KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 63
TÁCH CHIẾT ADN PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA MẸ 63
3.1.1 Tách chiết ADN tự do trong máu ngoại vi của mẹ
Sau khi tách ADN tự do trong máu ngoại vi của mẹ bằng hai phương pháp nhiệt độ và bộ kít Qiagen, chúng tôi đã tiến hành đo nồng độ của ADN phôi thai tự do được tách chiết.
Bảng 3.1 Nồng độ ADN ( ng/àl) của phương phỏp tỏch bằng nhiệt và phương pháp tách bằng bộ Kít Qiagen
Bằng nhiệt Qiagen STT Mã
Kết quả từ bảng số liệu cho thấy nồng độ ADN tách chiết bằng phương pháp nhiệt thấp thấp hơn đáng kể so với phương pháp sử dụng bộ kít Qiagen (QIAamp ADN blood Mini Kit, code:51106) cải tiến Tuy nhiên, độ tinh sạch của ADN tách chiết bằng bộ kít Qiagen lại cao hơn.
Trong quá trình thực nghiệm xây dựng quy trình tách chiết ADN tự do, chúng tôi đã áp dụng nhiều bộ kít khác nhau, bao gồm bộ Genomic ADN purification Kits của Promega (Mỹ), Genomic ADN Isolation Kit của Nergen (Canada) và GenElute™ Mammalian Genomic ADN Miniprep Kit của Sigma (Đức).
AccuPrep® Genomic ADN Extraction Kit của Bioneer (Hàn Quốc), G-spin™ Total
Bộ kít ADN Extraction Mini Kit của Intront (Hàn Quốc) thường cho kết quả không ổn định và nồng độ ADN thu được rất thấp, điều này khiến chúng không phù hợp cho việc tách ADN tự do trong máu ngoại vi của mẹ.
Phương pháp tách ADN tự do bằng kỹ thuật biến tính ở nhiệt độ 99 o C trong 5 phút cho thấy nồng độ trung bình chỉ đạt 0,81±0,18 ng/µl, trong khi tách chiết bằng bộ kít Qiagen cho nồng độ cao hơn, đạt 3,95±0,53 ng/µl Chúng tôi đã cải tiến quy trình tách chiết ADN tự do bằng cách sử dụng 400µl huyết tương, dựa trên nghiên cứu của Lo và cộng sự (1998) khuyến nghị sử dụng từ 400µl đến 700µl mẫu Tác giả Zolotukhina và cộng sự (2005) cũng đã sử dụng 500µl mẫu huyết tương với bộ Diatom ADN Kit của IsoGene (Nga) Bên cạnh đó, chúng tôi đã thay đổi dung môi hòa tan ADN sau khi tách chiết từ TE buffer sang H2O để tránh ảnh hưởng của muối đến phản ứng PCR, với dung môi H2O được ủ ấm trước ở nhiệt độ 70 o C.
Gen SRY, nằm trên nhiễm sắc thể Y, là gen đặc trưng cho thai nhi nam Nghiên cứu này tập trung vào việc kiểm tra sự hiện diện của ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ thông qua gen SRY.
Để xác nhận thành công trong việc tách ADN, chúng tôi đã sử dụng gen housekeeping GAPDH làm gen nội kiểm chứng Sự xuất hiện của gen này chứng tỏ rằng quá trình tách ADN đã diễn ra thành công.
Sau khi tách mẫu ADN, quy trình nhân gen sẽ được thực hiện bằng kỹ thuật Nested PCR cho gen SRY, đồng thời áp dụng PCR thông thường cho gen GAPDH.
Nhiều tác giả trên toàn thế giới đã nghiên cứu và chứng minh sự hiện diện của ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ Việc phát hiện ADN phôi thai tự do này không chỉ khẳng định sự tồn tại của nó mà còn mở ra cơ hội sử dụng để sàng lọc và chẩn đoán các bệnh di truyền.
Nghiên cứu của Lo và cộng sự (1998) đã sử dụng gen SRY và gen GAPDH để phát hiện và định lượng ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ Tương tự, Bombard và cộng sự (2011) cũng áp dụng gen SRY để xác định sự hiện diện của ADN phôi thai tự do trong máu mẹ.
Nghiên cứu của Akolerka và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng việc tách chiết ADN phôi thai tự do cho phép chẩn đoán bất đồng nhóm máu Rh giữa mẹ và con, đồng thời xác định giới tính thai nhi thông qua gen SRY Gen SRY đã trở thành một marker phân tử phổ biến để kiểm tra sự hiện diện của ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ.
Hình 3.1 Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu
M: Marker 100bp- Thang ADN với band nhỏ nhất là 100bp; Âm: Chứng âm nước cất; Dương: Chứng dương nam giới; Mẫu nghiên cứu 825 Bên trái là các mẫu nhân gen
SRY kích thước sản phẩm 198bp Bên phải là các mẫu nhân gen GAPDH với kích thước sản phẩm 97bp.
Các mẫu chứng âm cho gen SRY và gen GAPDH không xuất hiện băng vạch, cho thấy không có nhiễm bẩn trong quá trình PCR Mẫu chứng dương và mẫu nghiên cứu số 825 đều có băng ở cả sản phẩm gen SRY và gen GAPDH.
Hình 3.1 cho thấy các băng điện di rõ nét, với kích thước sản phẩm PCR phù hợp lý thuyết Kết quả điện di của gen SRY cho thấy một số mẫu không có băng vạch 198bp, trong khi các mẫu khác có Tuy nhiên, tất cả các mẫu đều xuất hiện băng vạch 97bp của gen GAPDH, chứng tỏ ADN đã được tách chiết thành công Kết quả này khẳng định rằng trong máu mẹ mang thai có ADN phôi thai tự do lưu hành.
Hình 3.2 Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu từ 811 - 825
M: Marker 100bp- Thang ADN với band nhỏ nhất là 100bp; Các giếng từ 811 đến
Các mẫu nghiên cứu 825 bao gồm mẫu gen SRY với kích thước sản phẩm PCR là 198bp và mẫu gen GAPDH có kích thước sản phẩm PCR là 97bp.