SÂM NGỌC LINH VÀ VÙNG PHÂN BỐ
Giới thiệu về sâm Ngọc Linh
Tên khoa học: Panax vietnamensis Ha et Gruskv., thuộc chi Panax, họ Ngũ gia bì Araliaceae.
Tên gọi: sâm Ngọc Linh, sâm Việt Nam, sâm khu năm (sâm K5), thuốc dấu, Củ Ngải rợm con (Xê Đăng), sâm Cang (sâm đắng) …
Sâm Ngọc Linh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973, đến năm
Vào năm 1985, loài SNL được công bố là một loài mới và hiện chỉ được phát hiện ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum, được coi là loài đặc hữu của Việt Nam Sự phát hiện này có ý nghĩa quan trọng về mặt phân bố địa lý, khi lần đầu tiên biên giới của chi Nhân sâm được xác định ở phía nam tại 15 độ vĩ Nam và 108 độ kinh Đông, đánh dấu giới hạn xa nhất về phía nam của chi Panax trên toàn cầu trong vùng khí hậu nhiệt đới Hiện tại, SNL đang ở trong tình trạng “cực kỳ bị nguy cấp” (mức phân hạng: CR A1 c,d) và được xếp vào danh sách những loài quý hiếm cần được bảo tồn.
- Đặc điểm sinh trưởng và tái sinh của SNL
Cây thân thảo này là loại cây sống lâu năm, với lá rụng theo mùa Vào mùa đông, thân khí sinh lụi đi, để lại vết sẹo trên thân rễ Từ tháng 1 đến tháng 3, chồi thân bắt đầu mọc và vươn lên khỏi mặt đất, mang theo tán hoa Cây nở hoa từ tháng 4 đến tháng 5, đạt đỉnh vào giữa tháng 4 Giai đoạn quả xanh kéo dài 3 - 4 tháng sau khi thụ phấn, và đến cuối tháng 7, đầu tháng 8, quả bắt đầu chín Quả chín rộ vào tháng 8, nhưng một số cây có thể chín muộn đến tháng 10.
Hình 1.1 Cây sâm Ngọc Linh và vùng phân bố (Nguồn: http://www.botanyvn.com)
Từ tháng 10 đến tháng 12 hàng năm, sau khi mùa quả chín kết thúc, lá cây bắt đầu chuyển vàng và phần khí sinh tàn lụi Trong giai đoạn này, từ mầm thân rễ nằm sát hoặc dưới mặt đất, một chồi thân mới được hình thành Các chồi này sẽ tồn tại dưới dạng chồi ngủ trong khoảng 3 - 4 tháng mùa đông và nảy mầm vào mùa xuân năm sau, tiếp tục chu trình sinh trưởng mới.
1.1.1.3 Thành phần hoá học và tác dụng dược lý của SNL a) Thành phần hóa học
Chi Nhân sâm (Panax L.) là một nguồn dược liệu tự nhiên quý giá, được y học cổ truyền phương Đông sử dụng từ lâu đời Đến cuối năm 2012, đã có ít nhất 289 saponin được công bố trong 11 loài khác nhau thuộc chi Nhân sâm Các saponin này được phân loại thành các nhóm như protopanaxadiol, protopanaxatriol, octillol, acid oleanolic, cùng với các chuỗi C17 và các phân nhóm khác, dựa trên sự khác biệt về cấu trúc của sapogenin.
Kể từ năm 1985, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về hóa học và dược lý của cây SNL, khẳng định giá trị sử dụng của nó Các nghiên cứu đã xác định được cấu trúc protopanaxatriol oxyd II từ phần dưới mặt đất của cây SNL hoang dại, cùng với 52 hợp chất saponin, bao gồm 26 saponin đã biết và 26 saponin mới được gọi là vina-ginsenoid.
Các chất saponin dammarane là hoạt chất chính quyết định tác dụng sinh học của sâm, chiếm tỷ lệ cao trong thành phần saponin của SNL, với 50/52 saponin được phân lập Trong số đó, saponin dẫn chất của 20(S) - protopanaxadiol có 22 hợp chất, bao gồm ginsenoside - Rb1, - Rb3, - Rd; saponin dẫn chất của 20(S) - protopanaxatriol có 17 hợp chất, với ginsenoside - Re, - Rg1, notoginsenoside - R1 là các đại diện chính; và saponin có cấu trúc ocotillol gồm 11 hợp chất, trong đó majonoside - R1 và - R2 là tiêu biểu Đặc biệt, majonoside - R2 chiếm gần 50% hàm lượng saponin toàn phần từ rễ củ của SNL, trở thành hợp chất chủ yếu So với các loài sâm khác, SNL nổi bật với các hoạt chất saponin dammarane, đặc biệt là M - R2, vượt trội hơn so với Nhân sâm (P ginseng), sâm Mỹ (P quinquefolium) và Tam thất (P notoginseng).
