mẫu.
2.2.4 Xác định số lượng B aquimaris SH6 và tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm
Trong quá trình nuôi tôm, mẫu tôm được thu tại các thời điểm 0, 1, 3, 7, 14 và 28 ngày, ký hiệu là 0 D, 1 D, 3 D, 7 D, 14 D và 28 D Sau đó, ruột tôm được giải phẫu và thu vào ống eppendorf 2 ml vô trùng, giã nhuyễn bằng que giã vô trùng, thêm 1 ml NaCl 0,9% và để 15 phút Tiếp theo, dung dịch được vortex trong 1 phút để hòa tan vi sinh vật trong ruột tôm Dịch đồng nhất chứa vi sinh vật được pha loãng đến độ pha loãng 10^4 và cấy trải 100 µl dịch pha loãng trên đĩa thạch LB, với mỗi nồng độ được lặp lại.
Số khuẩn lạc thu được trên đĩa thạch là cơ sở để xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm, trong đó có khuẩn lạc nghi ngờ B aquimaris SH6 được kiểm tra qua phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA Quá trình phân lập các chủng vi sinh vật hiếu khí được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên đĩa thạch và tách chiết DNA tổng số bằng bộ Kit Anapure Bacterial DNA Mini Kit Chất lượng DNA được kiểm tra bằng điện di gel electrophoresis và định lượng bằng máy quang phổ Nano DropOne Sản phẩm DNA tách chiết được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S rRNA, với kích thước sản phẩm đạt 1500 bp Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, giải trình tự 16S rRNA được thực hiện và so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen NCBI, chọn những mẫu có độ tương đồng > 98% để xác định loài tương ứng Từ kết quả giải trình tự và phương pháp đếm khuẩn lạc, tỷ lệ phần trăm mỗi chủng vi sinh vật có thể được phân tích.
2.2.5 Đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm Để đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm, thí nghiệm được thiết kế với 1 bể nuôi tôm (30 tôm), nồng độ bào tử B aquimaris SH6 1 ×
Thức ăn chứa 10^8 CFU/g bào tử B aquimaris SH6 được áp dụng theo điều kiện nuôi tôm như đã mô tả ở Mục 2.2.2 và 2.2.3, cùng với mô hình Hình 2.4 Sau khi thu ruột tôm và tách chiết RNA tổng số, tỷ lệ % nảy mầm được đánh giá ngay sau khi cho ăn Trong ngày đầu tiên, chỉ nên cho tôm ăn 2-3 g thức ăn, sau đó duy trì điều kiện nuôi trong 7 ngày để theo dõi sự thay đổi nảy mầm của bào tử trong ruột tôm Mẫu được thu tại các thời điểm xác định để đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử B aquimaris SH6 bằng cách sử dụng chỉ thị sinh học phân tử gen BaqA-SH6, gen này mã hóa cho enzyme α-amylase, không biểu hiện ở giai đoạn bào tử, giúp đặc trưng cho sự nảy mầm Tuy nhiên, thông tin về gen α-amylase của B aquimaris còn hạn chế, đặc biệt là đối với loài mới B aquimaris SH6 Do đó, nghiên cứu này nhằm xác định trình tự gen BaqA-SH6 để phục vụ cho phản ứng Realtime-PCR đánh giá mức độ biểu hiện của gen này.
2.2.5.1 Thiết kế mồi đặc hiệu nhân đoạn gen α-amylase ở B aquimaris SH6
Dựa vào đoạn trình tự gen BaqA (mã hóa enzyme α-amylase) của B aquimaris MKSC 6.2 (Mã: JN797599.1) được công bố bởi Puspasari và cộng sự năm 2013, chúng tôi đã sử dụng trình tự gen BaqA của Anoxybacillus cùng phần mềm SnapGene để xác định đoạn trình tự tương đồng nhất Anoxybacillus spp thuộc họ GH13 là các chủng Bacillus sp có nhiều sự tương đồng về hệ gen với B aquimaris.
Hình 2.6: Trình tự tương đồng đoạn gen BaqA giữa chủng B aquimaris MKSC
6.2 và một số chúng Anoxybacillus spp.
Trình tự tương đồng này là cơ sở để thiết kế cặp mồi suy biến nhân đoạn gen
BaqA trong B aquimaris SH6 cho thấy sự hiện diện của một số nucleotide không đặc hiệu ở hai đầu đoạn trình tự tương đồng Để đánh giá độ đặc hiệu của cặp mồi suy biến, phản ứng PCR đã được thực hiện theo các bước được mô tả trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1: Điều kiện của PCR nhân đoạn gen BaqA
Các bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Biến tính ban đầu 95°C 10 phút 1 chu kỳ
Để xác định chính xác mồi BaqA đặc hiệu cho chủng B aquimaris SH6, sản phẩm PCR từ chủng này được chèn vào vector p-TOP TA V2 (Enzynomics, Hàn Quốc) và kéo dài ở nhiệt độ 72°C trong 5 phút cho mỗi chu kỳ Vector tái tổ hợp này chứa đoạn gen cần thiết để nghiên cứu.