Nhóm tác giả Nguyễn Minh Đức đã tiến hành nghiên cứu sâu về thành phần saponin trong thân rễ và rễ của SNL, trong đó họ đã phân lập và xác định cấu trúc của bảy saponin dammarane mới mang tên vina-ginsenoside-R3, -R4, -R5, -R6, -R7, -R8, và -R9 Đồng thời, nhóm cũng xác định được 6 saponin đã được biết đến, bao gồm 20-gluco-ginsenoside.
Rf, ginsenoside-Rc, notoginsenoside-R6, quinquenoside-R1, gypenoside XVII và majoroside F1 là các saponin mới được xác định thông qua phương pháp hóa học và quang phổ Vina-ginsenoside-R3 là glycoside tự nhiên đầu tiên của dammarenediol II, trong khi vina-ginsenoside-R5 và -R6 thuộc loại saponin ocotillol.
Các saponin triterpenoic, đặc biệt là MR2, Rb1 và Rg1, là nhóm chất quyết định tác dụng dược lí của loài sâm này.
SNL là một trong những loài sâm có hàm lượng saponin khung dammarane cao nhất, dao động từ 12-15%, và chứa số lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác trong chi Panax Phân tích hóa học cho thấy rễ củ SNL có tới 50 loại saponin, trong khi sâm Triều Tiên chỉ có khoảng 25 loại Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng SNL có tổng cộng 52 loại saponin, bao gồm 26 loại đã biết và 26 loại mới, được gọi là vina-ginsenoside (VG) -R1 đến -R25 cùng với 20-O-Me-G-Rh1 Với những đặc điểm nổi bật này, SNL không chỉ là loài sâm quý giá của Việt Nam mà còn có giá trị toàn cầu.
Các saponin dammarane là hoạt chất chính quyết định tác dụng sinh học của sâm Triều Tiên, chiếm tỷ lệ cao trong hợp chất saponin của SNL với 50/52 saponin phân lập được Trong số đó, saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol có 22 hợp chất, nổi bật là ginsenoside-Rb1, -Rb3, -Rd; saponin dẫn chất của protopanaxatriol gồm 17 hợp chất như ginsenoside-Re, -Rg1, notoginsenoside-R1; và saponin có cấu trúc occotillol có 11 hợp chất với majonoside-R1 và -R2 là đại diện chính SNL không chỉ chứa đủ 4 nhóm saponin như các loài sâm khác mà còn có hàm lượng cao gấp đôi, làm tăng giá trị sử dụng của nó Ngoài saponin, SNL còn chứa 17 acid amin, 20 chất khoáng vi lượng và hàm lượng tinh dầu.
Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự (2015), SNL có tác dụng tích cực lên hệ thần kinh trung ương, với liều thấp giúp kích thích thần kinh, tăng cường hoạt động vận động, trí nhớ và chống trầm cảm, trong khi liều cao có thể gây ức chế Ngoài ra, SNL còn giúp tăng sinh lực, có tác dụng sinh thích ứng, chống oxy hóa, kích thích miễn dịch và phục hồi máu Các tác dụng dược lý khác của SNL bao gồm tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa hoạt động của tim, giảm cholesterol máu, bảo vệ gan khỏi các yếu tố độc hại và chống viêm, đồng thời ức chế sự phát triển của vi khuẩn Streptococcus gây viêm họng.
Nghiên cứu trên động vật thực nghiệm cho thấy saponin trong SNL có khả năng tăng cường hoạt động thực bào, giúp bảo vệ động vật khỏi độc tính cấp của E coli, đồng thời có tác dụng chống căng thẳng và thúc đẩy khả năng chống khối u Thêm vào đó, thử nghiệm in vitro cho thấy dịch chiết methanol từ sâm Việt Nam có tác dụng bảo vệ tế bào gan trước các yếu tố gây hoại tử do tế bào khối u.
[198], saponin dạng chuyển hóa sau chế biến ở nhiệt độ cao có tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi [134]…
Cây SNL sở hữu nhiều đặc tính quý giá, có giá trị cao trong việc điều trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người Do đó, nghiên cứu trồng cây SNL và phát triển thành sản phẩm hàng hóa là một vấn đề cấp bách hiện nay.
Điều kiện tự nhiên vùng phân bố sâm Ngọc Linh
Kết quả khảo sát từ năm 1973 cho thấy cây SNL tập trung chủ yếu ở 10 xã thuộc hai huyện Đak Tô và Đak Lây (Kon Tum) cùng với các xã Trà Linh, Trà Cang, Trà Nam ở huyện Nam Trà My (Quảng Nam) Khu vực này nằm trong tọa độ 107º50’ - 108º7’ kinh độ Đông và 15º0’0’’ - 15º10’ vĩ độ Bắc, với độ cao từ 1.500 m trở lên, đặc biệt là ở độ cao 1.700 - 2.000 m.
Sâm Ngọc Linh là cây thân thảo ưa ẩm và bóng, thường mọc rải rác hoặc thành từng đám nhỏ dưới tán rừng hỗn giao giữa cây lá rộng và cây lá kim Loại sâm này thường xuất hiện ở hai bên sườn suối, nơi có độ mùn dày và bộ rễ phát triển mạnh trong tầng mùn của đất màu giàu dinh dưỡng Hệ thực vật tại vùng núi Ngọc cũng góp phần tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của sâm Ngọc Linh.
Ngọc Linh là khu vực có sự phân bố lý tưởng của các họ thực vật hỗ trợ, giúp bảo vệ cây SNL khỏi mưa bão và ánh sáng trực xạ, từ đó thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của chúng Đặc biệt, sự đa dạng về thành phần thực vật tại đây cho thấy Ngọc Linh là điểm hội tụ của nhiều luồng di trú khác nhau Hơn nữa, vùng này còn nổi bật với sự phát triển mạnh mẽ của họ Nhân sâm, với số lượng loài và cá thể phong phú.
Núi Ngọc Linh kéo dài theo hướng Tây Bắc - Đông Nam, với khí hậu đặc trưng là sự tương phản rõ rệt giữa hai mùa mưa và khô Nhiệt độ trung bình hàng năm dao động từ 18 - 20 oC, với mùa hè mát mẻ diễn ra từ tháng 5 đến tháng 10 và mùa đông lạnh từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau Tháng 12 là tháng lạnh nhất, nhiệt độ trung bình dưới 10 oC và có thể giảm xuống 2 - 4 oC Ở độ cao trên 2.000 m, nhiệt độ có thể gần 0 oC Thời điểm từ tháng 12 đến tháng 1 năm sau có nhiệt độ thấp nhất, trung bình khoảng 8 - 11 oC, trong khi tháng 4 - 5 là thời điểm có nhiệt độ cao nhất, trung bình khoảng 22 oC.
- 23 o C Nhiệt độ cao tuyệt đối không vuợt quá 30 o C [3].
Lượng mưa trung bình hàng năm dao động từ 2.500 đến 3.000 mm, với lượng mưa cao nhất xảy ra vào các tháng 6, 7 và 8, chiếm 85 - 90% tổng lượng mưa cả năm Độ ẩm trung bình năm đạt 80 - 85%, trong đó độ ẩm cao nhất thường xuất hiện từ tháng 7 đến tháng 9, có thể lên tới 89 - 94% Trong mùa mưa, độ ẩm thường xuyên gần 100% trong nhiều ngày liên tiếp Mùa khô kéo dài từ tháng 11 đến tháng 5 năm sau, với độ ẩm thấp nhất từ tháng 2 đến tháng 4 (77 - 82%) và có thể xuống dưới 70% vào tháng 5 Sương mù là hiện tượng phổ biến trong khu vực, thường xuất hiện trên các đỉnh núi hoặc dày đặc trong các thung lũng hẹp.
Các dãy núi Ngọc Linh chủ yếu được hình thành từ đá Granit và diệp thạch, với loại đất chủ yếu là đất sét xám tro hoặc xám vàng nhạt Đất ở đây có lớp mùn hữu cơ màu đen dày, với độ pH thấp dao động từ 3,8 đến 4,4 Theo phân loại Việt Nam, đây được xem là đất mùn vàng đỏ trên núi cao, trong khi theo phân loại FAO-UNESCO-WRB, nó được xác định là đất xám giàu mùn (humic acrisol).
QUẦN XÃ VI SINH VẬT ĐẤT
Quần xã vi sinh vật đất
Vi sinh vật đất đóng vai trò thiết yếu trong hệ sinh thái, tạo mối quan hệ tương hỗ với thảm thực vật và duy trì sự cân bằng sinh thái Sự phân bố của các loài vi sinh vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố như điều kiện dinh dưỡng, độ pH, mức độ thoáng khí và thảm thực vật Đặc biệt, vùng rễ là nơi diễn ra sự tương tác mạnh mẽ giữa thực vật và vi sinh vật, ảnh hưởng trực tiếp đến tình trạng bệnh và sự phát triển của cây trồng Các loại nấm và vi khuẩn trong vùng rễ cung cấp phospho và nitơ, trong khi vi sinh vật thúc đẩy tăng trưởng (PGPR) giúp cây chống lại mầm bệnh và điều hòa miễn dịch.
[192] Với mỗi loại đất khác nhau thì khu hệ VSV ở đó cũng có những đặc điểm đặc trưng.
Nghiên cứu về hệ vi sinh vật (VSV) trong các loại đất trên thế giới đã cho thấy sự đa dạng phong phú Cụ thể, nghiên cứu của Borneman và cộng sự tại Wisconsin về vi sinh đất nông nghiệp cho thấy trong số 124 dòng DNA được giải trình tự, 98,4% là vi khuẩn, chủ yếu thuộc nhóm Proteobacteria với tỷ lệ 16,1%.
Nhóm vi khuẩn Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides chiếm 21,8% trong hệ vi sinh vật đất trồng cây, với đặc điểm là nhóm Gram (-) có hàm lượng G+C thấp Điều này cho thấy vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái đất Để quản lý đất đai hiệu quả, Buckley & Schmidt đã tiến hành đánh giá cấu trúc quần xã vi khuẩn của bảy nhóm vi khuẩn phổ biến nhất trong đất, bao gồm Alpha và Beta Proteobacteria, Actinobacteria, Cytophagales, và Planctomycetes trong hơn 2 năm.
Nghiên cứu về Verrucomicrobia trong các mẫu đất từ các cánh đồng trồng trọt, cánh đồng bỏ hoang và cánh đồng không có lịch sử canh tác cho thấy hệ vi khuẩn đất có thể thay đổi đáng kể theo thời gian Đặc biệt, nghiên cứu của nhóm tác giả Sugiyama về vi khuẩn vùng rễ cây đậu tương đã chỉ ra sự biến động của các quần thể vi khuẩn trong quá trình sinh trưởng của cây, với các nhóm vi khuẩn chính được xác định.
Sự giảm sút của Proteobacteria, cùng với sự gia tăng của Acidobacteria và Firmicutes, đã dẫn đến sự gia tăng đáng kể số lượng vi khuẩn PGPR vùng rễ như Bacillus, Bradyrhizobium và Rhizobium Nghiên cứu về vi sinh vật đất tại vùng trồng táo chính ở vịnh Bohai, Trung Quốc, chỉ ra rằng sự mất cân bằng hệ vi sinh vật vùng rễ là nguyên nhân gây bệnh cho cây táo, đặc biệt là ở các cây táo lâu năm và cây táo tái canh, cho thấy sự thay đổi quần thể nấm trong khu vực này.
Sự gia tăng bệnh do Verticillium và vi khuẩn Xanthomonadaceae đã dẫn đến sự giảm số lượng vi khuẩn có lợi như Pseudomonas và Bacillus ở cây tái canh Đồng thời, số lượng vi khuẩn đối kháng Arthrobacter và nấm Chaetomium cũng gia tăng, có thể là phản ứng trước sự gia tăng mầm bệnh.
Tại Việt Nam, nghiên cứu về các nhóm vi sinh vật (VSV) như vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm được thực hiện trên nhiều loại đất khác nhau, bao gồm đất trồng lúa, đất trồng mía, đất rừng, đất gò đồi, đất khai mỏ và dưới tán rừng.
Quần xã vi sinh vật đất trồng Nhân sâm ( Panax L.)
Hàn Quốc và Trung Quốc hiện là hai nhà sản xuất Nhân sâm hàng đầu thế giới, với thời gian canh tác cần thiết để rễ củ sâm đạt trưởng thành thường từ 4 đến 6 năm Việc áp dụng biện pháp độc canh lâu dài trong sản xuất Nhân sâm có thể gây ra sự thay đổi trong quần xã vi sinh vật (VSV) ở đất trồng, dẫn đến việc Nhân sâm dễ bị bệnh sau 4 năm canh tác, gây tổn thất năng suất từ 30% đến 60% Do đó, hệ VSV, chủ yếu là vi khuẩn trong đất trồng Nhân sâm, đóng vai trò quan trọng trong các quy trình như phân hủy, khoáng hóa, thoáng khí và tái chế.
Nghiên cứu quần xã vi khuẩn trong vùng rễ Nhân sâm trồng tại Okcheon cho thấy ngành Actinobacteria chiếm ưu thế, tiếp theo là Proteobacteria, Spingomonadales và Rhizobiales Quần xã vi khuẩn này thường biến động và bị ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của cây trồng Từ đất vùng rễ sâm trồng 1 - 3 năm tại Okcheon, nhóm nghiên cứu đã phân lập được 143 chủng thuộc 15 nhóm vi khuẩn khác nhau, trong đó chủ yếu thuộc ngành Firmicutes, chiếm 58%.
Bacillus là chi chiếm ưu thế trong tất cả các mẫu nghiên cứu, không phụ thuộc vào số năm trồng Trong số 30 chủng phân lập được lựa chọn, các kết quả cho thấy một số chủng như B subtilis và B amyloliquefaciens có ảnh hưởng tích cực đối với sự phát triển của cây trồng.
B velezensis và B licheniformis) có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng thực vật như tạo chất tiết (enzyme) phân hủy thành tế bào, sinh tổng hợp IAA, vận chuyển sắt, hòa tan phosphate và ức chế các tác nhân gây bệnh trong đất [93].
Nguyen và cộng sự đã tiến hành phân tích các mẫu đất trồng Nhân sâm tại miền Bắc Hàn Quốc, phát hiện rằng các quần thể vi khuẩn chủ yếu thuộc các nhóm Acidobacteria, Alphaproteobacteria và Deltaproteobacteria.
Nghiên cứu về vi khuẩn trong đất trồng Nhân sâm cho thấy Gammaproteobacteria và Sphingobacteria có sự phân bố đáng chú ý Kết quả phân tích cũng chỉ ra rằng các chỉ số pH, phospho hữu dụng và Ca + trao đổi có mối tương quan chặt chẽ với các nhóm vi khuẩn trong đất Một nghiên cứu khác tại Jilin, Trung Quốc, đã phát hiện sự đa dạng của các nhóm vi khuẩn Acidobacteria trong khu vực trồng Nhân sâm.
Proteobacteria, Bacillus và Verrucomicrobia chiếm ưu thế [142, 222].
Việc trồng Nhân sâm gặp khó khăn do các vấn đề tái canh, chủ yếu do sự thay đổi của quần xã vi sinh vật (VSV) trong đất Sự nhiễm các VSV đối kháng có thể làm giảm hiệu quả tái canh Nghiên cứu cho thấy, trong đất vùng rễ của cây Nhân sâm trưởng thành, mức độ đa dạng của vi khuẩn giảm, trong khi mức độ đa dạng của nấm lại tăng lên theo độ tuổi khác nhau.
Vi khuẩn thuộc các chi Luteolibacter, Luteibacter, Sphingomonas và các họ Cytophagaceae, Sphingomonadaceae được phát hiện với mật độ thấp Trong khi đó, mật độ vi khuẩn Brevundimonas, Enterobacteriaceae, Pandoraea, Cantharellales và Dendryphion trong đất trồng cây Nhân sâm trưởng thành có xu hướng tăng so với đất trồng cây giống 2 tuổi.
Nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn đất vùng rễ của các loài trong chi Panax, như P notoginseng và P quinquefolius, đã được thực hiện bởi Miao và cộng sự Họ đã phân tích trình tự DNA của quần xã vi khuẩn vùng rễ tam thất từ 3 vườn trồng có phương pháp canh tác tương tự tại Wenshan Kết quả cho thấy số lượng vi khuẩn giảm ở các mẫu đất trồng liên tục, trong khi sự đa dạng vi khuẩn ở cây khỏe mạnh cao hơn so với cây bị bệnh.
[150] Các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế ở mức độ ngành là Proteobacteria,
Cyanobacteria, Actinobacteria và Acidobacteria, ở mức độ chi là Pseudomonas, Rhodoplanes, Candidatus, Solibacter và Streptomyces, trong đó chiếm tỷ lệ lớn là các chi gây bệnh như Erwinia, Stenotrophomonas,
Pseudomonas và Sphingobium có thể gây bệnh cho cây trong điều kiện canh tác liên tục Nghiên cứu của Dong và cộng sự về sâm Mỹ (Panax quynquefolius L.) tại Huairou, Bắc Kinh, cho thấy sau 3 năm canh tác, số lượng vi khuẩn trong 6 mẫu đất trồng sâm giảm đáng kể Đối với sâm Việt Nam, hiện chưa có nghiên cứu nào đánh giá đa dạng quần xã vi khuẩn trong đất trồng, chỉ có một số nghiên cứu phát hiện loài mới như Paracoccus panacisoli sp nov và Paenibacillus panaciterrae sp nov.
CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI KHUẨN
Các phương pháp dựa trên nuôi cấy
Phương pháp kinh điển trong nghiên cứu đa dạng vi khuẩn bao gồm việc phân biệt các loại vi khuẩn dựa trên các đặc điểm sinh học cơ bản như hình thái, sinh lý và trao đổi chất Các đặc điểm này bao gồm khả năng sử dụng các nguồn cacbon, nitơ và năng lượng khác nhau trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn.
1.3.1.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc (định lượng vi khuẩn)
Phương pháp truyền thống để định lượng vi khuẩn trên các môi trường chọn lọc có ưu điểm là đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm chi phí Tuy nhiên, phương pháp này gặp khó khăn trong việc tách vi khuẩn hoặc bào tử từ đất và màng sinh học, cũng như trong việc chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy phù hợp Đặc biệt, nhiều loài vi khuẩn vẫn chưa thể nuôi cấy bằng các kỹ thuật hiện có, dẫn đến việc phương pháp nuôi cấy không phản ánh đầy đủ sự đa dạng của quần xã vi khuẩn.
1.3.1.2 Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon đơn (SCSU)
Hệ thống phân loại vi khuẩn dựa trên nguồn cacbon đơn, như API và Biolog, được giới thiệu bởi Garland & Mills, nhằm định danh vi khuẩn thuần chủng đến cấp độ loài dựa vào đặc điểm trao đổi chất Tuy nhiên, phương pháp này có hạn chế là không phát hiện được các vi khuẩn mọc chậm trong quần xã vi khuẩn, do sự hiện diện của cả vi khuẩn sinh trưởng nhanh và chậm Ngoài ra, hầu hết các bộ kit thương mại chỉ được thiết kế để xác định vi khuẩn gây bệnh ở người, trong khi chỉ có một số nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa cơ chất cho các chủng phân lập trong môi trường tự nhiên.
Phương pháp SCSU đã chứng minh hiệu quả trong việc đánh giá sự đa dạng của quần xã vi khuẩn ở nhiều môi trường khác nhau, bao gồm khu vực ô nhiễm, vùng rễ thực vật, đất Bắc Cực, đất xử lý bằng thuốc diệt cỏ, và mẫu phân ủ Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là dễ sử dụng và hỗ trợ xây dựng cơ sở dữ liệu về đặc điểm trao đổi chất của quần xã vi khuẩn.
Phương pháp này có hạn chế là chỉ đánh giá phần quần xã vi khuẩn có thể nuôi cấy, chủ yếu phù hợp với các vi khuẩn phát triển nhanh, nhạy cảm với mật độ cấy Nó phản ánh sự đa dạng trao đổi chất tiềm năng mà không đại diện cho toàn bộ quần xã Hơn nữa, các nguồn carbon được thử nghiệm có thể không phản ánh đầy đủ các vi khuẩn có mặt trong đất, dẫn đến việc thông tin thu được có thể không hoàn toàn hữu ích.
1.3.1.3 Phân tích acid béo phospholipid/acid béo methyl ester
Các biomarker lipid như acid béo phospholipid (PLFA) và acid béo methyl ester (FAME) thường được áp dụng để đánh giá cấu trúc quần xã vi khuẩn trong các môi trường tự nhiên như đất, nước, trầm tích và sinh khối.
PLFA là thành phần quan trọng của màng tế bào vi khuẩn và vi sinh vật nhân thực, được coi là chỉ tiêu đặc trưng cho quần xã vi khuẩn sống trong đất do tính dễ phân hủy sau khi tế bào chết Các PLFA thường có chiều dài chuỗi từ 14 đến 20 nguyên tử C, đặc trưng cho vi khuẩn và nấm.
Phân tích FAME bao gồm tất cả các acid béo có thể xà phòng hóa trong mẫu, nhưng phương pháp này có nhược điểm là không đặc trưng cho quần xã vi khuẩn do các methyl ester xuất phát từ tế bào sống, tế bào chết và các sinh vật khác trong môi trường thử nghiệm Hơn nữa, phân tích FAME có thể bỏ sót những loài chiếm số ít trong quần thể Thành phần acid béo của tế bào cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, dinh dưỡng và sự hiện diện của các sinh vật khác, gây nhiễu trong quá trình phân tích.
1.3.1.4 Đánh giá hoạt tính sinh học
Vi khuẩn trong đất đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải xác hữu cơ, tạo ra CO2 và các hợp chất vô cơ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng Chúng thực hiện việc cố định nitơ từ không khí thành các hợp chất dễ sử dụng, đồng thời phân giải các chất khó tan như P, K, S, góp phần vào các vòng tuần hoàn tự nhiên Ngoài ra, vi khuẩn còn tham gia vào quá trình hình thành chất mùn và được ứng dụng trong công nghiệp tuyển khoáng để hoà tan kim loại quý từ quặng nghèo Hoạt động của vi khuẩn đất không chỉ định hình đất mà còn tăng cường độ phì nhiêu, đặc biệt là các vi khuẩn cố định nitơ và chuyển hoá các nguyên tố cần thiết cho cây trồng Việc phân lập và tìm kiếm các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh học giúp đánh giá đa dạng chuyển hóa của các nhóm vi khuẩn trong đất.
Các phương pháp sinh học phân tử
1.3.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử cơ bản
Mặc dù vi khuẩn tồn tại phổ biến trong đất, nhưng hơn 99% trong số chúng không thể nuôi cấy bằng kỹ thuật truyền thống Chỉ khoảng 1% vi khuẩn có thể nuôi cấy lại không phản ánh đầy đủ sự đa dạng của quần xã vi khuẩn trong đất Những vi khuẩn không thể nuôi cấy thường có tiềm năng độc đáo, như khả năng phân hủy rác thải hoặc tổng hợp hợp chất có giá trị như thuốc và kháng sinh Gần đây, các nghiên cứu về sự đa dạng của vi khuẩn đã chuyển sang phương pháp không nuôi cấy, bao gồm việc tách chiết DNA từ mẫu đất và phân tích trình tự gen 16S rRNA để xây dựng dữ liệu về đa dạng sinh học Nhiều phương pháp nghiên cứu sự đa dạng vi khuẩn ở cấp độ phân tử đã được phát triển, như được trình bày trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1 Ưu nhược điểm của một số phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng vi khuẩn đất [72]
Phương pháp Ưu điểm Hạn chế
-Không bị ảnh hưởng bởi phản ứng PCR;
-Bao gồm tất cả các DNA tách chiết;
-Phân tích được cả các thành phần hiếm trong quần xã.
- Yêu cầu một lượng lớn DNA;
- Phụ thuộc chất chiết và hiệu quả tách chiết;
Lai và tái liên kết acid nucleic
- Tổng số DNA được tách chiết;
- Số trình tự trong bản sao
-Không bị ảnh hưởng bởi quá trình PCR;
-Có thể nghiên cứu DNA hoặc RNA;
-Có thể phân tích in situ cao mới phát hiện được;
- Phụ thuộc chất chiết và hiệu quả tách chiết.
DNA chip và lai DNA
- Giống như lai acid nucleic;
- Có thể phân tích được hàng ngàn gen;
- Tăng tính đặc hiệu nếu sử dụng gen hoặc mảnh DNA.
- Chỉ phát hiện được những loài phong phú nhất;
- Cần phải nuôi cấy sinh vật;
- Chỉ chính xác trong hệ thống đa dạng thấp. Điện di gel - Có thể phân tích được - Sai số do PCR; gradient biến tính
(DGGE/TGGE) đồng thời số lượng lớn mẫu;
- Tin cậy, tái sản xuất và nhanh.
- Phụ thuộc chất chiết và hiệu quả tách chiết;
Cách xử lý mẫu có thể ảnh hưởng đáng kể đến quần xã sinh vật, ví dụ như quần xã có thể bị biến đổi nếu lưu mẫu quá lâu trước khi tiến hành tách chiết.
- Một band có thể đại diện cho nhiều hơn một loài (đồng di chuyển)
- Chỉ phát hiện loài ưu thế. Đa hình cấu tạo sợi đơn (SSCP)
Không cần kẹp GC trong
- Một số sợi đơn DNA có thể hình thành nhiều hơn trình tự mồi PCR như phương pháp DGGE; một cấu trúc ổn định.
- Không cần gradient. Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn
Phát hiện được những thay đổi cấu trúc trong quần xã VSV.
- Sợi khuôn thường phức tạp.
(RFLP) Đa hình chiều - Sợi khuôn đơn giản hơn so - Phụ thuộc chất chiết và dài đoạn cắt giới hạn đích
(T-RFLP) với phương pháp RFLP;
- Có thể được chạy tự động được một số lượng lớn mẫu;
- Khả năng tái sản xuất cao; hiệu quả tách chiết;
- Loại DNA polymerase có thể làm tăng sự thay đổi;
- Có thể so sánh sự khác biệt giữa các quần xã VSV.
- Việc lựa chọn các enzyme giới hạn sẽ ảnh hưởng tới kết quả dấu vân tay của quần xã.
Hồ sơ quần xã có độ tin cậy cao
- Đòi hỏi một lượng lớn DNA (đối với phương pháp tích các đoạn cắt giới hạn gen
- Sai số do PCR. khuếch đại
Metagenomics là phương pháp hiệu quả để phân tích trình tự genome của toàn bộ vi khuẩn trong quần xã, giúp đánh giá đa dạng loài và khai thác enzyme mới từ vi khuẩn không nuôi cấy trong môi trường tự nhiên Sự phát triển của thiết bị giải trình tự gen thế hệ mới và các công cụ tin sinh học đã biến metagenomics thành một cách tiếp cận hữu ích để tìm kiếm gen mới và nghiên cứu đa dạng vi khuẩn mà không cần nuôi cấy.
Hình 1.2 Sơ đồ tổng quát về phân tích và các ứng dụng của metagenomics [153]
Metagenomics là phương pháp phân tích đa dạng virus, vi sinh vật thông qua ba bước chính: tách chiết nucleic acid từ mẫu, thiết lập thư viện metagenome hoặc giải trình tự DNA metagenome, và sàng lọc gen dựa vào ngân hàng gene hoặc dữ liệu giải trình tự Trong khi nghiên cứu hệ gen, các nhà khoa học có thể giải trình tự toàn bộ genome của sinh vật và khai thác các gen mã hóa protein và enzyme quan tâm Khác với genomics, metagenomics không chỉ tập trung vào từng hệ gen riêng lẻ mà còn nghiên cứu toàn bộ đa hệ gen của quần xã vi khuẩn trong một hệ sinh thái cụ thể Có hai hướng tiếp cận chính trong nghiên cứu metagenomics: phân lập gen qua thư viện DNA đa hệ gen và khai thác trình tự DNA từ dữ liệu giải trình tự đa hệ gen.
Phân lập gen thông qua việc thiết lập ngân hàng DNA đa hệ gen tương tự như việc tạo thư viện genome, trong đó DNA metagenome được cắt nhỏ bằng enzyme hạn chế thành các đoạn có kích thước phù hợp để chứa toàn bộ gen Những đoạn DNA này sau đó được gắn vào vector thích hợp và chuyển vào chủng vi sinh vật chủ Với số lượng dòng đủ lớn, thư viện có thể bao gồm toàn bộ các gen của metagenome Các dòng biểu hiện protein ngoại lai sẽ được sàng lọc dựa trên hoạt tính, chẳng hạn như sản xuất vitamin, tính kháng kháng sinh, hoặc enzyme, trên môi trường có cơ chất đặc hiệu Cuối cùng, các dòng mang gen mã hóa cho tính trạng mong muốn sẽ được lựa chọn và giải trình tự để thu được trình tự.
Việc phân lập gen từ thư viện DNA metagenome trong môi trường có cơ chất thường tốn nhiều thời gian và công sức do khối lượng lớn dòng thư viện cần sàng lọc Điều này yêu cầu thư viện phải có số lượng dòng lớn và chất lượng cao Hơn nữa, khả năng biểu hiện hoạt tính của gen nguyên vẹn phụ thuộc vào sự tương thích và vị trí của nó với promoter trong vector Tuy nhiên, nhờ sự phát triển của công nghệ, việc giải trình tự toàn bộ hệ gen hiện nay đã trở nên khả thi hơn, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí.
(2) Khai thác và phân lập gen từ dữ liệu metagenome:
Hiện nay, các thiết bị giải trình tự gen hiện đại như hệ thống HiSeq của Ilumina có khả năng tạo ra đến 3 tỷ trình tự với tổng khối lượng dữ liệu lên tới 300 Gbp Sử dụng phần mềm chuyên dụng và công cụ tin sinh học, các trình tự ngắn được sắp xếp thành các contig, từ đó giúp xác định chức năng gen trong metagenome Để phân tích trình tự DNA, có nhiều công cụ và phần mềm miễn phí có sẵn trực tuyến Sau khi có contig từ metagenome, các cặp mồi sẽ được thiết kế để phân lập các gen mong muốn Phương pháp này đã được áp dụng để nghiên cứu đa dạng và sinh thái quần xã vi khuẩn trong nhiều môi trường khác nhau như đại dương, đất, và các quần xã VSV liên quan đến nhiều cơ thể sống Việc khai thác các gen chức năng trong hệ gen mở ra cơ hội phát triển ứng dụng trong ngành dược phẩm, nhiên liệu sinh học, công nghệ sinh học và nông nghiệp.
* Ứng dụng metagenomics trong nghiên cứu đa dạng vi khuẩn
Metagenomics đã được áp dụng rộng rãi và thành công trên toàn cầu trong hơn 20 năm qua, đặc biệt trong sinh thái học vi sinh vật (VSV) Công nghệ này cho phép nghiên cứu chi tiết các quần xã VSV, bao gồm cả những chủng vi khuẩn không thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm Nhờ vào khả năng này, metagenomics có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như khoa học trái đất, khoa học sự sống, y sinh, năng lượng, xử lý môi trường, công nghệ sinh học, nông nghiệp và bảo vệ sinh học.
Metagenomics đầu tiên được giải trình tự toàn bộ và công bố vào năm
Kể từ năm 2004, với kích thước 76 Mbp, metagenomics đã được áp dụng rộng rãi để nghiên cứu sự đa dạng của vi sinh vật (VSV) và khai thác các gen mới từ nhiều mẫu môi trường khác nhau, bao gồm môi trường biển, ruột người, dạ cỏ bò, và phân động vật Ngoài ra, metagenomics còn được sử dụng để khám phá các môi trường cực trị như suối nước nóng, hồ nước mặn lưu huỳnh, vùng băng giá, và đất vùng cực.
Việc ứng dụng metagenomics trong nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn đất đã được nhiều tác giả ghi nhận, với các nghiên cứu tiêu biểu như hệ vi khuẩn vùng rễ cây Ramonda serbica và Ramonda nathaliae tại núi Jelašnička, Serbia; đất vùng rễ lúa ở Kerala, Ấn Độ; và đất trồng nho tại Chilê Tại Việt Nam, gần đây cũng đã có một số nghiên cứu về metagenome của vi sinh vật đất ở các loại cây trồng, chẳng hạn như đánh giá tính đa dạng của hệ vi sinh vật vùng rễ cây Dó bầu tại Sơn Dương (Tuyên Quang), Nha Trang (Khánh Hòa) và Phú Quốc (Kiên Giang), cũng như nghiên cứu hệ gen chức năng của vi sinh vật vùng rễ cây thuốc có củ (nghệ) và cây công nghiệp (cà phê) nhằm nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng.
* Ứng dụng metagenomics trong nghiên cứu quần xã vi khuẩn đất trồng sâm:
Nhóm tác giả Nguyen và cộng sự đã ứng dụng kĩ thuật pyrosequencing với thiết bị Roche/454 GS FLX Titanium để đánh giá đa dạng và cấu trúc quần xã vi khuẩn trong đất trồng Nhân sâm 2,4,6 năm tuổi tại Hàn Quốc Kết quả cho thấy mức độ đa dạng vi khuẩn giảm dần qua các năm canh tác, với sự thay đổi thành phần vi khuẩn theo thời gian và trạng thái của cây sâm Các ngành vi khuẩn chủ yếu trong 30 mẫu đất nghiên cứu bao gồm Proteobacteria (30,16%), Acidobacteria (29,16%), Chloroflexi (18,15%), Gemmatimonadetes (5,59%), Actinobacteria (2,28%) và Verrucomicrobia.
Planctomycetes (1,40%) Các ngành khác như Chlorobi, Firmicutes, TM7, WS3 và AD3 chiếm > 1%, các ngành đã được phát hiện còn lại chiếm